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    制何首烏、巴戟天及其配伍對ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響

    2020-10-21 09:30:14李燕玲林國偉梁偉海劉曉俊
    廣州醫(yī)藥 2020年5期
    關(guān)鍵詞:活率巴戟天何首烏

    李燕玲 林國偉 梁偉海 劉曉俊

    廣州市第一人民醫(yī)院 (廣州 510180)

    卒中后認(rèn)知功能障礙(post-stroke cognitive impairment, PSCI)是指卒中后6個月內(nèi),出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的綜合征。PSCI作為卒中后常見的并發(fā)癥,給個人、家庭及社會都造成了嚴(yán)重的影響。西醫(yī)認(rèn)為PSCI與動脈硬化密切相關(guān)[1],而動脈硬化又多責(zé)之氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)對血管的損害。中醫(yī)認(rèn)為PSCI與氣、血、痰、瘀、郁等有關(guān),由腦髓空虛、精氣血不足、氣滯血瘀、痰濁阻竅、陰陽失調(diào)等所致,治療上多遵補(bǔ)腎填精、理氣化痰、益智醒腦、活血補(bǔ)血等法[2]。全國名老中醫(yī)劉茂才教授根據(jù)上述理論及豐富的臨床經(jīng)驗(yàn),選用紫河車、巴戟天、制何首烏、黃芪、半夏、當(dāng)歸等中藥組成癡復(fù)康方,其中又以制何首烏、巴戟天等取補(bǔ)腎填精之妙。大量的臨床研究表明,癡復(fù)康能有效增加PSCI患者的大腦血流量、改善腦循環(huán),促進(jìn)腦細(xì)胞恢復(fù),從而改善癡呆癥狀[3]。癡復(fù)康選用制何首烏、巴戟天以補(bǔ)腎填精法治療PSCI,故筆者特選制何首烏、巴戟天及二者配伍,從其對氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷的影響,以窺探補(bǔ)腎填精法治療PSCI的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)原理,以示臨床。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞 HUVEC

    1.2 藥材

    制何首烏,巴戟天(廣州市藥材公司中藥飲片廠,批號分別YPA8C0001,YPA8G0002)

    1.3 試劑

    DMEM培養(yǎng)基(HyClone,批號SH30809.01B),胎牛血清(Gibco,批號1027-106),胰蛋白酶,PBS(博士德,批號PYG14190),氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL),CCK8試劑盒(碧云天),trypsin-EDTA溶液(BIOSHARP,批號WH0518),雙抗(青霉素/鏈霉素原液)(TBD,批號PS2004HY),Propidium Iodide/碘化丙啶(碧云天,批號ST512),RNase A酶(SIGMA,批號R4875),Annexin V-APC /7AAD kit(聯(lián)科生物,批號4224750),高純總RNA快速提取試劑盒(BIOTEKE,批號RP1201),HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(Vazyme,批號R223-01),HieffTMqPCR SYBR? Green Master Mix (LoWRox Plus)(翊圣生物,批號11202ES08),DL 2000 DNA marker(TAKARA,批號3427B(Ax2)),瓊脂糖(BIOWEST,批號G10)。

    1.4 儀器

    SW-CJ-2F型凈化工作臺(蘇州凈化有限公司),水套式二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo),普通光學(xué)顯微鏡(尼康),多功能酶標(biāo)儀(Thermo),水平離心機(jī)(湖南湘義離心機(jī)儀器有限公司),渦旋混勻器(其林貝爾儀器制造有限公司),純水機(jī)(廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司),冰箱(青島海爾股份有限公司), 流式分析儀(愛森生物有限公司),熒光定量PCR儀(博日公司),Tanon-1600凝膠成像系統(tǒng)(天能公司),JY200C電泳儀(君意公司),超微量核算分析儀Nano-200(杭州奧盛)。

    1.5 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC增殖和相對活率的影響

    1.5.1 分組與給藥 實(shí)驗(yàn)分為8組,每組6個平行樣:空白對照組(正常培養(yǎng)的HUVEC);模型組(正常培養(yǎng)的HUVEC,加入80 μg/mL ox-LDL[4]誘導(dǎo)),制何首烏低、中、高劑量組(模型組中分別加入不同濃度5、10、20 mg/mL的制何首烏水煎煮物)[5-6],巴戟天低、中、高劑量組(模型組中分別加入不同濃度5、10、20 mg/mL的巴戟天煎煮物)[7]。

    1.5.2 步驟 在96孔板中接種2 000個HUVEC懸液(100 μL/孔)。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h(37 ℃,5% CO2),棄上清,用PBS緩沖液洗2次,模型組加入含80 μg/mL ox-LDL的DMEM培養(yǎng)基,樣品組加入含不同濃度的制何首烏,巴戟天,制何首烏+巴戟天的DMEM培養(yǎng)基。樣品干預(yù)48 h后,向每孔加入10 μL CCK8溶液(注意不要在孔中生成氣泡,它們會影響OD值的讀數(shù))。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育0.5~4 h。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。

    1.6 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC凋亡的影響

    1.6.1 分組與給藥 實(shí)驗(yàn)分為5組,每組6個平行樣:空白對照組(正常培養(yǎng)的HUVEC);模型組(正常培養(yǎng)的HUVEC,加入80 μg/mL ox-LDL誘導(dǎo)),制何首烏組(模型組中加入10 mg/mL的制何首烏水煎煮物,即以上細(xì)胞相對活率實(shí)驗(yàn)測得的最佳制何首烏濃度),巴戟天組(模型組中加入10 mg/mL的巴戟天煎煮物,即以上細(xì)胞相對活率實(shí)驗(yàn)測得的最佳巴戟天濃度),制何首烏巴戟天配伍組(模型組中加入10 mg/mL的制何首烏,10 mg/mL巴戟天水煎煮物)。

    1.6.2 步驟 細(xì)胞消化,取藥物處理完成后的細(xì)胞,消化收集細(xì)胞,PBS洗一次,再用1×Binding Buffer洗一次。制備細(xì)胞懸液,用1×Binding Buffer重懸細(xì)胞,并計數(shù)。孵育染料,每個樣品中加入100 μL 1×Binding Buffer,確保每管的細(xì)胞數(shù)為1×105~1×106個,加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7AAD,輕柔渦旋混勻后室溫避光孵育15 min。無需洗滌,每管加入485 μL預(yù)冷 1×Binding Buffer重懸混合。送流式細(xì)胞儀檢測,F(xiàn)lowjo分析數(shù)據(jù)。

    1.6.3 不同藥物對ox-LDL誘導(dǎo)下HUVEC細(xì)胞周期的影響

    1.6.4 分組與給藥 同1.6.1。

    1.6.5 步驟 細(xì)胞消化,取細(xì)胞生長狀況良好,密度適中的細(xì)胞,在超凈臺中消化收集細(xì)胞,棄上清,用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞兩次。細(xì)胞固定,加入預(yù)冷70%乙醇重懸,于4 ℃固定過夜,或-20 ℃長期固定。細(xì)胞染色,離心收集細(xì)胞,1 mL PBS洗細(xì)胞一次,加入500 μL PBS [含5 μg/mL碘化丙錠(PI)],100 μg/mL RNaseA,0.2%Triton X-100)4 ℃避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀分析,以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測,計數(shù)1×105個細(xì)胞以上。數(shù)據(jù)分析,結(jié)果用細(xì)胞周期擬合軟件Flowjo分析。

    1.7 qPCR法鑒定ox-LDL誘導(dǎo)下HUVEC中Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表達(dá)量

    1.7.1 分組與給藥同1.6.1。

    1.7.2 步驟 根據(jù)表1進(jìn)行設(shè)計引物,根據(jù)試劑說明書提取總RNA,收集各組細(xì)胞沉淀,準(zhǔn)備PCR反應(yīng)管,依次在管中加入20 μL反應(yīng)體系,并于 qPCR儀上反應(yīng)。

    表1 引物設(shè)計

    1.8 統(tǒng)計分析

    2 結(jié) 果

    2.1 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞增殖和相對活率的影響

    與空白組比較,制何首烏高劑量組的細(xì)胞增殖OD值下降(P<0.000 1),巴戟天高劑量組的細(xì)胞增殖OD值下降(P<0.000 1),以上藥物劑量具有細(xì)胞毒性;與空白組比較,制何首烏低劑量組細(xì)胞增殖OD值無下降(P=0.305),制何首烏中劑量組細(xì)胞增殖OD值上升(P<0.000 1)、巴戟天低劑量組細(xì)胞增殖OD值上升(P<0.000 1),巴戟天中劑量組細(xì)胞增殖OD值上升(P<0.000 1),說明無細(xì)胞毒性。與空白組比較,模型組細(xì)胞相對活率下降(P<0.000 1),細(xì)胞損傷模型制備成功。與模型組比較,制何首烏低劑量組細(xì)胞相對活率增高(P=0.001),制何首烏中劑量組細(xì)胞相對活率增高(P<0.000 1)、巴戟天低劑量組細(xì)胞相對活率增高(P<0.000 1),巴戟天中劑量組細(xì)胞相對活率增高(P<0.000 1),巴戟天高劑量組細(xì)胞相對活率增高(P<0.000 1),其中10 mg/mL制何首烏、10 mg/mL巴戟天細(xì)胞活率最好。見表2。

    表2 制何首烏、巴戟天對HUVECs細(xì)胞 增殖和相對活率的影響

    2.2 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo)下HUVEC細(xì)胞凋亡的影響

    與空白組相比,模型組的凋亡率增高(P<0.000 1),表明ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC凋亡,模型制備成功。與模型組比較,制何首烏組的凋亡率降低(P<0.000 1),巴戟天組的凋亡率降低(P<0.000 1),制何首烏巴戟天配伍組的凋亡率降低(P<0.000 1),說明制何首烏、巴戟天、制何首烏巴戟天配伍均有抑制ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞凋亡作用。與制何首烏組比較,巴戟天組凋亡率降低(P<0.000 1),制何首烏巴戟天配伍組凋亡率降低(P<0.000 1);與巴戟天組比較,制何首烏巴戟天配伍組凋亡率無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.260),說明巴戟天抑制ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞凋亡作用強(qiáng)于制何首烏,制何首烏巴戟天配伍抑制ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞凋亡作用強(qiáng)于單味中藥制何首烏。見圖1、表3。

    圖1 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡的影響注:A. 為空白組;B. 為模型組;C. 為制何首烏組;D. 為巴戟天組;E. 為制何首烏巴戟天配伍組

    表3 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡的影響 (n=6)

    續(xù)表

    2.3 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞周期的影響

    與空白組相比,模型組的(S+G2)%期降低(P<0.000 1),表明ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC損傷,模型制備成功。與模型組比較,制何首烏組的(S+G2)%期增高(P=0.014),巴戟天組的(S+G2)%期增高(P=0.002),制何首烏巴戟天配伍組的(S+G2)%期均增高(P<0.000 1),說明制何首烏、巴戟天、制何首烏巴戟天配伍均有抑制ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC損傷作用。與制何首烏組比較,巴戟天的(S+G2)%期無差異(P=0.441),說明制何首烏、巴戟天抑制ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC損傷的作用相似。與制何首烏組比較,制何首烏巴戟天配伍組的(S+G2)%期增高(P<0.000 1),與巴戟天組比較,制何首烏巴戟天配伍組的(S+G2)%期增高(P<0.000 1),說明何首烏巴戟天配伍抑制ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC損傷作用強(qiáng)于單味中藥制何首烏、巴戟天。見表4、圖2。

    圖2 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞周期的影響注:A. 為空白組;B. 為模型組;C. 為制何首烏組;D. 為巴戟天組;E. 為制何首烏巴戟天配伍組

    表4 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞周期的影響 (n=6)

    2.4 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs中NFκB mRNA表達(dá)的影響

    與空白組相比,模型組的NFκB mRNA的表達(dá)量高于空白組(P<0.000 1),模型制備成功。與模型組相比,制何首烏組的NFκB mRNA的表達(dá)量下降(P<0.000 1),巴戟天組的NFκB mRNA的表達(dá)量下降(P<0.000 1),制何首烏巴戟天配伍組的NFκB mRNA的表達(dá)量下降(P<0.000 1)。與制何首烏組比較,巴戟天組的NFκB mRNA表達(dá)量下降(P<0.000 1),說明制何首烏抑制ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs中NFκB mRNA表達(dá)的作用強(qiáng)于巴戟天。與制何首烏組比較,制何首烏巴戟天配伍組的NFκB mRNA表達(dá)量下降(P<0.000 1);與巴戟天組比較,制何首烏巴戟天配伍組的NFκB mRNA表達(dá)量下降(P<0.000 1),說明制何首烏巴戟天配伍下調(diào)NFκB mRNA表達(dá)的作用強(qiáng)于單味中藥制何首烏、巴戟天。見表5。

    表5 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo) HUVECs中NFκB mRNA表達(dá)的影響

    3 討 論

    西醫(yī)認(rèn)為動脈粥樣硬化(AS)是卒中的病理學(xué)基礎(chǔ),而ox-LDL從多個途徑促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。ox-LDL可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞多種炎癥因子、黏附分子的表達(dá),如單核細(xì)胞趨化蛋白-1、血管細(xì)胞黏附分子-1等[8],誘導(dǎo)單核細(xì)胞遷移進(jìn)入動脈內(nèi)膜轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞[9]。ox-LDL本身有細(xì)胞毒作用,且比LDL更快地與巨噬細(xì)胞表面受體結(jié)合,促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬形成泡沫細(xì)胞,而泡沫細(xì)胞形成是整個AS進(jìn)程中的最重要的病理學(xué)標(biāo)志[10]。ox-LDL不僅促進(jìn)AS形成,還促進(jìn)AS斑塊破裂、觸發(fā)腦卒中事件發(fā)生,而我國卒中后認(rèn)知功能障礙發(fā)生率約為55.9%[11]。

    PSCI屬于中醫(yī)“呆病”、“善忘”、“癲證”、“郁證”等范疇,《醫(yī)林改錯》認(rèn)為“靈機(jī)記性不在心在腦”,故病位在腦?!鹅`樞·經(jīng)脈篇》:“人始生,先成精,精成后而腦髓生?!薄端貑枴の迮K生成論》:“諸髓者,皆屬于腦?!惫誓X為髓海。腎為先天之本,腎藏精,精生髓,故腦髓與腎息息相關(guān)。腎精充足,則髓海之源不斷,元神之府得安。腎虛不生髓,則腦髓空虛,元神不安,則出現(xiàn)頭暈、耳鳴、目眩、健忘、嗜睡、癡呆等癥狀。癡復(fù)康治療PSCI有顯效,通過改變患者的血液流變學(xué)、抗血小板凝聚、降低血液中的膽固醇和甘油三酯,升高高密度脂蛋白[12]等增加大腦血流量,維護(hù)腦細(xì)胞功能,改善學(xué)習(xí)能力、記憶功能[13]、卒中后前瞻性記憶障礙[14],改善癡呆癥狀。本實(shí)驗(yàn)選用癡復(fù)康方中的制何首烏、巴戟天,通過探討二藥及其配伍對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC損傷的影響,認(rèn)為制何首烏、巴戟天通過抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡以及NFκB mRNA的表達(dá)、延長ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC的細(xì)胞周期(S+G2)%,從而達(dá)到抑制動脈硬化、治療PSCI的效果。這也是對實(shí)驗(yàn)法對補(bǔ)腎填精法治療PSCI的佐證初探,希望將來有更多的研究提供證據(jù)。

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