胃癌中FOXM1調(diào)控相關(guān)分子的表達(dá)及其臨床意義

錢建新，謝 峰，顧小強(qiáng)，于觀貞，陳 穎，衛(wèi)立辛

FOXM1是FOX轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其表達(dá)及轉(zhuǎn)錄激活需要多因子、多細(xì)胞信號通路的共同參與。FOXM1特異性表達(dá)在增殖期細(xì)胞中，在細(xì)胞終末分化時消失。FOXM1的表達(dá)水平與正常細(xì)胞的增殖、衰老及器官的形成過程密切相關(guān)，而其異常表達(dá)則會導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化并通過影響基因組的穩(wěn)定性及有絲分裂過程的進(jìn)展等促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移[1]。在胃癌中FOXM1通路亦存在泛化情況，該通路的活化及異常表達(dá)與胃癌患者的惡性生物學(xué)行為和不良預(yù)后密切相關(guān)[2-3]。本實(shí)驗(yàn)在前期工作基礎(chǔ)上研究FOXM1改變前后FOXM1候選調(diào)控蛋白TWIST、ANXA1、SNAT1和S100A6的mRNA表達(dá)，應(yīng)用組織芯片和免疫組化法研究差異顯著分子在135例胃癌和癌旁組織中的表達(dá)情況和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

(1)實(shí)體標(biāo)本材料：選取2001-2005年海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院病理科存檔的部分石蠟標(biāo)本，共135例胃腺癌為實(shí)驗(yàn)材料，病理診斷結(jié)果經(jīng)2名病理醫(yī)師確認(rèn)，其他類型如肉瘤、淋巴瘤等排除在外。所有患者均取得隨訪資料，隨訪方式主要是電話隨訪，最短隨訪期1年，最長者110個月。樣本的使用獲得患者知情同意和經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。(2)細(xì)胞：胃癌細(xì)胞SGC7901和BGC823購于中科院。(3)試劑：pcDNA3.1-FOXM1B和FOXM1-shRNA質(zhì)粒由美國MD Anderson癌癥中心Suyun Huang教授贈送。FOXM1過表達(dá)(PSB1398，NM_202003)及FOXM1-shRNA敲減慢病毒(PLVT919)及對照慢病毒(NC，PLVT1)由上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司包裝提供。Trizol(Invitrogen，15596-026)、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(M1705)和dNTP(U1240)購自PROMEGA公司。Oligo dT(B0205)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。SYBR Master Mixture(TAKARA，AK4202)。RNase -free的物品均購自Axygen。EnVision兩步法免疫組化試劑盒購自丹麥Dako公司(GK500705)，二甲苯和乙醇購自國藥集團(tuán)，TWIST(H-81)兔多克隆抗體購于美國santa cruz，F(xiàn)OXM1(EPR17379)兔單克隆抗體購于英國Abcam公司，ANXA1兔多克隆抗體購于英國Abcam公司，S100A6兔多克隆抗體購于美國Proteintech公司。(4)引物：購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，序列見表1。(5)其他：1640培養(yǎng)基(Gibco，8116222)和胎牛血清(BI，1552680)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及穩(wěn)定株構(gòu)建 細(xì)胞計(jì)數(shù)后鋪6孔板，每孔10萬個細(xì)胞，培養(yǎng)條件為RPMI-1640加10%胎牛血清，12 h后按照MOI=60使用FOXM1敲減慢病毒和過表達(dá)慢病毒及相關(guān)對照病毒分別感染SGC7901及BGC823細(xì)胞，感染后24 h換液，繼續(xù)培養(yǎng)加嘌呤霉素篩選。傳代后，鋪6孔板，48 h后送樣檢測其敲減效率及Twist1、ANXA1、S100A6和SNAT1 mRNA的表達(dá)。

表1 FOXM1候選靶基因引物序列列表

1.2.2 RT-PCR 根據(jù)Invitrogen公司的Trizol法提取細(xì)胞中總RNA。Nanodrop測定所抽提RNA的濃度。根據(jù)Promega公司的M-MLV操作說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將1 μl Oligo dT(0.5 μg/μl)和2.0 μg Total RNA加入到PCR小管中，補(bǔ)充DEPC-H2O至9 μl?；靹蚝箅x心70 ℃溫浴10 min。在每個反應(yīng)管中加入的11 μl的M-MLV RT反應(yīng)液，RT反應(yīng)在42 ℃進(jìn)行1 h后完成，之后用70 ℃處理10 min使RT酶失活。得到的RT反應(yīng)產(chǎn)物cDNA用于PCR。RT-PCR設(shè)定程序?yàn)閮刹椒≧eal-Time定量。預(yù)變性95 ℃、15 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，45個循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光值。PCR結(jié)束后，在95 ℃變性1 min。然后冷卻至55 ℃，使DNA雙鏈充分結(jié)合。從55 ℃開始到95 ℃，每一步增加0.5 ℃，保持4 s，同時讀取吸光值。以β-actin作為內(nèi)參。

1.2.3 組織芯片構(gòu)建 根據(jù)蘇木精-伊紅(HE)染色切片選取存檔組織蠟塊，再用HE染色的切片確定具有代表性的病變部位(癌和癌旁)，然后參照Kononen等建立的方法應(yīng)用組織芯片構(gòu)建儀(Beecher Instruments，Silver Spring，MD)制備組織芯片。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 采用EnVision二步法(丹麥Dako公司試劑盒)按說明書操作。用pH 9.0的檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)。常規(guī)石蠟包埋，4 μmol/L連續(xù)切片。滴加50～100 μl按比例稀釋后的一抗∶50；BHLHA38; BOSTER Biological Technology company, Wuhan, China)，F(xiàn)OXM1(1∶100；K19; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,CA)，ANXA1(1∶100；ab33061, Abcam Company, Cambridge, UK)，S100A6(1∶50；5B10；BOSTER Biological Technology company, Wuhan, China)，用PBS替代一抗作陰性對照。

1.2.5 染色評估 四者性染色為淡黃色、棕黃色或棕褐色，定位于細(xì)胞核或者細(xì)胞漿內(nèi)。采用二級計(jì)分法，陽性細(xì)胞計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色強(qiáng)度分級計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為：淡黃色為1分，黃或深黃色為2分，褐或棕褐色為3分。2者計(jì)分相乘≥1者為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件作統(tǒng)計(jì)處理。組內(nèi)變量采用卡方檢驗(yàn)，單因素生存曲線用Kaplan-Meier，多因素生存分析用Cox regression。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的鑒定

復(fù)蘇凍存的構(gòu)建好的FOXM1過表達(dá)細(xì)胞株BGC823-FOXM1和BGC823-NC，F(xiàn)OXM1敲降的細(xì)胞株SGC7901-FOXM1-shRNA和SGC7901-NC[2]。通過免疫熒光和RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率，免疫熒光顯示轉(zhuǎn)染效率較高(圖1)，RT-PCR顯示過表達(dá)FOXM1的過表達(dá)率是對照組的5倍，而敲除FOXM1的敲減率也是對照組的5倍左右(圖2)。

注：IF為免疫熒光，NC為對照組圖1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的鑒定(IF×200)

注：與NC組比較aP<0.01。NC為對照組圖2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中FOXM1的表達(dá)情況

2.2 FOXM1對TWIST、ANXA1和S100A6的調(diào)控作用

如圖3所示，胃癌SGC7901細(xì)胞中下調(diào)FOXM1后TWIST1、ANXA1、S100A6、SNAT1表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，而BGC823細(xì)胞中上調(diào)FOXM1后TWIST1、ANXA1、S100A6表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，提示FOXM1能夠轉(zhuǎn)錄調(diào)控TWIST1、ANXA1和S100A6在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)。

注：NC為對照組。胃癌SGC7901細(xì)胞中下調(diào)FOXM1后TWIST1、ANXA1、S100A6、SNAT1表達(dá)顯著下調(diào)(與FOXM1下調(diào)前比aP<0.05)，而BGC823細(xì)胞中上調(diào)FOXM1后TWIST1、ANXA1、S100A6表達(dá)顯著上調(diào)(與FOXM1下調(diào)前比bP<0.05)圖3 FOXM1對TWIST、ANXA1和S100A6的調(diào)控情況

2.3 FOXM1、TWIST、ANXA1和S100A6在胃癌組織及非癌組織中的表達(dá)

構(gòu)建3張組織芯片，其中脫落15位點(diǎn)，用常規(guī)切片補(bǔ)充。癌組織中FOXM1、TWIST、ANXA1和S100A6，染色陽性細(xì)胞分布呈灶性或彌漫染色，非癌組織中陽性細(xì)胞呈散在或片狀分布，且染色強(qiáng)度均弱于癌組織(圖4)，在腫瘤組織中3者表達(dá)率分別為56.3%、49.6%、58.5%和63.7%，而在癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)率分別為22.2%、26.0%、37.0%和18.5%，4者在癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)(P<0.01)。

注：A為FOXM1，B為S100A6，C為TWIST，D為ANXA1。A、B、C、D左側(cè)免疫組化×4，右側(cè)免疫組化×200；A、B、C、D右上圖為胃癌，右下圖為癌旁組織圖4 利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測胃癌和癌旁組織中FOXM1、S100A6、TWIST1和ANXA1表達(dá)

2.4 FOXM1、TWIST1、ANXA1和S100A6表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

FOXM1的過度表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，ANXA1的過度表達(dá)與腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和疾病進(jìn)展密切相關(guān)，S100A6與胃壁浸潤密切相關(guān)，而TWIST1與腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病進(jìn)展以及分化差密切相關(guān)，詳見表2。

2.5 胃癌組織中FOXM1等相關(guān)因子表達(dá)對患者預(yù)后的影響

單因素生存分析顯示FOXM1、TWIST1、ANXA1和S100A6的表達(dá)均與胃癌患者預(yù)后相關(guān)(圖5)，陽性表達(dá)FOXM1、TWIST1、ANXA1和S100A6的胃癌患者在的中位生存期分別為71、72、72、72個月，而陰性表達(dá)者的生存期分別為51、51、48、53個月，陽性表達(dá)者和陰性表達(dá)者之間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(表3)。

表2 胃癌患者樣本各指標(biāo)陽性統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖5 FOXM1、TWIST1、ANXA1和S100A6的表達(dá)與胃癌患者預(yù)后之間的關(guān)系

3 討論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人體健康和浪費(fèi)社會資源。日本胃癌死亡率逐步下降，美國非西班牙裔白人中發(fā)病率也呈下降趨勢[4]。

隨著研究手段的改進(jìn)和資金投入，我國在胃癌的早期診斷、新型高效生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)以及基于生物標(biāo)志物或靶向治療藥物的開發(fā)等方面取得了巨大發(fā)展[5]。然而，中國胃癌的發(fā)病率和死亡率一直居高不下。繼續(xù)研究胃癌的發(fā)病機(jī)制、尋找預(yù)測胃癌患者預(yù)后和作為治療靶點(diǎn)的標(biāo)志物，至關(guān)重要。

FOXM1是FOX轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在腫瘤中的過表達(dá)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移[6-7]。FOXM1的表達(dá)水平將為腫瘤診斷、評估、預(yù)后等提供一個重要指標(biāo)，而FOXM1本身有望成為新藥開發(fā)及腫瘤治療的一個潛在靶點(diǎn)[8-9]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)FOXM1的過表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和腫瘤形成，而且其高表達(dá)提示胃癌患者預(yù)后不良。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FOXM1能夠調(diào)控多個基因的表達(dá)，譬如ADAM17、PDGF、ANXA1和TWIST等[2，10-12]，提示FOXM1是一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，但這些表達(dá)調(diào)控未形成系統(tǒng)性的研究。為了深入研究FOXM1的調(diào)控機(jī)制，筆者利用構(gòu)建好的過表達(dá)FOXM1和敲降FOXM1胃癌細(xì)胞[2]，檢測了其候選靶基因(TWIST1、ANXA1、S100A6和SNAT1)的表達(dá)，這新基因啟動子區(qū)具有FOXM1結(jié)合位點(diǎn)，且均與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。

表3 135例胃癌患者的生存分析

本研究發(fā)現(xiàn)FOXM1的敲降表達(dá)引起TWIST1、ANXA1、S100A6和SNAT1的表達(dá)下降，而過表達(dá)FOXM1則致使TWIST1、ANXA1和S100A6的表達(dá)升高，但SNAT1表達(dá)升高并不明顯，提示SNAT1不是FOXM1的直接調(diào)控因子。膜聯(lián)蛋白(annexins)是一類鈣依賴的磷脂結(jié)合蛋白超家族，參與抗炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化和增殖及腫瘤發(fā)生等細(xì)胞生命活動[13-15]。ANXA1作用機(jī)制非常復(fù)雜，在不同條件下呈現(xiàn)出抑癌基因和促癌基因雙向功能[16-17]。本研究顯示ANXA1與胃癌的轉(zhuǎn)移和疾病進(jìn)展高度相關(guān)，且受到FOXM1的調(diào)控，該研究與膠質(zhì)瘤中的研究結(jié)果一致，F(xiàn)OXM1直接調(diào)控ANXA1的表達(dá)[12]。上述研究證明了ANXA1是FOXM1的下游靶基因，在胃癌中FOXM1-ANXA1軸也發(fā)揮了促腫瘤發(fā)生和促轉(zhuǎn)移的作用。S100蛋白家族是一個鈣結(jié)合蛋白家族，參與細(xì)胞周期活動、細(xì)胞分化、腫瘤生長以及細(xì)胞外基質(zhì)分泌活動等過程[18-19]。S100蛋白家族成員S100A6在腫瘤中表達(dá)異常，并與腫瘤的增殖、浸潤轉(zhuǎn)移和凋亡密切相關(guān)。既往研究顯示S100A6在胃癌細(xì)胞中表達(dá)升高，其過表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞增殖[20]。本研究同樣顯示S100A6在胃癌組織中表達(dá)升高，與胃癌的侵犯深度和分化不良相關(guān)，多因素分析顯示S100A6是胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后因子。既往有研究也支持這一發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清S100A6水平明顯高于健康對照組，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、會陰浸潤及血管浸潤顯著相關(guān)，血清S100A6水平是總體生存率的獨(dú)立預(yù)測因子[21]。本研究再次證實(shí)了S100A6在胃癌發(fā)生發(fā)展中的重要性，同時首先報道了S100A6受到FOXM1的調(diào)控，然而FOXM1是如何調(diào)節(jié)S100A6的表達(dá)的，還需要進(jìn)一步研究。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)程中的一個重要過程， TWIST1是EMT過程中重要的調(diào)控因子[22]。本研究顯示TWIST1的高表達(dá)與胃癌侵犯深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病進(jìn)展和不良分化相關(guān)。而TWIST1在胃癌中的過表達(dá)受到FOXM1的調(diào)控，該研究與筆者前期發(fā)現(xiàn)一致，F(xiàn)OXM1在胃癌細(xì)胞中可以上調(diào)TWIST1促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖[11]。本研究進(jìn)一步表明FOXM1-TWIST1也參與了胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

判斷胃癌患者預(yù)后的因素包括臨床病理因素和分子生物學(xué)指標(biāo)[23]。既往大量研究引入了許多分子生物學(xué)標(biāo)志物，如磷酸化mTOR、HER2、PCDH9、ADAM17和FOXM1等，來協(xié)助TNM分期指導(dǎo)胃癌患者的預(yù)后[2，23-25]。本研究中亦檢測了FOXM1調(diào)控的ANXA1、S100A6和TWIST1 3個下游靶基因與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，單因素生存分析均顯示4者與胃癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。但是臨床因素如胃壁侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和疾病分期在小樣本量上是判斷胃癌患者的獨(dú)立因子，提示胃癌患者的早期發(fā)現(xiàn)是根治胃癌和提高胃癌患者生存期的根本因素。

本研究通過細(xì)胞學(xué)和免疫組化證實(shí)了胃癌組織中FOXM1、ANXA1、S100A6和TWIST1表達(dá)升高，且與胃癌惡性生物學(xué)行為高度相關(guān)。FOXM1介導(dǎo)的信號通路泛化激活在胃癌發(fā)生發(fā)展中起了重要作用，靶向FOXM1有望抑制下游靶基因的泛化。因此FOXM1介導(dǎo)的信號通路不單單有望成為預(yù)測胃癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物，其本身更有望成為潛在治療靶點(diǎn)。