酶轉(zhuǎn)化法和金屬離子催化法聯(lián)用制備人參皂苷Rh2系列異構(gòu)體

吳 鑫 慧， 劉 春 瑩， 徐 龍 權(quán)， 宋 建 國， 魚 紅 閃

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 遼寧 大連 116622 )

0 引 言

人參(PanaxginsengC. A. Meryer)屬五加科植物，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥[1]。人參皂苷是人參中的主要有效成分，大約占總質(zhì)量的4%[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，人參皂苷Rh2能夠抑制癌細(xì)胞的擴(kuò)散，對腫瘤的治療有極為重要的作用[3-4]。人參皂苷Rh2屬于稀有皂苷，雖然活性高，但在人參植物中含量極少，所以如何高效簡便的轉(zhuǎn)化人參皂苷Rh2是近年來的研究目標(biāo)[5]。

目前催化轉(zhuǎn)化人參皂苷的方法很多，大多數(shù)使用化學(xué)法和生物轉(zhuǎn)化法。化學(xué)法大多采用強(qiáng)酸強(qiáng)堿、高溫高壓，反應(yīng)劇烈，缺乏方向性和目的性，產(chǎn)生復(fù)雜的產(chǎn)物，并且會對環(huán)境造成嚴(yán)重污染[6-7]。而生物轉(zhuǎn)化法是用不同性質(zhì)的生物酶作用于不同構(gòu)型和組成的糖苷鍵或苷鍵，達(dá)到定向水解的目的[8]。該方法反應(yīng)溫和，有很強(qiáng)的底物特異性，產(chǎn)物單一[9]。酶催化法反應(yīng)溫和，目的性強(qiáng)，產(chǎn)物的下游分離純化相對容易，不會造成環(huán)境污染[10]。但要采用酶作為催化劑需要進(jìn)行酶的制備和純化，生產(chǎn)周期長，且酶易失活，不易存儲較長時間[11-12]。

實驗室前期在對人參皂苷轉(zhuǎn)化方法的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3+可以催化人參皂苷F2轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rh2。該催化反應(yīng)條件溫和，常溫常壓下就能進(jìn)行，產(chǎn)物相對單一，后期產(chǎn)物容易分離[13]。另外，F(xiàn)e3+可以回收利用，減少了對環(huán)境的污染[14]。

本實驗采用酶轉(zhuǎn)化法和Fe3+催化法，首先以原二醇類人參皂苷(PPD)為底物采用酶轉(zhuǎn)化法制備人參皂苷F2；再以人參皂苷F2為底物采用Fe3+催化法進(jìn)一步轉(zhuǎn)化制備人參皂苷Rh2，并分析了催化產(chǎn)物中人參皂苷Rh2系列異構(gòu)體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和組成情況。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

菌株Aspergillusnigerg.848，大連工業(yè)大學(xué)菌種保存室提供。F2、20(S，R)-Rh2、Rk2和Rh3對照品以及PPD樣品，實驗室自制。HPLC試劑為色譜純，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

Silica Gel 60-F254薄層層析板，德國Merck公司；Waters 2695-2424高效液相色譜儀，美國Waters公司。

1.2 方 法

1.2.1 酶液的制備

大批量培養(yǎng)A.nigerg.848菌株，接種至糖度為5°的麥芽汁液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，pH 6.8，加入體積分?jǐn)?shù)1%的人參浸出液。30 ℃下?lián)u床發(fā)酵培養(yǎng)5～6 d，將發(fā)酵培養(yǎng)后的培養(yǎng)基離心，除掉不溶雜質(zhì)，取上清液在攪拌條件下加入適量硫酸銨粉末，調(diào)至飽和度80%，4 ℃下靜置4 h后離心除去沉淀，靜置過夜，第2天離心收集酶蛋白沉淀。將沉淀溶于1/10培養(yǎng)基體積的0.02 mol/L NaAC-HAC緩沖液(pH 5.0)，離心除掉不溶物質(zhì)，所得上清液即為粗酶液，4 ℃冷藏保存[15-16]。

1.2.2 酶轉(zhuǎn)化生成F2的最佳反應(yīng)條件

對底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、反應(yīng)時間[17]等酶反應(yīng)條件進(jìn)行研究。以PPD皂苷為底物，分別配制1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%～6%的PPD，pH 5.0，溫度30～60 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)0～40%，與等體積粗酶液混合，分別在0.5～3 h時取樣，反應(yīng)結(jié)束后用2倍體積的水飽和正丁醇和1倍體積水萃取反應(yīng)產(chǎn)物，用TLC法[18]檢測反應(yīng)結(jié)果，根據(jù)酶反應(yīng)生成F2的量確定最適條件。

1.2.3 乙醇體系中Fe3+對人參皂苷F2的催化反應(yīng)條件

采用FeCl3作為催化反應(yīng)中的金屬離子，以F2皂苷為底物，分別配制1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.50%～2.25%的人參皂苷F2，溫度30～60 ℃，每隔5 ℃檢測一次，乙醇體積分?jǐn)?shù)0～100%，與等體積的氯化鐵溶液混合，F(xiàn)e3+濃度0.1～3 mol/L，分別在2～24 h時取樣，反應(yīng)結(jié)束后用2倍體積的水飽和正丁醇和1倍體積的水萃取反應(yīng)產(chǎn)物。用TLC進(jìn)行檢測，觀察點板效果，根據(jù)催化反應(yīng)Rh2生成量來確定最佳反應(yīng)條件。

1.2.4 酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)物和Fe3+催化反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC檢測

將催化反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行HPLC檢測。色譜柱：中匯達(dá)C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL；體積流量1.0 mL/min；載氣壓力30 psi；漂移管溫度80 ℃；以乙腈(A)-水(B)溶液梯度洗脫：0～20 min，20% A等度；20～31 min，20%～32% A線性梯度；31～40 min，32%～43% A線性梯度；40～70 min；43%～100% A線性梯度[19]。

對照品的制備：稱取人參皂苷F2、20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rh3和Rk 5 mg溶于10 mL色譜甲醇中，配成2 mg/mL的對照品溶液，分別取1 mL加入色譜甲醇稀釋成質(zhì)量濃度2.0、1.6、1.2、0.8、0.4 mg/mL的對照品溶液，放置于4 ℃冰箱備用。精密吸取對照溶液10 μL，按色譜條件測定分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得到各個成分的回歸方程[20]，結(jié)果見表1。

1.2.5 催化反應(yīng)產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計算

參照表1分別計算樣品中含有的F2、20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2和Rh3的質(zhì)量。

表1 人參皂苷F2和Rh2組成的線性回歸方程Tab.1 The regression equations of ginsenoside F2 and Rh2 components

w1=m′1/m1×100%
w2=(m′2+m″2)/m2w3=(m′3+m″3)/m2

式中，w1為F2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；m′1為F2的質(zhì)量，mg；m1為酶反應(yīng)后干燥樣品的質(zhì)量，mg；w2為20(S，R)-Rh2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；m2為金屬離子反應(yīng)后干燥樣品的質(zhì)量，mg；m′2為20(S)-Rh2的質(zhì)量，mg；m″2為20(R)-Rh2的質(zhì)量，mg；w3為Rk2和Rh3的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；m′3為Rh3的質(zhì)量，mg；m″3為Rk2的質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶轉(zhuǎn)化法制備F2的催化反應(yīng)條件優(yōu)化

采用“1.2.2”的方法檢測在不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、溫度和酶反應(yīng)時間下F2的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如圖1所示。從圖1(a)可以看出，隨著溫度的升高，F(xiàn)2轉(zhuǎn)化率先增大再減少，在40 ℃時，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大；從圖1(b)可以看出，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，F(xiàn)2的轉(zhuǎn)化率先增大再減少，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大；從圖1(c)可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大；從圖1(d)可以看出，隨著時間的延長，F(xiàn)2的轉(zhuǎn)化率先增大再減少，在反應(yīng)時間1.5 h時，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大。確定最佳反應(yīng)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)10%，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%，反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)時間為1.5 h。

(a) 反應(yīng)溫度

(c) 乙醇體積分?jǐn)?shù)

(d) 反應(yīng)時間圖1 酶反應(yīng)條件的優(yōu)化Fig.1 Optimization of enzyme reaction conditions

2.2 Fe3+催化反應(yīng)條件的優(yōu)化

實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，在乙醇-水體系中人參皂苷的反應(yīng)效果較好。采用“1.2.3”的方法對Fe3+催化反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖2所示。從圖2(a)可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，20(S，R)-Rh2轉(zhuǎn)化率先增大再緩慢減少，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時，20(S，R)-Rh2轉(zhuǎn)化率最大；從圖2(b)可以看出，隨著Fe3+濃度的增加，20(S，R)-Rh2 轉(zhuǎn)化率先增大再緩慢減小，當(dāng)FeCl3濃度為0.8 mol/L時，20(S，R)-Rh2轉(zhuǎn)化率最大；從圖2(c)可以看出，溫度越升高，底物降解的越徹底，溫度為50 ℃時，20(S，R)-Rh2轉(zhuǎn)化率最大；從圖2(d)可以看出，F(xiàn)2底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.3%時，20(S，R)-Rh2轉(zhuǎn)化率最大；從圖2(e)可以看出，隨時間的延長，20(S，R)-Rh2轉(zhuǎn)化率先增大再緩慢降低，反應(yīng)時間為17 h時，20(S，R)-Rh2轉(zhuǎn)化率最大。確定最佳反應(yīng)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，F(xiàn)e3+溶液反應(yīng)濃度0.8 mol/L，反應(yīng)溫度50 ℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.3%，反應(yīng)時間17 h。

(a) 乙醇體積分?jǐn)?shù)

(b) Fe3+濃度

(c) 反應(yīng)溫度

(d) 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)

(e) 反應(yīng)時間圖2 乙醇-水體系中反應(yīng)條件的優(yōu)化Fig.2 Optimization of reaction conditions in ethanol-water system

2.3 酶轉(zhuǎn)化法和金屬離子催化法聯(lián)用制備人參皂苷Rh2

以PPD為底物，在最佳反應(yīng)條件下，稱取PPD 20 g與相同體積的粗酶液混合，在40 ℃的反應(yīng)釜中反應(yīng)1.5 h后，向反應(yīng)溶液中加入反應(yīng)溶液3倍體積95%的乙醇，終止反應(yīng)，離心取上清液干燥。干燥樣品溶解于1 000 mL去離子水中，吸附于800 mL AB-8樹脂柱，反復(fù)上樣至皂苷完全吸附，用5倍柱體積的水洗脫，除去糖等可溶性雜質(zhì)。再用58%乙醇洗脫柱子，收集洗脫的醇溶液。將醇溶液在陰離子交換樹脂D280上洗脫，進(jìn)行脫色處理，并將溶液濃縮干燥，得到含有F2的產(chǎn)物13.96 g，轉(zhuǎn)化率為69.8%。

采取乙醇-水作溶劑體系，配制13 g質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.3%的酶液轉(zhuǎn)化F2粗品溶液，與500 mL等體積的1.6 mol/L氯化鐵溶液混合，于50 ℃反應(yīng)17 h后加入水飽和正丁醇萃取，水洗正丁醇層3遍，除去Fe3+后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，干燥后得到催化反應(yīng)產(chǎn)物粗品9.41 g，得率72.4%。

HPLC測定結(jié)果如圖3所示。酶轉(zhuǎn)化PPD混合皂苷的反應(yīng)中生成主要產(chǎn)物為F2(圖3(b))，經(jīng)計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)為58.2%，經(jīng)純化后得到的單品純度高達(dá)90%(圖3(c))。在Fe3+催化人參皂苷F2的產(chǎn)物粗品中有4種產(chǎn)物(圖3(d))，分別為20(S，R)-Rh2、Rk2和Rh3，主要產(chǎn)物是20(S，R)-Rh2，計算得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為43.8%，Rk2和Rh3的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.2%。本實驗從PPD皂苷經(jīng)酶轉(zhuǎn)化得到F2，再用Fe3+催化轉(zhuǎn)化得到Rh2，最終得率為50.7%。

(a) 底物PPD

(b) F2粗品

(c) 純化產(chǎn)物

(d) Fe3+催化產(chǎn)物圖3 反應(yīng)底物和產(chǎn)物的HPLC圖Fig.3 HPLC results of reaction substrates and products

3 結(jié) 論

通過優(yōu)化PPD混合人參皂苷的酶反應(yīng)條件和Fe3+催化反應(yīng)條件，得到最佳酶反應(yīng)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)10%，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%，反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)時間1.5 h，生成的F2轉(zhuǎn)化率最高。Fe3+催化的最佳反應(yīng)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，F(xiàn)e3+濃度0.8 mol/L，反應(yīng)溫度50 ℃，反應(yīng)時間17 h，人參皂苷F2轉(zhuǎn)化率最高。在此條件下，20 g PPD最終轉(zhuǎn)化成9.41 g Rh2，得率為50.6%。其中20(S，R)-Rh2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為43.8%。

采用酶轉(zhuǎn)化法和金屬離子催化法聯(lián)用制備人參皂苷Rh2系列異構(gòu)體，這兩種方法具有反應(yīng)特異性強(qiáng)、條件溫和(常溫常壓)、底物轉(zhuǎn)化徹底、產(chǎn)物得率高、無污染等優(yōu)點，用低成本的PPD有效制備了高活性稀有皂苷20(S，R)-Rh2，更易于工業(yè)化放大生產(chǎn)，為稀有人參皂苷的催化制備提供了新的方法。