鼠李糖脂對(duì)7種常見(jiàn)植物病原真菌的室內(nèi)活性評(píng)價(jià)

張賢玉　李佳寧　劉召陽(yáng)　黃麗麗　馮浩

摘要：鼠李糖脂是一種生物代謝性質(zhì)的表面活性劑，近年來(lái)被認(rèn)為具有開(kāi)發(fā)為生物源農(nóng)藥的潛力而備受關(guān)注。為了揭示鼠李糖脂對(duì)常見(jiàn)植物病害的生防潛能，本研究評(píng)價(jià)了其對(duì)7種常見(jiàn)植物病原菌的室內(nèi)抑菌活性，并揭示了鼠李糖脂處理對(duì)灰葡萄孢（Botrytis cinerea）菌絲形態(tài)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼠李糖脂對(duì)所有供試菌株菌絲生長(zhǎng)均有一定的抑制效果，其中對(duì)B. cinerea效果最為明顯，EC50為0.51μL·mL-1;組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂處理后B. cinerea菌絲出現(xiàn)分支增多、畸形等現(xiàn)象?？梢?jiàn)，鼠李糖脂在藥劑開(kāi)發(fā)方面具有較大潛力，為其進(jìn)一步研究與應(yīng)用提供了一定的理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：EC50;菌絲形態(tài)觀察;生防潛力;鼠李糖脂;抑菌活性

中圖分類(lèi)號(hào)：S-3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

作者簡(jiǎn)介：張賢玉（2000-），男，本科在讀。研究方向：植物保護(hù)。

病害是威脅作物安全生產(chǎn)的重要生物因素之一。當(dāng)前防控植物病害依舊主要依賴(lài)化學(xué)藥劑，但是長(zhǎng)期單一施用化學(xué)藥劑會(huì)帶來(lái)抗性風(fēng)險(xiǎn)、農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染等問(wèn)題。因此，開(kāi)發(fā)應(yīng)用高效低毒的生物源藥劑變得越來(lái)越重要。鼠李糖脂是由假單胞菌或伯克氏菌類(lèi)產(chǎn)生的一種生物代謝性質(zhì)的生物表面活性劑。近年來(lái)，憑借低毒、可降解的優(yōu)勢(shì)，在堆肥、促進(jìn)植物養(yǎng)分吸收以及土壤修復(fù)等方面受到關(guān)注[1-3]。在植物病害防控應(yīng)用方面，發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂具有誘導(dǎo)植物抗性、抑制菌絲生長(zhǎng)、水解病菌孢子、抑制孢子萌發(fā)以及阻止孢子移動(dòng)等作用，個(gè)別國(guó)家已經(jīng)將鼠李糖脂作為生物農(nóng)藥備案[4，5]。然而，我國(guó)對(duì)鼠李糖脂的研究主要集中在食品、醫(yī)藥和環(huán)境保護(hù)等方面，對(duì)其在真菌病害防控方面的研究較少。

為了揭示鼠李糖脂對(duì)常見(jiàn)植物病害的生防潛能，本研究評(píng)價(jià)了其對(duì)7種常見(jiàn)植物病原菌的抑菌活性，并揭示了其對(duì)B.cinerea菌絲形態(tài)影響，為鼠李糖脂的進(jìn)一步研究與應(yīng)用提供一定的理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試菌株

供試菌株見(jiàn)表1。1.1.2培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）用于供試菌株培養(yǎng)及藥效測(cè)定。

1.1.3供試藥劑

鼠李糖脂原液，由浙江東杰生物科技有限公司提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1供試菌株對(duì)鼠李糖脂的敏感性測(cè)定

用滅菌水將鼠李糖脂原藥稀釋成特定濃度的母液，吸取不同體積母液加入PDA培養(yǎng)基中，充分混合均勻，倒入培養(yǎng)皿制成不同濃度的含藥平板（表2）。以PDA培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)置3次機(jī)械重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

挑取待測(cè)病菌菌絲于空白PDA培養(yǎng)基25℃黑暗培養(yǎng)3d。打孔器滅菌后在菌落邊緣打取直徑為5mm的菌餅，倒置接種于含藥平板中央，25℃黑暗培養(yǎng)。利用十字交叉法測(cè)量皿內(nèi)菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率，所用公式如下：

菌絲生長(zhǎng)抑制率=[（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）]×100%

以藥劑濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（x），菌絲生長(zhǎng)抑制率為縱坐標(biāo)（y），作線性回歸分析，計(jì)算鼠李糖脂對(duì)供試菌株菌絲生長(zhǎng)的EC50值和相關(guān)系數(shù)R2。

1.2.2鼠李糖脂對(duì)B.cinerea的菌絲形態(tài)影響觀察

將B.cinerea接種于空白PDA培養(yǎng)基（對(duì)照組）和1.00μL·mL-1濃度含藥培養(yǎng)基上。25℃黑暗培養(yǎng)2d后，挑取菌落邊緣，置于載玻片，利用光學(xué)顯微鏡觀察2組菌絲的形態(tài)差異。

2試驗(yàn)結(jié)果

2.1供試菌株對(duì)鼠李糖脂的敏感性

試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼠李糖脂對(duì)供試菌株菌絲生長(zhǎng)均有一定抑制作用（表3、圖1）。其中對(duì)B.cinerea菌絲生長(zhǎng)抑制作用最為明顯，EC50為0.51μL·mL-1。對(duì)V.mali、B.dothidea、F.spp.、C.gloeosporioides、P.capsici抑制效果較好，EC50在1.13～4.76μL·mL-1;對(duì)S.sclerotiorum抑制效果較差，EC50為24.20μL·mL-1。

2.2鼠李糖脂對(duì)B.cinerea的菌絲形態(tài)影響

1.00μL·mL-1鼠李糖脂處理2d后，B.cinerea菌絲形態(tài)發(fā)生明顯變化，處理組較對(duì)照組菌絲分支明顯增多（圖2a-A）;處理組菌絲出現(xiàn)畸形，多扭曲，少數(shù)膨大，對(duì)照組則菌絲細(xì)直，不彎曲（圖2b-B）;處理組細(xì)胞長(zhǎng)度變短，較對(duì)照組細(xì)胞明顯縮短（圖2c-C）。

3討論

《全國(guó)農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化規(guī)劃（2016—2020年）》指出，我國(guó)農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化已經(jīng)進(jìn)入了新的發(fā)展階段，但仍然面臨糧食生產(chǎn)安全、食品質(zhì)量安全、農(nóng)田環(huán)境污染等眾多問(wèn)題，其中長(zhǎng)期單一過(guò)量使用化學(xué)藥劑進(jìn)行植物病害防控存在農(nóng)業(yè)污染、農(nóng)藥殘留、病原菌抗藥性增強(qiáng)等系列問(wèn)題。因此，生物源藥劑的研發(fā)和應(yīng)用具有重要意義。鼠李糖脂是一種由1～2個(gè)鼠李糖分子與1～2個(gè)β-羥基脂肪酸形成共價(jià)結(jié)構(gòu)而組成的一類(lèi)糖脂分子。其是一種非常有效的生物源表面活性劑，在國(guó)際化、綠色化背景下，鼠李糖脂以其低毒、可降解的優(yōu)點(diǎn)，在堆肥、土壤修復(fù)等各方面的應(yīng)用中獲得越來(lái)越多的關(guān)注。

前期已有研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖脂能夠水解瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）等卵菌的孢子[6-8]，并能夠抑制甘蔗鐮孢霉菌（Fusarium sacchari）、尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum）等真菌的菌絲生長(zhǎng)[9，10]。同時(shí)，能夠抑制茄鏈格孢菌（Alternaria solani）和辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）的孢子萌發(fā)[11，12]。特別是在番茄灰霉病防控方面，Varnier等[13]發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂能夠提高植物幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的表達(dá)水平激活植物PTI從而提高植物對(duì)灰霉病的防控效果。本研究評(píng)價(jià)了鼠李糖脂對(duì)7種常見(jiàn)植物病原菌的抑菌活性，并揭示了其對(duì)B.cinerea菌絲形態(tài)影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼠李糖脂對(duì)供試菌株均有一定的抑制效果，其中對(duì)B.cinerea的抑菌效果最為顯著。由此可見(jiàn)，鼠李糖脂具有較大的開(kāi)發(fā)為生物源藥劑的潛能。

參考文獻(xiàn)

[1]趙佳佳.鼠李糖脂二糖脂對(duì)堆肥中木質(zhì)纖維素酶解的影響[D].長(zhǎng)沙：湖南大學(xué)，2009.

[2]張莉.打頂和鼠李糖脂處理對(duì)西瓜前期生長(zhǎng)及養(yǎng)分吸收效率的影響[D].杭州：浙江大學(xué)，2011.

[3]張澤霆.鼠李糖脂海水洗滌—生物降解修復(fù)沿海石油污染土壤的研究[D].舟山：浙江海洋大學(xué)，2018.

[4]劉菊.鼠李糖脂對(duì)西瓜枯萎病防治作用的研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2012.

[5]王蕾，毛玉玲，許漢亮，等.鼠李糖脂防治植物真菌病害研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（08）：90-95.

[6]Kim BS， Lee JY， Hwang BK. In vivo control and in vitro antifungal activity of rhamnolipid B， a glycolipid antibiotic， against Phytophthora capsica and Colletotrichum orbiculare [J]. Pest Management Science， 2000， 56（12）： 1029-1035.

[7] Stanghellini ME， Miller RM. Biosurfactants： Their identity and potential efficacy in the biological control of zoosporic plant pathogens [J]. Plant Disease， 1997， 81（1）： 4-12.

[8] De Jonghe K， De Dobbelaere I， Sarrazyn R， et al. Control ofPhytophthora cryptogea in the hydroponic forcing of witloof chicory with the rhamnolipid based-biosurfactant formulation PRO1[J]. Plant Pathology， 2005， 54（2）： 219-226.

[9] Goswami D， Handique PJ， Deka S. Rhamnolipid biosurfactant againstFusarium sacchari the causal organism of pokkah boeng disease of sugarcane[J]. Journal of Basic Microbiology， 2014， 54（6）： 548-557.

[10] Borah SN， Goswami D， Lahkar J， et al. Rhamnolipid produced by Pseudomonas aeruginosa SS14 causes complete suppression of wilt by Fusarium oxysporum f. sp. pisi in Pisum sativum[J]. BioControl， 2015， 60（3）： 375-385.

[11] Lahkar J， Borah SN， Deka S， et al. Biosurfactant of Pseudomonas aeruginosa JS29 against Alternaria solani： the causal organism of early blight of tomato [J]. BioControl， 2015， 60（3）： 401-411.

[12] Lahkar J， Goswami D， Deka S， et al. Novel approaches for application of biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa， for biocontrol of Colletotrichum capsica， responsible for anthracnose disease in chilli[J]. European Journal of Plant Pathology， 2018，150（1）： 57-71.

[13]Varnier A L， Sanchez L， Vatsa P， et al. Bacterial rhamnolipids are novel MAMPs conferring resistance to Botrytis cinerea in grapevine[J]. Plant， Cell & Environment， 2009， 32（2）： 178-193.

（責(zé)任編輯 周康）