分子伴侶對殼聚糖酶OUC-Csn21c在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的影響

初文琴，劉振，劉昕，毛相朝,2*

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266000； 2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島 266000)

殼聚糖酶具有巨大的工業(yè)應(yīng)用價值，主要用于酶解殼聚糖制備殼寡糖，殼寡糖與殼聚糖相比，具有較高的生理活性，如抗菌、抗氧化、抗腫瘤及降血壓等[1-2]。殼寡糖制備方法主要有物理化學(xué)法和酶法，與物理化學(xué)法相比，酶法制備具有反應(yīng)條件溫和、特異性強(qiáng)、無副產(chǎn)物、綠色環(huán)保和易控制等優(yōu)點[3]。因此，酶法(殼聚糖酶)制備殼寡糖已成為當(dāng)前研究的熱點。

殼聚糖酶主要通過野生菌株和構(gòu)建基因工程菌株的方法制備。目前已從自然界中分離純化出多株可產(chǎn)生殼聚糖酶的野生菌株，如Zitouni等[4]從Paenibacillussp. 1794中分離純化了一種耐熱殼聚糖酶Csn1794，純化后的比酶活可達(dá)122 U/mg；方祥年等[5]從球孢白僵菌Beauveriabassiana1316-V1中分離純化得到的殼聚糖酶的酶活可達(dá)45 U/mg。但是野生菌的殼聚糖酶產(chǎn)量較低，無法實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，因此，很多研究者致力于對不同來源的殼聚糖酶進(jìn)行異源高效表達(dá)，如分離于Bacillussp. TS的殼聚糖酶成功在大腸桿菌中表達(dá)，酶活可達(dá)186 U/mL[6]；分離于B.subtilisHD145的殼聚糖酶在Pichiapastoris中實現(xiàn)胞外表達(dá)，酶活可達(dá)9 000 U/mg[7]；分離于B.subtilis168的殼聚糖酶在B.subtilisPT5中成功表達(dá)，且在信號肽aprE介導(dǎo)下，使胞外酶活達(dá)到(156.00±4.68) U/mL[8]。

本研究表達(dá)的殼聚糖酶OUC-Csn21c已在大腸桿菌(Escherichiacoli)中成功表達(dá)(粗酶活可達(dá)100.4 U/mg)，該酶屬于糖苷水解酶GH-46家族，是一種外切酶，其酶解產(chǎn)物為D-氨基葡萄糖和殼二糖，可用于工業(yè)生產(chǎn)氨基葡萄糖和殼寡糖[9]。本研究選擇的宿主為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，相較于大腸桿菌，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有一些自身優(yōu)勢[10]：1)安全無毒，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)將其評為生物安全(generally regarded as safe，GRAS)菌株；2)具有較高的同源蛋白質(zhì)和異源蛋白質(zhì)分泌能力。

為進(jìn)一步提高殼聚糖酶OUC-Csn21c在枯草芽孢桿菌中的胞外表達(dá)量，本研究探究了2種分子伴侶對其胞外表達(dá)量的影響。其中分子伴侶是介導(dǎo)其他多肽正確組裝的一類蛋白質(zhì)家族，但本身并不是蛋白質(zhì)最終結(jié)構(gòu)的組成部分[11]，其功能是確保蛋白質(zhì)的正確組裝。本研究選擇PrsA和CsaA 2種分子伴侶是，因其來源于枯草芽孢桿菌，且有研究證明二者可提高胞外蛋白的分泌量。研究發(fā)現(xiàn)，PrsA作用于細(xì)胞膜與細(xì)胞壁之間的蛋白[12-13]。楊何寶等[14]通過整合分子伴侶PrsA使得蛋白酶的活性提高了23%；陳景奇[15]通過整合分子伴侶PrsA使淀粉酶AmyLM2和AmyS的酶活分別提高了3.2倍和5.5倍。CsaA通過提高分泌前蛋白的轉(zhuǎn)位能力，使其更容易被突變SecA蛋白識別并作用，或者是通過刺激提高SecA蛋白的轉(zhuǎn)位活性來實現(xiàn)外源蛋白的胞外分泌[16]。蔣紅亮等[17]通過整合分子伴侶CsaA使青霉素酰化酶的酶活力提高66%。

本文選擇枯草芽孢桿菌作為表達(dá)宿主，成功實現(xiàn)了殼聚糖酶OUC-Csn21c的胞外表達(dá)，并在此基礎(chǔ)上探究了2種分子伴侶(PrsA和CsaA)對其胞外表達(dá)量的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 試劑材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

本文所用菌株及質(zhì)粒如表1所示。

表1 本研究所用菌株及質(zhì)粒Tab.1 Strains and plasmids used in this research.

1.1.2 實驗試劑及儀器設(shè)備

本研究所用到的P505-d1聚合酶(PhantaTMMax Super-Fidelity DNA polymerase)和Taq聚合酶混合體系(2×Taq Master Mix)均購自南京諾唯贊生物科技有限公司(Vazyme)。快速質(zhì)粒小提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司(TIANGEN)。膠回收試劑盒購自美國OMEGA公司。PCR引物由青島生工生物科技有限公司合成。

本文所用培養(yǎng)基制備過程分別為：

1)LB培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨，10 g/L氯化鈉，5 g/L酵母提取物，固體LB培養(yǎng)基中添加1.5%～2.0%的瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min后備用。

2)復(fù)蘇培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，山梨醇91 g/L，甘露醇69 g/L，115 ℃滅菌30 min后備用。

3)電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基：山梨醇91 g/L，甘露醇91 g/L，葡萄糖100 g/L，115 ℃滅菌30 min后備用。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴(kuò)增與純化

殼聚糖酶OUC-Csn21c基因來源于鏈霉菌StreptomycesalbolongusATCC 27414，啟動子Pshuttle09[18]由青島生工生物合成，分子伴侶PrsA和CsaA基因均來自于B.subtilisWB800基因組。以上所有片段均通過PCR方法制備，片段Pshuttle09-prsA和Pshuttle09-csaA則是以融合PCR的方式分別通過引物43-09-F和prsA-R、csaA-R獲得。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。使用膠回收試劑盒對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。

1.2.2 目的片段與載體的連接

用無縫拼接試劑盒將ouc-csn21c整合到pP43NMK質(zhì)粒上，形成質(zhì)粒pP43NMK-Csn21c。然后，分別將Pshuttle09-prsA和Pshuttle09-csaA片段整合到pP43NMK-Csn21c上得到pP43NMK-Csn21c-PrsA和pP43NMK-Csn21c-CsaA。連接后的產(chǎn)物，通過化學(xué)法轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α并進(jìn)行陽性克隆驗證以及序列鑒定。

1.2.3 陽性克隆驗證與質(zhì)粒提取

用無菌牙簽挑取平板上單菌落至含10 μL無菌水的1.5 mL離心管中混勻，然后吸取2 μL至PCR小管中，使用2×Taq Master Mix進(jìn)行PCR驗證，PCR驗證體系為：2 μL模板DNA，6.25 μL 2×Taq Master Mix，3.25 μL無菌水，1μL DMSO。驗證條帶正確，則向剩余8 μL菌液的1.5 mL離心管內(nèi)加入800 μL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃ 200 rpm培養(yǎng)4～6 h后送至青島生工公司進(jìn)行序列測定。序列測定正確的用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。

表2 實驗所用引物序列Tab.2 Primer sequence used in this research.

1.2.4 枯草芽孢桿菌B.subtilisWB800感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化

接種環(huán)蘸取凍存的B.subtilisWB800在無抗的LB固體培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于10 mL無抗LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 200 rpm培養(yǎng)過夜，取3 mL培養(yǎng)物接種至40 mL 含0.5 mol/L山梨醇的LB培養(yǎng)基，37 ℃ 200 rpm培養(yǎng)至菌液濃度OD600達(dá)到0.85～0.95之間。然后，將菌液冰浴10 min，4 ℃ 5 000 rpm離心5 min，收集菌體沉淀。用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基15～20 mL重懸菌體，4 ℃ 5 000 rpm離心5 min，如此重復(fù)3次。然后，用電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基1.0 mL重懸菌體，每管分裝100 μL。

取1 μg左右重組質(zhì)粒加入到100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，1.8 kV電擊1次，然后迅速用移液槍吸取1.0 mL復(fù)蘇培養(yǎng)基吹打混勻，轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP(eppendorf)管中，隨后37 ℃ 200 rpm培養(yǎng)3 h，然后將菌液濃縮后涂布到含50 μg/mL卡納霉素抗性的平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。

1.2.5 酶活測定

將10 μL發(fā)酵上清液加入到190 μL 2%的殼聚糖溶液中，55 ℃反應(yīng)15 min后加入300 μL DNS溶液，沸水浴10 min終止反應(yīng)，取200 μL于OD540下測定其吸光度值[8]，通過DNS的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定其最終酶活。

酶活定義：每分鐘水解殼聚糖產(chǎn)生1 μmol/L還原糖所需要的酶量為一個酶活單位(U)。

1.2.6 SDS-PAGE蛋白電泳

樣品處理：取48 h發(fā)酵液8 000 rpm離心10 min，菌體用等量pH 8.0的Tris-HCl緩沖液重新懸浮。加入1.0 mL溶菌酶置于37 ℃反應(yīng)30 min，破壞其細(xì)胞壁。隨后超聲破碎20 min，破碎液在8 000 rpm條件下離心15 min。分別取發(fā)酵上清、破碎液上清和破碎后沉淀各32 μL加入8 μL 5×loading buffer，煮沸10 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖酶OUC-Csn21c的異源表達(dá)

構(gòu)建的質(zhì)粒如圖1a所示，將殼聚糖酶ouc-csn21c插入到質(zhì)粒pP43NMK中。以鏈霉菌S.albolongusATCC 27414基因組為模板，成功擴(kuò)增殼聚糖酶ouc-csn21c基因序列。圖1b為殼聚糖酶ouc-csn21c擴(kuò)增結(jié)果，序列長度為804 bp。通過DNAMAN軟件預(yù)測該酶的分子量為29.6 kDa，蛋白電泳條帶與預(yù)測大小相符(圖1c)。

2.2 含分子伴侶PrsA和CsaA質(zhì)粒的構(gòu)建

將分子伴侶蛋白PrsA和CsaA分別插入到已構(gòu)建成功的質(zhì)粒pP43NMK-Csn21c上，同時用組成型啟動子Pshuttle09對分子伴侶進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，質(zhì)粒圖譜如圖2a、2b所示。分別擴(kuò)增片段Pshuttle09、prsA和csaA，然后用引物43-09-F和prsA-R進(jìn)行融合PCR，得到片段Pshuttle09-prsA，大小為1 218 bp，用引物43-09-F和csaA-R擴(kuò)增得到片段Pshuttle09-csaA，大小為672 bp(圖2c)。陽性克隆鑒定結(jié)果顯示，質(zhì)粒的相應(yīng)位置插入與理論大小一致的片段(圖3)。測序結(jié)果顯示序列并未發(fā)生突變，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 重組菌株的表達(dá)

2.3.1 分子伴侶PrsA和CsaA對殼聚糖酶OUC-Csn21c胞外酶活的影響

重組菌株WB800/pP43NMK-Csn21c在24 h時生長已進(jìn)入穩(wěn)定期(圖4a)，OD600可達(dá)1.4左右。酶活基本在24 h時達(dá)到較高水平，之后基本保持穩(wěn)定。重組菌株WB800/pP43NMK-Csn21c-PrsA(圖4b)和WB800/pP43NMK-Csn21c-CsaA(圖4c)在24 h時菌體濃度均已達(dá)到最高(OD600可達(dá)1.4)，重組菌株WB800/pP43NMK-Csn21c-PrsA的胞外酶活同原始菌株相同，也在24 h時達(dá)到較高水平，之后基本保持穩(wěn)定，但是重組菌株WB800/pP43NMK-Csn21c-CsaA在24 h后胞外殼聚糖酶OUC-Csn21c的酶活仍在增長，直到48 h酶活達(dá)到最高，之后略有下降。

由于重組菌株均在48 h酶活達(dá)到最高，所以取各重組菌株發(fā)酵48 h的酶活結(jié)果進(jìn)行比較，分子伴侶CsaA可使胞外殼聚糖酶OUC-Csn21c的酶活提高21.83%(圖4d)，達(dá)4.76 U/mL。而分子伴侶PrsA卻使其酶活下降，可能是由于分子伴侶PrsA的過量表達(dá)抑制了殼聚糖酶OUC-Csn21c的表達(dá)。

2.3.2 分子伴侶PrsA和CsaA對殼聚糖酶OUC-Csn21c外源表達(dá)量的影響

根據(jù)以上胞外殼聚糖酶OUC-Csn21c的胞外酶活結(jié)果，可以初步確定分子伴侶CsaA可以使其胞外表達(dá)量提高，為進(jìn)一步確認(rèn)，本研究對重組菌株的胞內(nèi)外蛋白進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析(圖5)，對比泳道5～8(胞外)發(fā)現(xiàn)，重組菌株WB800/pP43NMK-Csn21c-CsaA的發(fā)酵液上清中，殼聚糖酶OUC-Csn21c的條帶較深，泳道1～4為細(xì)胞破碎液的上清(胞內(nèi))；在29.6 kDa處，重組菌株WB800/pP43NMK-Csn21c和WB800/pP43NMK-Csn21c-PrsA均有條帶，而重組菌株WB800/pP43NMK-Csn21c-CsaA的條帶較淺。由此認(rèn)為，分子伴侶CsaA可提高殼聚糖酶OUC-Csn21c的胞外分泌量。泳道9～12(包含體)可以看出，3個重組菌株的破碎液沉淀中均有與殼聚糖酶OUC-Csn21c大小一致的條帶，且條帶深淺基本一致，推斷分子伴侶PrsA和CsaA對殼聚糖酶OUC-Csn21c胞內(nèi)的正確折疊無明顯促進(jìn)作用。

3 結(jié)論

本研究以枯草芽孢桿菌B.subtilisWB800為表達(dá)宿主，成功表達(dá)殼聚糖酶OUC-Csn21c，該酶分子量為29.6 kDa。經(jīng)探究分子伴侶PrsA和CsaA對其胞外酶活的影響，發(fā)現(xiàn)分子伴侶CsaA可使其胞外酶活提高21.83%，為4.76 U/mL，而分子伴侶PrsA卻使其胞外酶活降低。進(jìn)一步利用SDS-PAGE蛋白電泳對提高胞外表達(dá)量的原因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)分子伴侶CsaA通過提高殼聚糖酶OUC-Csn21c的胞外分泌量來提高其胞外表達(dá)量。本研究為殼聚糖酶在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)提供了一定的參考價值。