一種含有霉菌的茯磚茶中冠突散囊菌的計(jì)數(shù)方法

劉相真 ，王靜，王瑾 ，徐建峰 *

（1.中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2.國(guó)家茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，浙江杭州 310016）

近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，高血壓、高血脂和高血糖，已經(jīng)成為威脅人類(lèi)健康的“頭號(hào)殺手”。 中國(guó)衛(wèi)生部公布的數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)“三高”人群數(shù)量已逾3 億，死亡率近30%。茯磚茶是黑茶的一種，是以黑毛茶為原料，經(jīng)過(guò)緊壓過(guò)程而制成的再加工茶[1]。茯磚茶之前主要銷(xiāo)售于邊疆地區(qū)如新疆、甘肅、西藏等地，俗稱(chēng)“邊茶”或“邊銷(xiāo)茶”，是邊疆少數(shù)民族不能缺少的常用飲品[2]。“金花”的學(xué)名為冠突散囊菌， 是散囊菌目發(fā)菌科散囊菌屬的一種真菌，是茯磚茶生產(chǎn)過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌種，也是形成茯磚茶獨(dú)特品質(zhì)的主要因素[3]。 大量文獻(xiàn)表明，茯磚茶中的“金花”有較強(qiáng)的降血脂、調(diào)節(jié)糖類(lèi)代謝、調(diào)節(jié)腸道菌群、提高機(jī)體免疫力、減肥等功效，因此，茯磚茶越來(lái)越受到大眾的青睞[4]。作為茯磚茶的標(biāo)志性微生物， 在茯磚茶的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)中都有要求。在1988、2002、2013 年發(fā)布的三版茯磚茶的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中， 冠突散囊菌一直是茯磚茶的理化指標(biāo)之一， 茯磚茶含有冠突散囊菌的量必須達(dá)到或高于20×104CFU/g （1988 年版為30×104CFU/g）。

茯磚茶的加工需要經(jīng)過(guò)原料處理、渥堆汽蒸、壓制定型、發(fā)花干燥、成品包裝等工序[5]，傳統(tǒng)茯磚茶生產(chǎn)過(guò)程是多種微生物共同參與發(fā)酵的過(guò)程。多名學(xué)者[6-13]長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地、不同時(shí)間生產(chǎn)的茯磚茶中均有大量微生物存在。

在 GB/T 9833.3—2013《緊壓茶 第 3 部分：茯磚茶》中規(guī)定，冠突散囊菌的檢測(cè)按GB 4789.15—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》中的規(guī)定執(zhí)行。 實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，由于某些茯磚茶中其他菌類(lèi)的存在， 且其生長(zhǎng)速度較冠突散囊菌快，抑制了冠突散囊菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)不能真實(shí)得到冠突散囊菌的含量。 試驗(yàn)基于GB 4789.15—2016 方法的基礎(chǔ)上，針對(duì)含有除冠突散囊菌外存在較多雜菌的茯磚茶樣品，進(jìn)一步優(yōu)化前處理方式（不同溫度、不同培養(yǎng)基的培養(yǎng)試驗(yàn)），以尋求合適的方法對(duì)冠突散囊菌進(jìn)行科學(xué)計(jì)數(shù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

博迅100 級(jí)超凈工作臺(tái)， 上海一恒BPMJ-150F 恒溫培養(yǎng)箱，上海申安DSX-280A 高壓滅菌鍋，精宏DK-S22 電熱恒溫水浴鍋，寧波立誠(chéng)LC-11L 拍打式無(wú)菌均質(zhì)器， 馬頭牌BP- II 型架盤(pán)藥物天平。

1.2 材料與試劑

一次性培養(yǎng)皿；無(wú)菌均質(zhì)袋；無(wú)菌錐形瓶：容量 500 mL，250 mL； 無(wú)菌吸管：1 mL （具 0.01 mL刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）、無(wú)菌平皿：直徑90 mm、無(wú)菌試管：10 mm×75 mm；孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基， 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；察氏培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；氯化鈉，西隴科學(xué)股份有限公司。

1.3 培養(yǎng)基的制備

孟加拉紅培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 5.0，葡萄糖10.0，磷酸二氫鉀 1.0，硫酸鎂（無(wú)水），瓊脂 20.0，孟加拉紅 0.033，氯霉素 0.1。 察氏培養(yǎng)基（g/L）：硝酸鈉3.0，磷酸氫二鉀1.0，硫酸鎂0.5，氯化鉀0.5，硫酸亞鐵0.01，蔗糖30.0，瓊脂15.0。 高鹽察氏培養(yǎng)基（g/L）：在察氏培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入6%的氯化鈉。

1.4 樣品制備

將茯磚茶樣品在干凈無(wú)污染工作臺(tái)上剪碎并混合均勻。 稱(chēng)取25 g 茯磚茶樣品于無(wú)菌均質(zhì)袋中，加入225 mL 無(wú)菌稀釋液，用拍擊式均質(zhì)器拍打 1～2 min 后， 置于水浴鍋中處理 30 min， 每隔10 min 攪拌一次，得到原液。用無(wú)菌稀釋液分別制備 10-3、10-4、10-5等各梯度的稀釋液， 用于傾注法涂布于平板。

1.5 菌落培養(yǎng)和技術(shù)

待瓊脂凝固后，正置平板，置28±1 ℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄至第7 天的結(jié)果。 選取菌落數(shù)量在10 CFU 至100 CFU 之間，且無(wú)蔓延菌落的平板來(lái)記錄冠突散囊菌總數(shù)，每個(gè)梯度兩個(gè)平行樣，取平均值，以平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 冠突散囊菌的正常菌落形態(tài)

冠突散囊菌菌落在孟加拉紅培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)如圖1 所示， 菌落呈較規(guī)則圓形， 質(zhì)地較致密，有黃色暈圈，邊緣淡黃色，近于橄欖淺黃色，中央部分顏色較深近于橄欖褐至丁香褐色， 呈現(xiàn)大量黃色菌絲，老后變成褐色，且伴有水滴狀存在。

圖1 冠突散囊菌在孟加拉紅培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig. 1 Colony morphology of Eurotium Cristatum on Rose Bengal Medium

2.2 國(guó)標(biāo)方法處理菌落生長(zhǎng)情況

從圖2 中可知， 選取的茯磚茶樣品從外觀上能明顯看到除了“金花”外，同時(shí)含有其他霉菌的存在（白色毛狀）。 當(dāng)按照 GB 4789.15—2016 方法進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，結(jié)果如圖3 所示，2 天后就已長(zhǎng)滿(mǎn)了毛霉， 并且旺盛生長(zhǎng)的毛霉會(huì)抑制冠突散囊菌的生長(zhǎng)。因此，國(guó)標(biāo)方法對(duì)此類(lèi)樣品存在一定的局限性， 導(dǎo)致對(duì)該茯磚茶中真實(shí)存在的冠突散囊菌計(jì)數(shù)結(jié)果比實(shí)際結(jié)果少。

圖2 茯磚茶茶樣Fig. 2 Fuzhuan Tea sample

圖3 國(guó)標(biāo)方法處理的生長(zhǎng)情況Fig. 3 The growth of microorganism by GB 4789.15—2016

2.3 水浴溫度處理對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響

在樣品制備階段進(jìn)行一定溫度的水浴處理，可以有效滅活其他雜菌，便于冠突散囊菌的計(jì)數(shù)。因此， 做不同水浴溫度處理下冠突散囊菌在不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況的單因素試驗(yàn)， 通過(guò)觀察冠突散囊菌在培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況， 選擇合適的培養(yǎng)基和水浴溫度。

2.3.1 孟加拉紅培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況

樣品前處理過(guò)程中， 水浴的溫度分別設(shè)定為50 ℃、60 ℃、70 ℃，水浴后的樣品稀釋 10-4后在孟加拉紅培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況如圖4 所示。 可看到水浴溫度50 ℃處理的樣品在孟加拉紅培養(yǎng)基上的培養(yǎng)結(jié)果稍好于按照國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)的結(jié)果；水浴溫度60 ℃和70 ℃處理后的樣品在孟加拉紅培養(yǎng)基上的培養(yǎng)結(jié)果較理想，無(wú)雜菌生長(zhǎng)，冠突散囊菌菌落形態(tài)較好，呈較規(guī)則圓形，且伴有水滴狀存在，但水浴溫度60 ℃處理在孟加拉紅培養(yǎng)基上的冠突散囊菌計(jì)數(shù)明顯多于水浴溫度70 ℃的處理。此結(jié)果與楊撫林等[12]對(duì)冠突散囊菌在120 ℃高溫條件下處理20 min 依舊具有生物活性較一致。

圖4 不同處理?xiàng)l件后的樣品勻液在孟加拉紅培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況Fig. 4 Growth of sample homogenates on Rose Bengal Medium under different treatments

2.3.2 察氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況

水浴后的樣品稀釋10-3后在察氏培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況如圖5 所示。從圖5 中可知，不同水浴溫度處理后在察氏培養(yǎng)基上均有雜菌生長(zhǎng)， 且冠突散囊菌的菌落形態(tài)不佳， 對(duì)計(jì)數(shù)有一定影響。 因此，在此實(shí)驗(yàn)方案下，察氏培養(yǎng)基不適合用于冠突散囊菌的檢測(cè)。

2.3.3 高鹽察氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況

水浴后的樣品在稀釋10-3后高鹽察氏培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況如圖6 所示。 水浴溫度50 ℃處理時(shí)， 有少量雜菌生長(zhǎng)， 冠突散囊菌菌落形態(tài)已呈現(xiàn)；水浴溫度60 ℃和70 ℃處理時(shí)，已無(wú)雜活菌生長(zhǎng)，冠突散囊菌菌落形態(tài)較好，但水浴溫度60 ℃處理在高鹽察氏培養(yǎng)基上的冠突散囊菌計(jì)數(shù)明顯多于水浴溫度70 ℃的處理。 對(duì)比圖5 與圖6 可得，由于高鹽的作用，菌落生長(zhǎng)明顯受到抑制。

圖5 不同處理?xiàng)l件后的樣品勻液在察氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況Fig. 5 Growth of sample homogenates on Czapek Dox Medium under different treatments

圖6 不同處理?xiàng)l件下在高鹽察氏培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況Fig. 6 Growth of sample homogenates on Salt Czapek Dox Medium under different treatments

2.4 最佳培養(yǎng)基的選擇

根據(jù)單一因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可得， 經(jīng)水浴溫度50 ℃處理，有不同程度的雜菌在不同的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；而經(jīng)水浴溫度60 ℃和70 ℃處理，能夠有效消除雜菌的干擾。水浴溫度60 ℃處理在孟加拉紅培養(yǎng)基上的冠突散囊菌計(jì)數(shù)明顯多于水浴溫度70 ℃的處理，說(shuō)明水浴溫度70 ℃處理時(shí)，能夠有效消除雜菌的干擾， 但對(duì)冠突散囊菌也有一定的滅活作用。 高鹽察氏培養(yǎng)基在樣品不經(jīng)水浴時(shí)也能有效抑制毛霉和根霉。 因此，對(duì)比60 ℃水浴處理后用孟加拉紅培養(yǎng)基培養(yǎng)以及高鹽察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)， 并對(duì)冠突散囊菌進(jìn)行計(jì)數(shù)以得出最佳實(shí)驗(yàn)方案，結(jié)果如圖7 和表1 所示。

表1 不同實(shí)驗(yàn)條件下冠突散囊菌菌落總數(shù)Table 1 The total plate count of Eurotium Cristatum under different experimental conditions

圖7 不同實(shí)驗(yàn)條件下冠突散囊菌的生長(zhǎng)情況Fig. 7 Growth of Eurotium Cristatum under different treatment conditions

由表1 可知，以上四種方法都能較好地抑制雜菌并有效地對(duì)冠突散囊菌進(jìn)行計(jì)數(shù)， 方案1 所得的冠突散囊菌最多。 雖然用高鹽察氏培養(yǎng)基也能對(duì)冠突散囊菌進(jìn)行計(jì)數(shù)， 但冠突散囊菌的生長(zhǎng)受到很大的抑制，因此，方案1，即經(jīng)60 ℃水浴、0.5 h 再用孟加拉紅培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)為該茯磚茶冠突散囊菌計(jì)數(shù)的最佳方案。

3 討論

隨著茯磚茶保健功效的不斷證實(shí)， 已經(jīng)逐步成為大眾飲品，茯磚茶中“金花”的多少又直接關(guān)系到它的保健功效的強(qiáng)弱，因此，對(duì)于“金花”計(jì)數(shù)的需求也越來(lái)越強(qiáng)烈。 文章只針對(duì)該種含雜菌較多的茯磚茶樣品進(jìn)行了試驗(yàn)， 得到了最佳計(jì)數(shù)方案，當(dāng)含有其他雜菌的茯磚茶需要“金花”計(jì)數(shù)時(shí)，仍需要進(jìn)行試驗(yàn)討論并解決。