• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    單株豬紅斑丹毒絲菌的生物學(xué)特性及耐藥性分析

    2020-10-17 06:56:42葛晨玲蔣康富石大麗霍孔林宋星星韋德源胡傳活王曉曄
    中國動物傳染病學(xué)報 2020年5期
    關(guān)鍵詞:絲菌丹毒紅斑

    葛晨玲,蔣康富,石大麗,霍孔林,宋星星,韋德源,胡傳活,王曉曄

    (1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,南寧 530000;2.東營市畜牧局,東營 257091)

    紅斑丹毒絲菌(Erysipelothx rhusiopathiae)是一種纖細或微彎曲的兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌,可廣泛感染各種動物引發(fā)丹毒[1]。豬感染紅斑丹毒絲菌后,通過扁桃體和消化道及其他淋巴組織進入血液,主要臨床表現(xiàn)為急性敗血癥、皮膚疹塊、慢性心內(nèi)膜炎和關(guān)節(jié)炎[2]。豬丹毒曾作為我國“三大豬傳染性病”之一,嚴重影響我國畜牧業(yè)健康發(fā)展。隨著疫苗的研制與使用,我國規(guī)?;i場豬丹毒的發(fā)病明顯減少,僅小型豬場和散養(yǎng)戶有零星發(fā)病[3]。但自2012年底以來,豬丹毒在廣西多地復(fù)發(fā)[4],與此同時,中國上海、湖南、安徽、江蘇、山東等地也頻頻報道感染豬丹毒的案例,并逐年遞增呈現(xiàn)卷土重來的趨勢。

    廣西南寧市武鳴區(qū)某規(guī)模化肉豬場有60日齡左右保育豬700余頭,2018年7月,工作人員巡欄發(fā)現(xiàn)急性死亡豬1只,該豬體重可達百余斤,全身紅熱,耳、頸、腹部皮膚發(fā)紺,背部出現(xiàn)菱形或方形疹塊且稍隆起于皮膚表面。與病死豬同欄的大部分豬精神萎靡,不愿走動,臥地不起,體溫可達40℃~42℃,呼吸困難,黏膜發(fā)紺,體表淋巴結(jié)腫大,背部也出現(xiàn)菱形疹塊,見圖1。

    圖1 發(fā)病豬臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of sick pigs

    現(xiàn)場剖檢病死豬,眼觀呈現(xiàn)典型的急性敗血癥癥狀。腦部大量充血,腸系膜淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)腫脹充血,呈現(xiàn)暗紅色;肺部鈍圓、腫大,表面覆蓋有纖維素樣物質(zhì)。脾臟呈現(xiàn)褐紅色長條狀,明顯的淤血腫脹;氣管內(nèi)含有大量粉紅色泡沫,關(guān)節(jié)腔內(nèi)有積液,見圖2。本研究通過對分離到的細菌進行生物學(xué)特性和耐藥基因分析,以期掌握其生物學(xué)特性并為臨床用藥提供指導(dǎo)性意見。

    圖2 死亡豬剖檢圖Fig.2 Anatomy of a dead pig

    1 材料和方法

    1.1 樣品來源2018年7月,廣西武鳴區(qū)某規(guī)模化肉豬場病死保育豬(60日齡左右)。

    1.2 主要培養(yǎng)基和試劑TSB營養(yǎng)瓊脂、綿羊血瓊脂固體培養(yǎng)基購自南寧百賽斯生物試劑公司;2×TaqMasterMix、DL2000 DNA marker及細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)購自天根生物科技有限公司;藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

    1.3 細菌的分離鑒定將采集的樣品在無菌操作環(huán)境下,用平板劃線的方式接種于綿羊血瓊脂固體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)20 h,挑取大小一致,色澤鮮明的單個可疑菌落進行革蘭氏染色并鏡檢,以觀察細菌的形態(tài)及生物學(xué)特性。

    1.4 細菌的16S rRNA的PCR檢測參照細菌DNA提取試劑盒說明書方法提取分離菌株基因組DNA。設(shè)計16S rRNA通用引物。上游引物:5'-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3',下游引物:5'-ACGGCTACC TTGTTACGACTT-3',引物由華大基因合成。反應(yīng)體系(25 μL):2×TaqMaster Mix 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板2 μL,用ddH2O補至25μL。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性50 s,52℃退火30 s,72℃延伸40 s,共35個循環(huán);72℃終延伸10 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后膠回收后測序,測序結(jié)果與GenBank中參考株的基因序列進行同源性比較。

    1.5 生物被膜體外形成測定參考文獻[5]利用TSB肉湯培養(yǎng)分離菌株20 h后,按1∶1000稀釋后,加入到聚丙乙烯無菌培養(yǎng)板中,每孔200 μL;以無菌肉湯作陰性對照。將培養(yǎng)孔分別在28℃和37℃靜置培養(yǎng)24 h,棄菌液洗滌烘干后,采用結(jié)晶紫染色,用乙酸充分溶解后測定570 nm處D值。將陰性對照的平均D值加上其標(biāo)準(zhǔn)差定義為ODC,待測菌株D值與ODC比較,將生物膜形成能力分為4個等級,陰性(-):D5704ODC。

    1.6 毒力基因檢測參考文獻[6-7]擴增神經(jīng)氨酸酶(Sialidase)、莢膜多糖(CPS-A)、黏附素(RspA)、表面保護性抗原(SPaA)4種毒力因子,具體信息見表1,由華大基因合成。反應(yīng)體系(25 μL):2×TaqMaster Mix 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板2 μL,用ddH2O補至25 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,相應(yīng)的退火溫度具體見表1;退火30 s,72℃延伸60 s,共34個循環(huán);72℃終延伸5 min。

    表1 毒力基因引物序列信息Table 1 Sequence information of the primers for virulence gene

    1.7 藥敏試驗采用WTO推薦的Kirby-Bauer(K-B)紙片瓊脂擴散法測定22種抗菌藥物的耐藥性,參照美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)文件(M100-S21)進行結(jié)果判定。

    1.8 耐藥基因檢測參考文獻[8-9]擴增β-內(nèi)酰胺酶類blaOXA、blaSHV、blaTEM和磺胺類Sul1、Sul2共5種耐藥基因,具體信息見表2,由華大基因合成。反應(yīng)體系(25 μL):2×TaqMaster Mix 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板2 μL,用ddH2O補至25 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,相應(yīng)的退火溫度見表1;退火30 s,72℃延伸60 s,共34個循環(huán);72℃終延伸5 min。

    2 結(jié)果

    2.1 細菌的分離鑒定該菌落在含有5%胎牛血清和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)的綿羊血瓊脂固體培養(yǎng)基上表現(xiàn)為灰白色、半透明、邊緣齊整、如針尖麥芒樣細小的菌落。經(jīng)鏡檢,該菌呈現(xiàn)稍直或稍彎的桿狀,以單個或鏈狀存在,有絲狀菌毛,無芽孢,無運動性的革蘭氏陽性菌,疑似豬紅斑丹毒絲菌,將其命名為GXWMZD1,見圖3。

    表2 耐藥基因引物Table2 Primers for drug resistance genes

    圖3 細菌的分離鑒定Fig.3 Isolation and identification of bacteria

    2.2 細菌的16S rRNA的PCR檢測分離菌株經(jīng)16S rRNA PCR擴增,結(jié)果顯示,擴增出1條1437 bp的條帶(圖4),與預(yù)期目標(biāo)條帶大小一致,與陽性對照相同,且陰性未擴增出條帶,將測序得到的序列與NCBI公布的序列進行同源性比對,結(jié)果表明,分離菌株與豬紅斑丹毒絲菌在基因關(guān)系上最接近,同源性高達99.9%,證實該分離菌株為豬紅斑丹毒絲菌。

    圖4 細菌的16S rRNA的PCR檢測Fig.4 PCR detection of bacterial 16S rRNA

    2.3 分離菌株的同源性及進化樹分析利用DNAStar軟件對所測序列和GenBank中公布的國內(nèi)外豬丹毒桿菌的16S rRNA序列進行比對,具體菌株信息見表2,該菌株與比對菌株的同源性基本為91.9%~99.6%(圖6),與中國廣西2014年分離株Er.GXGG-1同源性最高,可達99.6%。經(jīng)遺傳進化樹分析,結(jié)果表明,分離菌株GXWMZD1與來自中國廣東的GD-GZ菌株位于同一分支上,與ZYL、SY1027、WC14.1、QY13.1、Er.GXGG-1等菌株分離地同為中國,且處于同一分支上(圖7)。

    表3 同源關(guān)系比對菌株信息表Table 3 Homologous relationship comparison strain information table

    圖5 16S rRNA基因核苷酸序列同源性比對Fig.5 Homology comparison of 16S rRNA gene nucleotide sequence

    圖6 16S rRNA基因核苷酸序列遺傳進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of nucleotide sequence of 16S rRNA gene

    2.4 生物被膜體外形成測定結(jié)果采用微孔板半定量粘附法對生物被膜體外形成進行測定,結(jié)果顯示,分離菌株在28℃培養(yǎng)24 h后,D570的平均值為1.615,標(biāo)準(zhǔn)差為0.322,陰性對照為0.157,標(biāo)準(zhǔn)差為0.090,表明分離菌株在28℃形成能力適中(4+),分離菌株在37℃培養(yǎng)24 h后,D570的平均值為0.517,標(biāo)準(zhǔn)差為0.177,陰性對照為0.090,標(biāo)準(zhǔn)差為0.011,表明菌株在37℃形成能力適中(4+),比較分離菌株在28℃和37℃形成生物被膜的能力顯示,28℃更有利于分離菌株的生物被膜形成(圖7、8)。

    圖7 生物被膜體外形成結(jié)果Fig.7 Results of biofilm formation in vitro

    圖8 生物被膜體外形成結(jié)果統(tǒng)計圖Fig.8 Results of statistical graph biofilm formation

    2.5 毒力基因檢測結(jié)果通過PCR的方法擴增莢膜多糖(CPS-A)、黏附素(RspA)、表面保護性抗原(SPaA)、神經(jīng)氨酸酶(Sialidase)4種毒力因子。結(jié)果表明,擴增出CPS-A(1168 bp)、RspA(1186 bp)、SPaA(1800 bp)3種毒力因子,條帶大小與預(yù)期目標(biāo)條帶大小一致,與陽性對照相同,且陰性未擴增出條帶,神經(jīng)氨酸酶(Sialidase)未擴增出條帶,具體結(jié)果見圖9。

    圖9 毒力因子檢測結(jié)果Fig.9 Results of virulence factor test

    2.6 藥物敏感性檢測結(jié)果通過WTO推薦的Kirby-Bauer(K-B)紙片瓊脂擴散法測定22種抗菌藥物的耐藥性,參照美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)文件(M100-S21)進行結(jié)果判定。見表3,其中總耐藥率為68.18%(15/22)中介率為13.64%(3/22),僅對米諾環(huán)素、多西環(huán)素、恩諾沙星、氟苯尼考4種藥物敏感,敏感率只有18.18%(4/22)。對于氨基糖胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類7種藥物的耐藥率可到100.00%,β-內(nèi)酰胺類藥物除頭孢哌酮外,對其余的4種藥物均耐藥,占受試藥物的80.00%,但頭孢哌酮的抑菌環(huán)直徑可達20 mm,屬于中介的邊緣,其敏感度有進一步向耐藥轉(zhuǎn)化的趨勢。

    2.7 耐藥基因檢測藥敏結(jié)果顯示分離菌株對β-內(nèi)酰胺類、磺胺類的藥物耐藥率較高,進行針對性的耐藥基因擴增,擴增β-內(nèi)酰胺酶類blaOXA、blaSHV、blaTEM,磺胺類Sul1、Sul2共5種耐藥基因。PCR結(jié)果顯示(圖10),擴增出blaTEM(788 bp),Sul2(435 bp)2種耐藥基因,與目標(biāo)條帶的大小一致,陰性未擴增出條帶,該結(jié)果與藥敏實驗的結(jié)果呈現(xiàn)正相關(guān)。

    3 討論

    本研究從某規(guī)模化肉豬場急性死亡的保育豬(60日齡左右)中成功分離出1株豬紅斑丹毒絲菌,通過細菌的分離鑒定、16S rRNA的擴增、生物被膜的形成條件等方法對其生物學(xué)特性進行分析。細菌生物膜可作為一種生物屏障系統(tǒng),使存在于其中的菌體(被膜菌)相對于其單個浮游狀態(tài)的菌體(浮游菌)對抗菌藥物表現(xiàn)出更強的抗性[10],而胞外基質(zhì)能有效的抑制免疫細胞的吞噬作用[11]。生物膜一旦形成,膜內(nèi)細菌比浮游細菌耐藥性增加100~1000倍以上[12-13]。當(dāng)致病菌通過群體感應(yīng)效應(yīng)形成生物膜,則會導(dǎo)致頑固性疾病難以根治[14-15]。相較于37℃,該分離菌株在28℃時生物被膜體外形成的能力更強。夏季豬場的飼養(yǎng)環(huán)境的平均室溫可達28℃,一些圈舍設(shè)備、飼槽上的細菌可能乘機肆意生長,體外被膜的形成助長其對消毒劑的抗性,為疾病的形成提供了溫床。

    表4 藥物敏感性試驗結(jié)果Table 4 Results of drug sensitivity test

    圖10 分離細菌耐藥基因檢測Fig.10 Detection of isolated bacterial resistance genes

    本研究通過藥物敏感性試驗、耐藥基因的檢測等試驗方法,對分離菌株的耐藥情況進行鑒定。對于受試的22種藥物來說,該菌株僅對米諾環(huán)素、多西環(huán)素、恩諾沙星、氟苯尼考4種藥物敏感,敏感率僅為18.18%(4/22),且擴增出β-內(nèi)酰胺酶類blaTEM(788 bp),磺胺類Sul2(435 bp)2種耐藥基因。由此可見,該菌株的藥物敏感性差,耐藥譜廣,多重耐藥情況嚴重。本研究與陸英杰等[16]對從廣東分離的5株豬紅斑丹毒絲菌均對林可霉素耐藥、恩諾沙星敏感的結(jié)果一致,與陸萍等[17]對安徽分離到的28株豬紅斑丹毒絲菌對氨 西林、青霉素敏感的試驗結(jié)果略有差異,與唐愛明等[18]對湖南長沙分離到的3株豬紅斑丹毒絲菌對磺胺類藥物耐藥的結(jié)果一致,與曾文斌等[19]從江西分離到的2株豬丹毒桿菌對β-內(nèi)酰胺酶類藥物高度敏感的試驗結(jié)果并不相符,這可能與臨床用藥習(xí)慣有關(guān)[20]。目前,大多數(shù)對于豬丹毒紅斑絲菌的研究僅停留于各種藥物的敏感性,并未對耐藥基因進行檢測。本研究表明耐藥表型與耐藥基因呈現(xiàn)正相關(guān),該菌株為復(fù)合基因型耐藥菌株,應(yīng)加強耐藥性檢測,謹防敏感菌轉(zhuǎn)化為耐藥菌。

    綜上所述,本研究已成功分離出1株豬紅斑丹毒絲菌,并對其生物學(xué)特性進行測定,該菌株生長迅速,生物被膜體外形成能力強,擴增出莢膜多糖CPS-A、黏附素RspA、表面保護性抗原SPaA共3種毒力基因,多重耐藥情況嚴重,擴增出β-內(nèi)酰胺酶類blaTEM、磺胺類Sul2 2種耐藥基因。

    猜你喜歡
    絲菌丹毒紅斑
    曹奕治療丹毒臨床經(jīng)驗
    黃馬酊敷料外敷治療急性下肢丹毒的療效觀察
    木星的小紅斑
    丹毒夏季易發(fā),防治做到4點
    舌重癥多形性紅斑1例報道
    Queyrat增殖性紅斑1例
    丹毒的臨床研究進展
    基于groEL基因序列鑒定丹毒絲菌屬菌種
    孢子絲菌病患者皮損中Toll 樣受體2 、4 及髓樣分化因子88的表達
    16株中國東北地區(qū)臨床孢子絲菌菌種分子生物分類學(xué)研究
    无人区码免费观看不卡| 99久久人妻综合| 国产精品偷伦视频观看了| 久热爱精品视频在线9| 高清在线国产一区| 国产1区2区3区精品| 99国产极品粉嫩在线观看| 日韩有码中文字幕| 国产男靠女视频免费网站| 香蕉久久夜色| 真人一进一出gif抽搐免费| 狂野欧美激情性xxxx| 午夜福利欧美成人| 色在线成人网| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲av成人av| 亚洲成国产人片在线观看| 又大又爽又粗| 大香蕉久久成人网| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美精品一区二区免费开放| 麻豆av在线久日| 天堂中文最新版在线下载| 99精国产麻豆久久婷婷| www.999成人在线观看| av在线播放免费不卡| 国产男靠女视频免费网站| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 又黄又粗又硬又大视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产黄色免费在线视频| 在线永久观看黄色视频| 久久影院123| 国产成人欧美在线观看| 热99re8久久精品国产| 欧美日韩乱码在线| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲av熟女| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 搡老岳熟女国产| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 色综合婷婷激情| 国产精品电影一区二区三区| 精品第一国产精品| 国产亚洲欧美精品永久| 国产精品偷伦视频观看了| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲美女黄片视频| 久久婷婷成人综合色麻豆| 亚洲精品成人av观看孕妇| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 老司机在亚洲福利影院| 国产精品 欧美亚洲| 久久久国产成人免费| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 久久久精品欧美日韩精品| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 最好的美女福利视频网| 久久香蕉精品热| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美丝袜亚洲另类 | 女人被狂操c到高潮| 精品免费久久久久久久清纯| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 90打野战视频偷拍视频| 国产三级在线视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 日本vs欧美在线观看视频| cao死你这个sao货| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲 国产 在线| 欧美日韩精品网址| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品永久免费网站| 免费搜索国产男女视频| 国产av一区二区精品久久| 97人妻天天添夜夜摸| 女性被躁到高潮视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 午夜日韩欧美国产| 久久 成人 亚洲| 欧美乱妇无乱码| 亚洲av电影在线进入| 久久久国产精品麻豆| 黑丝袜美女国产一区| 国产精品国产av在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 老熟妇仑乱视频hdxx| 在线观看免费高清a一片| 十分钟在线观看高清视频www| 一夜夜www| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 嫩草影视91久久| 一二三四在线观看免费中文在| 看黄色毛片网站| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 中国美女看黄片| 国产亚洲欧美在线一区二区| 女性生殖器流出的白浆| www.999成人在线观看| 亚洲美女黄片视频| 热re99久久精品国产66热6| 超碰成人久久| 成人影院久久| 国产成人欧美在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 满18在线观看网站| 国产精品一区二区三区四区久久 | 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产精品1区2区在线观看.| 一级毛片精品| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 久久热在线av| 久久久久久大精品| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产又色又爽无遮挡免费看| 一进一出好大好爽视频| 亚洲视频免费观看视频| 黄片小视频在线播放| 国产一区二区三区综合在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 两人在一起打扑克的视频| 美女 人体艺术 gogo| 桃色一区二区三区在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 免费观看人在逋| 男女下面插进去视频免费观看| 国产午夜精品久久久久久| 日本五十路高清| 午夜影院日韩av| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 中文亚洲av片在线观看爽| 成人特级黄色片久久久久久久| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲五月色婷婷综合| 看片在线看免费视频| 搡老乐熟女国产| 精品无人区乱码1区二区| 青草久久国产| 亚洲国产欧美一区二区综合| 免费观看人在逋| 国产精品日韩av在线免费观看 | 一边摸一边做爽爽视频免费| 欧美性长视频在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费 | netflix在线观看网站| 亚洲在线自拍视频| 正在播放国产对白刺激| 一级片'在线观看视频| 在线观看免费午夜福利视频| 午夜免费激情av| 最近最新中文字幕大全免费视频| 1024香蕉在线观看| 亚洲第一av免费看| 三上悠亚av全集在线观看| 色在线成人网| 国产精品久久久人人做人人爽| 日本精品一区二区三区蜜桃| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 中文字幕人妻丝袜制服| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美日韩av久久| 亚洲精品在线美女| 国产精品影院久久| 久久久久久人人人人人| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 12—13女人毛片做爰片一| 在线观看免费视频日本深夜| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久热在线av| 丁香六月欧美| 久久国产亚洲av麻豆专区| 99热国产这里只有精品6| 亚洲欧美激情综合另类| 99久久国产精品久久久| 老司机福利观看| 国产成人av激情在线播放| 国产99久久九九免费精品| 亚洲国产欧美网| 亚洲av片天天在线观看| 色综合婷婷激情| 啦啦啦在线免费观看视频4| 精品国内亚洲2022精品成人| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 正在播放国产对白刺激| 级片在线观看| 正在播放国产对白刺激| 成人国语在线视频| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 丁香六月欧美| 免费日韩欧美在线观看| 精品国产亚洲在线| 在线观看www视频免费| 少妇 在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 午夜视频精品福利| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 午夜a级毛片| 老司机深夜福利视频在线观看| 在线av久久热| 日韩高清综合在线| 午夜精品在线福利| 男人操女人黄网站| 久久草成人影院| 国产亚洲欧美精品永久| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 无限看片的www在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 精品第一国产精品| 亚洲午夜理论影院| 欧美国产精品va在线观看不卡| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 色老头精品视频在线观看| 国产乱人伦免费视频| 久久国产精品影院| 欧美成人午夜精品| 国产99白浆流出| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 久久久久久人人人人人| 亚洲全国av大片| 亚洲成人免费av在线播放| 国产真人三级小视频在线观看| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产精品久久久人人做人人爽| 精品乱码久久久久久99久播| 国产午夜精品久久久久久| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产av精品麻豆| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲人成电影观看| 成年人黄色毛片网站| 三级毛片av免费| 91麻豆av在线| 欧美最黄视频在线播放免费 | 国产视频一区二区在线看| 欧美日韩黄片免| 成人国产一区最新在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 丰满的人妻完整版| 欧美激情极品国产一区二区三区| 精品免费久久久久久久清纯| 女性生殖器流出的白浆| 一夜夜www| 成人免费观看视频高清| 国产伦人伦偷精品视频| 国产一区二区激情短视频| 视频在线观看一区二区三区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | av网站在线播放免费| 久久久久久久久免费视频了| 国产成+人综合+亚洲专区| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲自拍偷在线| 1024香蕉在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 精品午夜福利视频在线观看一区| 中文字幕av电影在线播放| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲精品在线美女| 啦啦啦免费观看视频1| videosex国产| 日韩人妻精品一区2区三区| 热99re8久久精品国产| 啦啦啦在线免费观看视频4| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲成人免费av在线播放| 国产精品免费一区二区三区在线| 黄色视频不卡| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲人成电影观看| 亚洲欧美激情综合另类| 黑人猛操日本美女一级片| 国产激情欧美一区二区| 在线观看舔阴道视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 韩国精品一区二区三区| 午夜福利欧美成人| 免费高清视频大片| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 一级,二级,三级黄色视频| 久久久国产成人精品二区 | 亚洲专区国产一区二区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久久久久大精品| 99久久国产精品久久久| 亚洲精品av麻豆狂野| 悠悠久久av| 长腿黑丝高跟| 久久香蕉激情| 久久青草综合色| ponron亚洲| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 日韩av在线大香蕉| 女人被狂操c到高潮| 99精品久久久久人妻精品| 操出白浆在线播放| 日日爽夜夜爽网站| 欧美人与性动交α欧美软件| 不卡av一区二区三区| 丰满饥渴人妻一区二区三| 欧美日本亚洲视频在线播放| 麻豆久久精品国产亚洲av | 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 欧美精品一区二区免费开放| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品久久久久成人av| 好男人电影高清在线观看| 国产精品国产av在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 色播在线永久视频| 久久久久亚洲av毛片大全| 88av欧美| 男女之事视频高清在线观看| 99香蕉大伊视频| 日韩欧美在线二视频| 午夜91福利影院| 亚洲三区欧美一区| 日本欧美视频一区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 中文字幕人妻熟女乱码| 伦理电影免费视频| 香蕉久久夜色| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 成在线人永久免费视频| 制服诱惑二区| 高清在线国产一区| 国产精品免费视频内射| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美午夜高清在线| 日韩大码丰满熟妇| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲,欧美精品.| 一区二区三区精品91| xxx96com| 丝袜在线中文字幕| 久久精品影院6| 制服诱惑二区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产主播在线观看一区二区| 久久精品91无色码中文字幕| 在线av久久热| 搡老熟女国产l中国老女人| 自线自在国产av| videosex国产| 桃色一区二区三区在线观看| 色综合婷婷激情| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲精品美女久久av网站| 一级作爱视频免费观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 999精品在线视频| 啦啦啦 在线观看视频| 欧美日韩一级在线毛片| 淫妇啪啪啪对白视频| 在线观看免费视频日本深夜| 1024香蕉在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 999久久久国产精品视频| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| av福利片在线| 我的亚洲天堂| 一区二区三区激情视频| 精品一品国产午夜福利视频| 日本a在线网址| 成人国语在线视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| ponron亚洲| 黄色视频不卡| 麻豆国产av国片精品| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 一边摸一边做爽爽视频免费| 在线观看免费视频网站a站| 国产亚洲精品久久久久5区| 操美女的视频在线观看| 黑人操中国人逼视频| 99re在线观看精品视频| a在线观看视频网站| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲欧美激情在线| 午夜免费观看网址| a级毛片在线看网站| 欧美中文综合在线视频| 成年版毛片免费区| 欧美黑人精品巨大| 老鸭窝网址在线观看| 精品久久久久久成人av| 免费日韩欧美在线观看| 日本欧美视频一区| 高清黄色对白视频在线免费看| 婷婷丁香在线五月| 日韩国内少妇激情av| 亚洲美女黄片视频| 免费观看人在逋| 99久久综合精品五月天人人| 欧美精品啪啪一区二区三区| 欧美在线黄色| 51午夜福利影视在线观看| 91麻豆av在线| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 母亲3免费完整高清在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 久久国产精品影院| 国产精品免费一区二区三区在线| 午夜免费激情av| 国产精品一区二区在线不卡| 妹子高潮喷水视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 午夜福利免费观看在线| 首页视频小说图片口味搜索| 老司机在亚洲福利影院| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| x7x7x7水蜜桃| 欧美日韩精品网址| 欧美乱色亚洲激情| 精品乱码久久久久久99久播| 老司机午夜十八禁免费视频| 激情在线观看视频在线高清| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产成人欧美在线观看| a级毛片黄视频| 国产91精品成人一区二区三区| av福利片在线| a级毛片黄视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久天堂一区二区三区四区| 国产av又大| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 一级作爱视频免费观看| 咕卡用的链子| 国产欧美日韩一区二区三| 国产极品粉嫩免费观看在线| 又黄又粗又硬又大视频| 一进一出好大好爽视频| 久久久国产成人免费| 国产亚洲精品一区二区www| 午夜福利欧美成人| 99热国产这里只有精品6| 咕卡用的链子| 一a级毛片在线观看| 两性夫妻黄色片| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 在线观看66精品国产| av免费在线观看网站| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 日本一区二区免费在线视频| 高清欧美精品videossex| 丰满的人妻完整版| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 91九色精品人成在线观看| 国产不卡一卡二| 成年人黄色毛片网站| 久久精品国产综合久久久| 日韩精品免费视频一区二区三区| 嫁个100分男人电影在线观看| 在线国产一区二区在线| 岛国视频午夜一区免费看| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久久久久大精品| 天堂影院成人在线观看| 国产野战对白在线观看| 久久久久九九精品影院| 日韩免费高清中文字幕av| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产精品久久电影中文字幕| www.自偷自拍.com| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲专区字幕在线| 黄色视频不卡| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久人人97超碰香蕉20202| 丝袜人妻中文字幕| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产成年人精品一区二区 | 亚洲成人久久性| 最近最新免费中文字幕在线| 精品国产国语对白av| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲av电影在线进入| av天堂久久9| 亚洲精品一区av在线观看| 69精品国产乱码久久久| 热99国产精品久久久久久7| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产激情久久老熟女| 午夜视频精品福利| 亚洲精华国产精华精| av电影中文网址| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲精品国产色婷婷电影| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久精品成人免费网站| 9191精品国产免费久久| 99国产精品免费福利视频| 亚洲avbb在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲三区欧美一区| 午夜福利在线观看吧| 男男h啪啪无遮挡| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 搡老乐熟女国产| 国产不卡一卡二| 成人国语在线视频| 自线自在国产av| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲成人久久性| 亚洲精华国产精华精| 香蕉久久夜色| 久久久水蜜桃国产精品网| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 自线自在国产av| 国产精品成人在线| 国产精品国产高清国产av| 亚洲av电影在线进入| 淫妇啪啪啪对白视频| 日本 av在线| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 老司机亚洲免费影院| 色综合站精品国产| 亚洲情色 制服丝袜| 男人舔女人下体高潮全视频| 免费在线观看亚洲国产| 色哟哟哟哟哟哟| 免费观看人在逋| 99国产精品99久久久久| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 性欧美人与动物交配| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 两性夫妻黄色片| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 黄片小视频在线播放| 欧美成人免费av一区二区三区| 好男人电影高清在线观看| 后天国语完整版免费观看| 亚洲熟女毛片儿| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 天堂中文最新版在线下载| av福利片在线| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 午夜福利在线观看吧| 麻豆成人av在线观看| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲一区中文字幕在线| 日本免费a在线| 看免费av毛片| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 丰满的人妻完整版| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产不卡一卡二| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产野战对白在线观看| 人人妻人人澡人人看| 亚洲 国产 在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久亚洲真实| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 满18在线观看网站| 亚洲国产精品合色在线| 18禁美女被吸乳视频| 日韩国内少妇激情av| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 精品高清国产在线一区| 91成年电影在线观看| 色播在线永久视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 少妇 在线观看| 又大又爽又粗| 日本黄色视频三级网站网址| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产色视频综合| 国产一区二区三区视频了| 制服诱惑二区| 999精品在线视频| 久久久国产成人免费| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 色婷婷久久久亚洲欧美|