基于骨蛋白拉曼光譜特異性的肉骨粉種屬鑒別方法

韓婭紅，蹇 林，杜瑞銘，蘇衍輔，朱 明，韓魯佳，劉 賢※

（1. 農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中下游農(nóng)業(yè)裝備重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，武漢 430070；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083）

0 引 言

肉骨粉（Meat and Bone Meal，MBM）是動(dòng)物骨頭和殘余碎肉組織加工而成的混合粉末，因其具有高蛋白含量，高生物學(xué)價(jià)值等特點(diǎn)[1]，曾被作為一種重要的蛋白飼料原料廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)。然而，一些通過(guò)肉骨粉在食物鏈中傳播的瘋牛病給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的安全風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。于是，世界各國(guó)紛紛制定相關(guān)法規(guī)[4]。目前，禁用措施最嚴(yán)厲的是歐盟，自 2001 年以來(lái)相繼頒布了一系列法令法規(guī)（2001/999/EC，2002/1774/EC，2003/1234/EC，2013/56/EC），禁止在反芻動(dòng)物，家禽和豬飼料中添加任何來(lái)源的肉骨粉并永久禁止畜禽動(dòng)物的同類(lèi)相食。同時(shí)，根據(jù)國(guó)務(wù)院令第609 號(hào)和農(nóng)牧發(fā)（2000）21 號(hào)文，中國(guó)目前同樣禁止在反芻動(dòng)物飼料中添加任何來(lái)源的肉骨粉，禁止畜禽動(dòng)物的同類(lèi)相食，但允許豬和家禽飼用非同類(lèi)肉骨粉。同時(shí)根據(jù)農(nóng)牧發(fā)（2019）5 號(hào)文，受非洲豬瘟疫情的影響，豬肉骨粉的飼用安全也將在未來(lái)很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)被嚴(yán)密監(jiān)控。盡管朊病毒的主要傳播途徑（反芻動(dòng)物食用反芻動(dòng)物肉骨粉）已清楚明了，歐盟依然禁止反芻動(dòng)物肉骨粉，雞肉骨粉和豬肉骨粉用于飼喂非反芻動(dòng)物，正是反映了目前仍缺乏可靠的肉骨粉種屬鑒別方法[5-6]。深入分析發(fā)現(xiàn)，要保障肉骨粉的飼料化安全使用，確保無(wú)論是歐盟最嚴(yán)禁令還是中國(guó)現(xiàn)行法令法規(guī)的有效實(shí)施，核心問(wèn)題均為實(shí)現(xiàn)不同種屬肉骨粉（牛羊/豬/雞）的準(zhǔn)確鑒別。

目前肉骨粉檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法是顯微鏡法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（Polymerase Chain Reaction，PCR）。但是兩種方法各有其局限性，PCR 法存在無(wú)法區(qū)分乳制品（允許添加）和肉骨粉導(dǎo)致的假陽(yáng)性率高和檢測(cè)效率低等難以突破的局限性，而顯微鏡法無(wú)法進(jìn)一步區(qū)分不同種屬肉骨粉，同時(shí)存在完全依靠專(zhuān)家經(jīng)驗(yàn)和檢測(cè)效率低等局限性。為了克服標(biāo)準(zhǔn)方法的局限性，許多研究學(xué)者采用光譜技術(shù)表征肉骨粉組成成分的特異性來(lái)開(kāi)發(fā)肉骨粉種屬鑒別分析方法[5,7-12]。歐盟第五框架計(jì)劃“STRATFEED”項(xiàng)目（G6RD-2000-CT-00414）經(jīng)系統(tǒng)研究提出了以有機(jī)物官能團(tuán)分析為基礎(chǔ)的近紅外技術(shù)和顯微近紅外技術(shù)，兩種方法均可有效地鑒別配合飼料和魚(yú)粉中的肉骨粉[5,7]，但近紅外方法難以鑒別不同種屬肉骨粉，而顯微近紅外技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)豬肉骨粉，雞肉骨粉和反芻動(dòng)物肉骨粉鑒別[8]，但模型精度不高。相比于近紅外光譜顯示出的含氫基團(tuán)振動(dòng)的倍頻與合頻的復(fù)雜信息，紅外光譜反映的是分子基頻振動(dòng)信息，在定性鑒別上更具優(yōu)勢(shì)[13]。Gao 等[9]采用紅外光譜對(duì)不同種屬肉骨粉脂肪酸組成結(jié)構(gòu)特異性進(jìn)行快速表征，建立不同種屬肉骨粉（豬，雞，牛和羊源）的快速鑒別方法與模型，正確判別率高于95%。但是肉骨粉的儲(chǔ)存環(huán)境和時(shí)間會(huì)引起油脂氧化酸敗，易導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。進(jìn)一步從化學(xué)組成分析，肉骨粉的主要成分為蛋白，脂肪和灰分。相比于脂肪，蛋白是肉骨粉的主要成分，美國(guó)飼料管理員協(xié)會(huì)（Association of American Feed Control Officials，AAFCO）規(guī)定優(yōu)質(zhì)肉骨粉蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)需達(dá) 50%以上。因此，本研究擬提出從肉骨粉蛋白入手，結(jié)合光譜技術(shù)研究不同種屬肉骨粉的鑒別分析問(wèn)題。

相關(guān)研究表明，紅外光譜可以表征不同物種蛋白組成與結(jié)構(gòu)的差異性，從而實(shí)現(xiàn)羽毛、大麥、小麥和燕麥的鑒別[14]，以及豬膠原蛋白、魚(yú)膠原蛋白和牛膠原蛋白的鑒別[15]。拉曼光譜和紅外光譜是一種互補(bǔ)技術(shù)，均可以對(duì)分子組成與結(jié)構(gòu)進(jìn)行“指紋性”識(shí)別，在定性鑒別上具有優(yōu)勢(shì)。但目前并沒(méi)有基于蛋白拉曼光譜特性的肉骨粉種屬鑒別分析研究的相關(guān)報(bào)道。由于蛋白提取步驟復(fù)雜，本研究采用提取骨顆粒的方法富集骨蛋白，采集其拉曼光譜數(shù)據(jù)，結(jié)合偏最小二乘判別分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA），建立基于骨蛋白的拉曼光譜特性的肉骨粉種屬鑒別分析模型，并深入分析模型鑒別機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 不同種屬肉骨粉樣品制備及其前處理

本研究共有87 個(gè)肉骨粉樣品（肉骨粉是以畜禽屠宰后的骨頭和殘余碎肉組織等部分經(jīng)滅菌、干燥、擠壓、脫脂、風(fēng)干和粉碎處理后制成的動(dòng)物蛋白產(chǎn)品），其中雞肉骨粉22 個(gè)，牛肉骨粉20 個(gè)，羊肉骨粉22 個(gè)以及豬肉骨粉23 個(gè)。部分樣品收集于中國(guó)農(nóng)科院，部分樣品為實(shí)驗(yàn)室根據(jù)歐盟的標(biāo)準(zhǔn)方法制備[16]。首先，新鮮動(dòng)物骨和殘余碎肉組織清洗干凈，切成小塊，裝到燒杯中（最多 2/3），經(jīng)高溫滅菌蒸煮（133 ℃，20 min）。蒸煮結(jié)束后，回收漂浮的油脂并將剩余固體轉(zhuǎn)移至托盤(pán)，放入烘箱干燥（105 ℃，24 h）。然后，利用三氯甲烷/甲醇法脫脂（2∶1，體積比；試劑為分析純，中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），每 50.0 g原料分3 次用900.0 mL 三氯甲烷/甲醇溶液（質(zhì)量濃度55.6 g/L）脫除脂肪。脫脂樣品自然風(fēng)干后用 ZM200型旋風(fēng)磨（德國(guó)Retsch 公司）粉碎至0.5 mm，密封保存于-20 ℃。

1.2 樣品前處理

根據(jù)Mandrile 等[17]方法采用骨顆粒的提取方法富集肉骨粉骨蛋白。具體步驟為：稱(chēng)取3.0 g 肉骨粉樣品于分液漏斗中，加入50 mL 四氯乙烯（質(zhì)量濃度 60 g/L），連續(xù)振蕩混合至少30 s，再量取不少于50 mL 四氯乙烯，沿分液漏斗內(nèi)壁倒入徹底洗凈著壁樣品，靜置5 min，打開(kāi)活塞，分離沉淀物于濾紙過(guò)濾后風(fēng)干，4 ℃密封保存。

1.3 拉曼光譜采集

取50.0 mg 肉骨粉骨顆粒均勻研磨，壓片測(cè)量其拉曼光譜。掃描范圍400～3 600 cm-1，激光強(qiáng)度400 mW，分辨率4 cm-1，樣品掃描128 次。為了使光譜具有代表性，每個(gè)壓片取6 個(gè)點(diǎn)，求取平均光譜。所有樣品重復(fù)3 次，求取平均光譜。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用基線(xiàn)校正、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換和二階導(dǎo)數(shù)作為前處理方法，采用Kennard-Stone 算法將肉骨粉樣品分為校正集（75%）和驗(yàn)證集（25%），每個(gè)模型均會(huì)進(jìn)行留一交互驗(yàn)證和獨(dú)立外部驗(yàn)證。判別分析模型評(píng)價(jià)指標(biāo)為靈敏度（Sensitivity），特異度（Specificity）和誤判率（Classification error）[18-19]，分別用公式表示。

式中TP 為真陽(yáng)性樣本個(gè)數(shù)，表示類(lèi)別為1 的樣本被判定為類(lèi)別1 的個(gè)數(shù)；FP 為假陽(yáng)性，代表非類(lèi)別1 的樣本被判別為類(lèi)別1 的個(gè)數(shù)；TN 為真陰性，表示非類(lèi)別1（類(lèi)別0）的樣本被判定為類(lèi)別0 的個(gè)數(shù)；FN 為假陰性，代表類(lèi)別1 的樣本被判別為類(lèi)別0 的個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種屬肉骨粉骨蛋白相關(guān)拉曼光譜特性分析

圖 1 為不同種屬肉骨粉骨顆粒拉曼光譜圖，其中3 600～1 200 cm-1和900～800 cm-1均和骨蛋白的分子振動(dòng)相關(guān)[20-28]。不同種屬肉骨粉骨顆粒的拉曼光譜位移和強(qiáng)度具有一定差異性。由表 1 和圖 1 可知，在 3 600～1 200 cm-1波段，特征譜帶主要集中于3 200～2 800 cm-1和 1 800～1 200 cm-1波段。3 200～2 800 cm-1波段反映了骨蛋白的官能團(tuán)振動(dòng)。其中，在2 930 cm-1附近特征譜帶強(qiáng)度最高，反映了C-H（CH2）的不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)[20-21]，而在3 060 cm-1附近特征峰是其肩峰，與酰胺B 帶的O-H振動(dòng)相關(guān)[21]。前一個(gè)特征峰在豬、雞、牛、羊 4 種肉骨粉拉曼光譜上的位置分別為 2 935、2 933、2 937 和2 937 cm-1，后一個(gè)特征峰在4 種肉骨粉拉曼光譜上的位置分別為3 060、3 059、3 060 和3 061 cm-1，這兩個(gè)特征峰在肉骨粉的拉曼光譜中，在拉曼位移上是不同的，這與不同肉骨粉中骨蛋白的官能團(tuán)振動(dòng)頻率有關(guān)[20-21]。而在1 800～1 200 cm-1波段的特征譜帶均與酰胺帶有關(guān)。其中，在1 659 cm-1附近有強(qiáng)譜帶，反映了酰胺I 帶的C=O和C-N 振動(dòng)[22-24]；而在1 554 cm-1附近特征譜帶與酰胺II帶N-H 彎曲振動(dòng)和C-N 拉伸振動(dòng)相關(guān)[21]，反映在豬、雞、牛、羊4 種肉骨粉拉曼光譜上的位置分別為1 555、1 555、1 557 和1 561 cm-1。在1 455 cm-1附近有強(qiáng)譜帶，反映了CH2振動(dòng)[23-26]，對(duì)應(yīng)的豬、雞、牛、羊4 種肉骨粉拉曼光譜上的位置分別為1 450、1 449、1 451 和1 451 cm-1；而在1 305 cm-1附近特征譜帶反映了酰胺III 帶的C-N 振動(dòng)[21,24,26]。在900～800 cm-1波段和氨基酸的官能團(tuán)振動(dòng)相關(guān)，其中在878 cm-1處特征譜帶與羥脯氨酸相關(guān)，而在853 cm-1處特征譜帶和脯氨酸相關(guān)[23,25-27]?？傮w而言，拉曼光譜反映了豬、雞、牛和羊四類(lèi)肉骨粉骨蛋白的 C-H（CH2）的不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)、酰胺I 帶的C=O 和C-N 振動(dòng)、CH2振動(dòng)以及酰胺III 帶的C-N 官能團(tuán)振動(dòng)。由于不同種屬肉骨粉骨蛋白組成與含量各不相同，因此其官能團(tuán)在 拉曼光譜上的響應(yīng)各不相同。

圖1 不同種屬肉骨粉骨顆粒的拉曼光譜圖Fig.1 Raman spectra of bone particle from different MBM samples

表1 不同種屬肉骨粉骨顆粒的拉曼特征譜帶及其歸屬Table 1 Raman characteristic bands of bone proteins from different MBM samples and their assignment

2.2 基于骨蛋白拉曼光譜特性的肉骨粉種屬鑒別分析

本研究采用 PLS-DA 算法分析不同種屬肉骨粉骨顆粒拉曼全譜。如圖 2 所示，采用第二、三和四潛變量建立雞和哺乳動(dòng)物（豬，牛和羊）肉骨粉 PLS-DA 圖，其中第二、三和四潛變量得分分別為 33.10%，0.17%和0.11%；采用第一、三和第七潛變量建立豬和反芻動(dòng)物（牛和羊）肉骨粉的 PLS-DA 圖，其中第一、三和第七潛變量得分分別為49.38%，0.20%和0.01%。因此，雞和哺乳動(dòng)物（豬、牛和羊）肉骨粉，豬和反芻動(dòng)物（牛和羊）肉骨粉可明顯區(qū)分，這一結(jié)論和Mandrile 的結(jié)論相似[17]。

因此，本研究采用多步模型策略：首先，建立禽類(lèi)/哺乳動(dòng)物肉骨粉的PLS-DA 模型。隨著潛變量個(gè)數(shù)增加，交互驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)偏差逐漸減小，誤判率逐漸降低，但潛變量個(gè)數(shù)過(guò)多會(huì)出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象。綜合分析，本研究采用前7 個(gè)潛變量建立基于骨顆粒拉曼全譜的禽類(lèi)/哺乳動(dòng)物肉骨粉的PLS-DA 判別模型。由表2 判別1 可知，禽類(lèi)（雞）肉骨粉和哺乳動(dòng)物（豬、牛和羊）肉骨粉樣品的靈敏度和特異度均為100%。結(jié)果說(shuō)明，禽類(lèi)（雞）肉骨粉和哺乳動(dòng)物（豬、牛和羊）肉骨粉無(wú)錯(cuò)判樣品。這表明禽類(lèi)/哺乳動(dòng)物肉骨粉PLS-DA 模型效果較好，可很好區(qū)分禽類(lèi)（雞）肉骨粉和哺乳動(dòng)物（豬、牛和羊）肉骨粉。為進(jìn)一步區(qū)分非反芻（豬）肉骨粉和反芻動(dòng)物（牛和羊）肉骨粉，采用前13 個(gè)潛變量建立基于骨顆粒拉曼全譜的非反芻/反芻動(dòng)物肉骨粉的PLS-DA 判別分析模型。如表2 所示，判別2 為非反芻/反芻動(dòng)物肉骨粉的PLS-DA 模型分析結(jié)果。所有肉骨粉的靈敏度和特異度均為100%，這表明非反芻/反芻動(dòng)物肉骨粉PLS-DA 模型效果較好，可很好區(qū)分非反芻（豬）肉骨粉和反芻動(dòng)物（牛和羊）肉骨粉。

為進(jìn)一步區(qū)分反芻動(dòng)物（牛和羊）肉骨粉，采用前13 個(gè)潛變量建立基于骨顆粒拉曼全譜的牛/羊肉骨粉的PLS-DA 判別分析模型。如表2 所示，判別3 為牛/羊肉骨粉的 PLS-DA 模型分析結(jié)果。交互驗(yàn)證結(jié)果表明牛肉骨粉和羊肉骨粉誤判率分別為6.25%和3.13%，外部驗(yàn)證結(jié)果表明無(wú)誤判樣品。這說(shuō)明牛/羊肉骨粉PLS-DA 判別分析模型效果較好，可較好區(qū)分牛肉骨粉和羊肉骨粉。

2.3 基于骨蛋白拉曼特征波段的肉骨粉種屬鑒別分析

為挖掘骨蛋白在肉骨粉種屬鑒別分析模型中的貢獻(xiàn)，本研究建立基于骨蛋白拉曼特征波段（3 200～2 800 cm-1，1 800～1 200 cm-1和 900～800 cm-1）的不同種屬肉骨粉的 PLS-DA 判別分析模型。首先，采用前 6個(gè)潛變量建立禽類(lèi)/哺乳動(dòng)物肉骨粉的PLS-DA 判別分析模型。如表3所示，判別1為禽類(lèi)/哺乳動(dòng)物肉骨粉PLS-DA模型的分析結(jié)果。交互驗(yàn)證和外部驗(yàn)證結(jié)果均表明所有肉骨粉的靈敏度和特異度均為100%，無(wú)誤判樣品，和基于全譜的建模結(jié)果一致。這說(shuō)明基于骨蛋白拉曼特征波段的禽類(lèi)/哺乳動(dòng)物肉骨粉的PLS-DA 判別分析模型可以很好地區(qū)分禽類(lèi)（雞）肉骨粉和哺乳動(dòng)物（豬，牛和羊）肉骨粉，從而說(shuō)明骨蛋白對(duì)區(qū)分禽類(lèi)（雞）肉骨粉和哺乳動(dòng)物（豬，牛和羊）肉骨粉具有重要貢獻(xiàn)。

圖2 基于骨顆粒拉曼全譜的不同種屬肉骨粉PLS-DA 分析圖Fig.2 PLS-DA score plots of MBM from different species based on Raman spectral analysis of bone particle

表2 基于骨顆粒拉曼全譜的不同種屬肉骨粉PLS-DA 分析結(jié)果Table 2 Results of PLS-DA discrimination based on Raman spectral analysis of bone particle from different MBM samples

表3 基于骨蛋白拉曼特征波段的不同種屬肉骨粉PLS-DA 分析結(jié)果Table 3 Results of PLS-DA discrimination based on Raman characteristic regions of bone protein from different MBM samples

為進(jìn)一步分析骨蛋白拉曼特征波段在禽類(lèi)/哺乳動(dòng)物肉骨粉 PLS-DA 模型中的貢獻(xiàn)，采用變量投影重要性得分對(duì)骨蛋白拉曼特征波段進(jìn)行評(píng)價(jià)，見(jiàn)圖3a 所示。

變量投影重要性得分是用來(lái)評(píng)價(jià)每個(gè)波數(shù)對(duì)PLS-DA 模型的重要性，當(dāng)?shù)梅执笥?，被認(rèn)為是重要的[29-30]。由圖3a 可知，有476 個(gè)波數(shù)對(duì)禽類(lèi)/哺乳動(dòng)物肉骨粉的 PLS-DA 模型具有重要貢獻(xiàn)。一般而言，與蛋白官能團(tuán)特征譜帶相鄰的波數(shù)也會(huì)受到此蛋白官能團(tuán)振動(dòng)的影響。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，反映酰胺I 帶的C=O 和C-N 振動(dòng)的相關(guān)波數(shù)（1 659 cm-1）變量投影重要性得分最高，其次是反映C-H（CH2）伸縮振動(dòng)的相關(guān)波數(shù)（2 930 cm-1和2 852 cm-1）。依次是反映酰胺III 帶的C-N 振動(dòng)的相關(guān)波數(shù)（1 246 cm-1）和反映蛋白 CH2振動(dòng)的相關(guān)波數(shù)（1 455 cm-1）。這說(shuō)明，基于拉曼光譜特性的禽類(lèi)/哺乳動(dòng)物肉骨粉 PLS-DA 模型的鑒別機(jī)理主要是基于在1 659，2 930，2 852，1 246 和 1 455 cm-1附近的與骨蛋白相關(guān)特征譜帶的差異性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證變量投影重要性指標(biāo)的穩(wěn)定性，本研究還采用隨機(jī)的方法平行計(jì)算后，發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證變量投影重要性得分圖基本一致，說(shuō)明本結(jié)果可靠。

圖3 基于骨蛋白拉曼特征波段的肉骨粉PLS-DA 模型變量投影重要性得分Fig.3 Plot of variable importance in projection scores of PLS-DA model of MBM based on Raman characteristic regions of bone protein

為了研究骨蛋白拉曼特征波段對(duì)非反芻/反芻動(dòng)物肉骨粉判別分析模型的貢獻(xiàn)，本研究采用前10 個(gè)潛變量，建立基于骨蛋白拉曼特征波段的非反芻/反芻動(dòng)物肉骨粉的PLS-DA 鑒別模型。如表3 所示，判別2 為非反芻/反芻動(dòng)物肉骨粉的 PLS-DA 判別模型的分析結(jié)果。交互驗(yàn)證和外部驗(yàn)證結(jié)果表明，所有肉骨粉樣品的靈敏度和特異度均為100%，無(wú)誤判樣品，和基于全譜的建模結(jié)果一致。為進(jìn)一步研究骨蛋白在非反芻/反芻動(dòng)物肉骨粉PLS-DA 模型中的貢獻(xiàn)，采用了變量投影重要性得分對(duì)骨蛋白拉曼特征波段進(jìn)行評(píng)價(jià)。由圖3b 可知，有269 個(gè)波數(shù)對(duì)非反芻/反芻動(dòng)物肉骨粉的PLS-DA 模型具有重要貢獻(xiàn)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，反映C-H（CH2）不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)的相關(guān)波數(shù)（2 852 cm-1）的變量投影重要性得分最高，其次是反映酰胺 I 帶的 C=O 和 C-N 振動(dòng)的相關(guān)波數(shù)（1 659 cm-1），最后是反映酰胺III 帶的C-N 振動(dòng)的相關(guān)波數(shù)（1 246 cm-1）。這說(shuō)明，基于拉曼光譜特性的非反芻/反芻動(dòng)物肉骨粉PLS-DA 模型的鑒別機(jī)理主要是基于在2 852，1 659 和1 246 cm-1附近與骨蛋白相關(guān)特征譜帶的差異性。

為了研究骨蛋白拉曼特征波段對(duì)牛/羊肉骨粉判別分析模型的貢獻(xiàn)，本研究采用前11 個(gè)潛變量，建立基于骨蛋白拉曼特征波段的牛/羊肉骨粉的PLS-DA 判別分析模型。如表3 所示，判別3 為牛/羊肉骨粉的PLS-DA 判別模型的分析結(jié)果。交互驗(yàn)證結(jié)果表明，所有肉骨粉樣品的靈敏度和特異度均為93.8%，而外部驗(yàn)證結(jié)果表明所有肉骨粉樣品的靈敏度和特異度均為100%?；诠堑鞍桌卣鞑ǘ蔚慕＝Y(jié)果，比基于全譜的建模結(jié)果略好。為進(jìn)一步分析骨蛋白拉曼光譜特性在牛/羊肉骨粉PLS-DA 模型中的貢獻(xiàn)，采用了變量投影重要性得分對(duì)骨蛋白拉曼特征波段進(jìn)行評(píng)價(jià)。由圖3c 可知，有397 個(gè)波數(shù)對(duì)牛/羊肉骨粉的PLS-DA 模型具有重要貢獻(xiàn)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，反映羥脯氨酸和脯氨酸相關(guān)波數(shù)（878 和853 cm-1）的變量投影重要性得分最高，其次是反映C-H（CH2）不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)的相關(guān)波數(shù)（2 930 和2 852 cm-1），依次是反映酰胺III 帶的C-N 振動(dòng)的相關(guān)波數(shù)（1 246 cm-1），反映蛋白CH2振動(dòng)的相關(guān)波數(shù)（1 455 cm-1）以及反映酰胺I 帶的C=O 和C-N 振動(dòng)的相關(guān)波數(shù)（1 659 cm-1）。這說(shuō)明，基于拉曼光譜特性的牛/羊肉骨粉PLS-DA 模型的鑒別機(jī)理主要是基于在878，853，2 930，2 852，1 246，1 455 和1 659 cm-1附近與骨蛋白相關(guān)特征譜帶的差異性。

3 結(jié) 論

基于骨蛋白拉曼光譜特性，結(jié)合 PLS-DA 算法，采用多步模型策略，首先建立禽類(lèi)（雞）和哺乳動(dòng)物（豬，牛和羊）肉骨粉的 PLS-DA 判別分析模型，其次建立非反芻（豬）和反芻動(dòng)物（牛和羊）肉骨粉的 PLS-DA 判別分析模型，其靈敏度和特異度均為100%，無(wú)誤判樣品。最后建立反芻動(dòng)物中的牛和羊肉骨粉的 PLS-DA 判別分析模型，牛和羊肉骨粉的鑒別靈敏度和特異度均為93.8%，誤判率為6.25%。機(jī)理分析發(fā)現(xiàn)，骨蛋白對(duì)區(qū)分不同種屬肉骨粉具有重要貢獻(xiàn)，對(duì)禽類(lèi)（雞）和哺乳動(dòng)物（豬，牛和羊）肉骨粉的 PLS-DA 模型具有貢獻(xiàn)的波數(shù)共有476個(gè)，其中1 659，2 930，2 852，1 246和1 455 cm-1附近與骨蛋白相關(guān)的特征譜帶對(duì)區(qū)分禽類(lèi)（雞）和哺乳動(dòng)物（豬、牛和羊）肉骨粉具有重要作用；對(duì)非反芻（豬）和反芻動(dòng)物（牛和羊）肉骨粉的 PLS-DA 模型具有貢獻(xiàn)的波數(shù)共有269 個(gè)，其中2 852，1 659 和1 246 cm-1附近與骨蛋白相關(guān)的特征譜帶對(duì)區(qū)分非反芻（豬）和反芻動(dòng)物（牛和羊）肉骨粉具有重要作用；對(duì)牛/羊肉骨粉的PLS-DA 模型具有貢獻(xiàn)的波數(shù)共有397 個(gè)，其中878，853，2 930，2 852，1 246，1 455 和 1 659 cm-1附近與骨蛋白相關(guān)的特征譜帶對(duì)區(qū)分牛和羊肉骨粉具有重要作用。