應(yīng)用分子對(duì)接方法篩選桑椹紅色素微膠囊壁材

楊文宇 ，王 萌，肖 陽(yáng)，李 飛，詹茂玲，陳祥貴，劉茂祥

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.四川黑金椹陽(yáng)光農(nóng)業(yè)有限公司，四川 成都 610064）

桑椹紅色素是桑椹所含花色素類成分的通稱，含量豐富，在桑椹汁中的含量為147.68～2 725.46 mg/L[1]，在桑椹汁凍干粉中的含量為2.53%～4.78%[2]，在桑椹干果中的含量為0.09%～2.33%[3]，與品種及產(chǎn)地有關(guān)。桑椹紅色素中所含花色苷包括矢車菊素3-O-(6″-O-α-鼠李糖基-β-半乳糖苷)、矢車菊素3-O-(6″-O-α-鼠李糖基-β-葡萄糖苷)、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素3-O-葡萄糖苷、矢車菊素3-O-蕓香糖苷等，其中，主要成分是矢車菊素3-O-(6″-O-α-鼠李糖基-β-半乳糖苷)，占41.3%[4]。桑椹紅色素具有多種保健活性，包括抗氧化、抗糖尿病、抗腫瘤等，在食品和藥品領(lǐng)域有著廣泛的用途[5]。但是，桑椹紅色素的穩(wěn)定性較差[6-7]，光、熱、氧、金屬離子等多種因素可導(dǎo)致其降解，這對(duì)其功能性應(yīng)用產(chǎn)品的開發(fā)帶來了挑戰(zhàn)。有研究[8]表明，將花色素類成分制成微膠囊對(duì)提高其穩(wěn)定性有益。近年來，蛋白質(zhì)壁材在花色素微膠囊中的應(yīng)用前景受到了較多關(guān)注[9-10]，這為桑椹花色素微膠囊的開發(fā)提供了啟示。目前，微膠囊蛋白質(zhì)壁材的篩選仍主要依靠經(jīng)驗(yàn)和大量實(shí)驗(yàn)，在一定程度上具有盲目性，且效率較低。分子對(duì)接是一種通過計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)分子間相互作用的研究方法，最初主要用于評(píng)價(jià)藥物對(duì)有關(guān)作用靶點(diǎn)的適配性，能夠深入揭示藥物與靶點(diǎn)之間的氫鍵、范德華力、靜電勢(shì)等相互作用。近年來，分子對(duì)接方法已被拓展應(yīng)用于配方研究領(lǐng)域，如槲皮素-環(huán)糊精包合物[11]、蝦青素-β-乳球蛋白-殼聚糖納米復(fù)合物[12]、葉黃素-海藻酸鈉微球[13]等，在輔料篩選和復(fù)合物分子機(jī)制分析等方面的應(yīng)用潛力逐漸得以展示。分子對(duì)接具有快速、準(zhǔn)確、高通量、低成本等優(yōu)勢(shì)[14]，以分子對(duì)接為導(dǎo)向，針對(duì)特定化合物篩選制備微膠囊的蛋白質(zhì)壁材，不僅能夠節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高研究效率，而且還能初步揭示微膠囊壁材和芯材成分之間的相互作用機(jī)制，值得深入探討。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、儀器與軟件

樣品：桑椹（Morus albaL.），干品，四川黑金椹陽(yáng)光農(nóng)業(yè)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)自四川鹽邊縣惠民鄉(xiāng)。

試劑：無水乙醇、磷酸二氫鉀、冰乙酸、三水乙酸鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉、D101型大孔樹脂、β-環(huán)糊精，均為分析純；大豆分離蛋白，食品級(jí)。

儀器：UV-2600A型紫外可見分光光度計(jì)，上海尤尼柯公司；Concentrator plus真空離心濃縮儀，德國(guó)艾本德；DMi8 A光學(xué)顯微鏡，德國(guó)Leica；TDZ5-WS臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，上海盧湘離心機(jī)儀器有限公司；KQ2200型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-D（ш）循環(huán)水式多用真空泵，河南省予華儀器有限公司；TB-214電子天平，成都世紀(jì)方舟科技有限公司；HNY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器，成都世紀(jì)方舟科技有限公司；SFG-0.2.400電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；Phs-430型pH計(jì)，成都世紀(jì)方舟科技有限公司；BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器R-210和HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋，瑞士BUCHI公司；LyoQuest-85實(shí)驗(yàn)型冷凍干燥機(jī)，西班牙Telstar公司。

軟件：ChemSketch 12.0，美國(guó)Advanced Chemistry Development公司；Molegro Virtual Docker 5.0（MVD），丹麥Molegro ApS公司。

1.2 方法

1.2.1 分子對(duì)接方法

1.2.1.1 目標(biāo)蛋白質(zhì)的準(zhǔn)備

分別選擇來源于大豆、雞蛋、牛奶的主要蛋白質(zhì)各兩種進(jìn)行對(duì)接研究，大豆蛋白：堿性7S球蛋白、H-2鐵蛋白；雞蛋蛋白：未裂解卵清蛋白、S-卵清蛋白；牛奶蛋白：β-乳球蛋白、α-乳清蛋白。擬對(duì)接的目標(biāo)蛋白質(zhì)的X線衍射晶體結(jié)構(gòu)下載自美國(guó)羅格斯大學(xué)等建設(shè)的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（RCSB PDB，http://www.rcsb.org/）（表1）。

表1 目標(biāo)蛋白質(zhì)

各個(gè)蛋白質(zhì)分子經(jīng)分配鍵序、電荷優(yōu)化、加氫等處理后備用。

1.2.1.2 桑椹花色苷分子的準(zhǔn)備

以桑椹花色苷的主要成分矢車菊素3-O-(6″-O-α-鼠李糖基-β-半乳糖苷)為代表進(jìn)行考察，分子平面結(jié)構(gòu)用ChemSketch軟件繪制，三維結(jié)構(gòu)由在線程序CORINA（https://www.mn-am.com/）轉(zhuǎn)換產(chǎn)生并進(jìn)行構(gòu)象優(yōu)化。

1.2.1.3 對(duì)接參數(shù)

通過建立能量網(wǎng)格進(jìn)行對(duì)接，網(wǎng)格分辨率為0.03 nm；結(jié)合位置根據(jù)探測(cè)所得活性口袋進(jìn)行選擇；搜索算法采用MolDock SE，運(yùn)行次數(shù)為100次，最大迭代次數(shù)為1 500次；結(jié)合構(gòu)象的能量門檻設(shè)為100 kcal/mol；單純形進(jìn)化算法最大步驟設(shè)為300，鄰近距離因子設(shè)為1.00。

1.2.1.4 對(duì)接評(píng)分

評(píng)分函數(shù)選用MolDock Score，用Escore表示，Escore=ET+Eint，式中，ET為結(jié)合構(gòu)象與靶分子之間的總相互作用能，Eint為結(jié)合構(gòu)象的內(nèi)能。ET=Epro+EW，其中Epro為結(jié)合構(gòu)象與蛋白質(zhì)（包括氨基酸殘基和輔因子等）之間的相互作用能，EW為結(jié)合構(gòu)象與水分子之間的相互作用能。

1.2.2 桑椹紅色素的制備

參考文獻(xiàn)[15-17]的方法并結(jié)合前期經(jīng)驗(yàn)，按以下方法制備：桑椹經(jīng)破碎、充分研磨后，以60%乙醇(鹽酸調(diào)pH值 為1～2)為提取溶劑，按照料液比1:15，室溫下超聲波輔助提取2次，每次30 min。提取液加水稀釋至花色素質(zhì)量濃度約0.1 mg/mL（以矢車菊素3-O-葡萄糖苷計(jì)），上D101大孔樹脂柱進(jìn)行純化，上樣體積為3倍柱體積，流速為6 BV/h，用水洗去糖類等雜質(zhì)后，以80%乙醇（鹽酸調(diào)pH值到 1）解吸，洗脫液經(jīng)50 ℃以下減壓濃縮，得到桑椹紅色素浸膏，經(jīng)冷凍干燥后備用。

1.2.3 桑椹紅色素的測(cè)定方法

桑椹紅色素是由多種花色素類成分組成的混合物，因此采用色價(jià)[18-19]來表示其含量。取桑椹紅色素樣品，以80%乙醇（鹽酸調(diào)pH為 1）溶解并稀釋至合適濃度，先進(jìn)行光譜掃描確定最大吸收波長(zhǎng)，然后以溶劑為參比，測(cè)定該波長(zhǎng)下的吸光度值（控制吸光度為0.3～0.7），根據(jù)朗伯比爾定律計(jì)算色價(jià)=(A×DF)/m，式中A為所測(cè)吸光度值，DF為稀釋倍數(shù)，m為樣品質(zhì)量。

1.2.4 微膠囊的制備

1.2.4.1 制備步驟

借鑒文獻(xiàn)[20-21]的溶劑揮發(fā)法制備微膠囊的原理，并參考其中的部分步驟，在此基礎(chǔ)上，基于非熱處理的思路，以研磨法為主制備桑椹紅色素微膠囊。取一定量的壁材物料，加適量水或含水乙醇溶液，使之分散并具有一定的流動(dòng)性，然后加入一定比例的桑椹紅色素提取物作為芯材，經(jīng)充分研磨后，冷凍干燥，得到的紫紅色塊狀產(chǎn)物，研細(xì)過篩，即制得桑椹紅色素微膠囊。

1.2.4.2 復(fù)合壁材比例的考察

根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果選用相應(yīng)蛋白質(zhì)，與β-環(huán)糊精[22]組成復(fù)合壁材，用作桑椹紅色素微膠囊的載體。取β-環(huán)糊精，與蛋白質(zhì)按質(zhì)量比2:8、4:6、5:5、6:4和8:2分別混合，作為壁材。固定芯壁比為1:10，按上述制備步驟分別制成桑椹紅色素微膠囊。以包埋率為指標(biāo)評(píng)價(jià)β-環(huán)糊精與蛋白質(zhì)的不同比例對(duì)包埋效果的影響。包埋率的測(cè)定：取微膠囊干燥樣品2 g，稱定，加95%乙醇20 mL，拌1 min，靜置10 min，過濾后測(cè)定濾液的吸光值，根據(jù)朗伯比爾定律計(jì)算濾液中花色素的量Yi（以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計(jì)，摩爾吸收系數(shù)ε=26 900），由此求得包埋率R，R/%=(1-Yi/Y)×100，式中Yi代表微膠囊產(chǎn)品表面未被包埋的花色素的量；Y為微膠囊供試品中桑椹紅色素的總量。

1.2.4.3 芯壁比例的考察

根據(jù)復(fù)合壁材比例考察結(jié)果確定微膠囊壁材，考察不同芯壁比1:6、1:8、1:10、1:12和1:14對(duì)包埋效果的影響，包埋率的測(cè)定方法同1.2.4.1。

1.2.4.4 微膠囊微觀形態(tài)的分析

按照優(yōu)化的復(fù)合壁材比例和芯材比例制備桑椹紅色素微膠囊，取少量微膠囊粉末置于載玻片上，使其保持均勻（必要時(shí)加1滴柏油以便于粉末聚集），蓋上蓋玻片，置DMi8 A光學(xué)顯微鏡下，在500、250 nm分辨率下觀察微膠囊的表面形態(tài)，通過聯(lián)機(jī)軟件得到顯微圖像。

1.2.4.5 微膠囊穩(wěn)定性的考察

對(duì)熱穩(wěn)定性進(jìn)行考察：取未微囊化的桑椹紅色素、桑椹紅色素微膠囊適量，分別加20.0 mL水，置70 ℃水浴中，避光加熱150 min，每隔30 min取出1.0 mL，適當(dāng)稀釋后測(cè)定吸光度，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)樣品中的花色素含量（以矢車菊素3-O-葡萄糖苷計(jì)），以此求保存率P，P/%=(Mt/M0)×100，式中：Mt為取樣時(shí)樣品中花色素含量；M0為樣品中花色素的初始含量。經(jīng)熱處理后的桑椹紅色素微膠囊樣品，冷凍干燥，再次進(jìn)行顯微鏡觀察。

對(duì)光穩(wěn)定性考察：取未微囊化的桑椹紅色素、桑椹紅色素微膠囊適量，于夏天自然光下分別曝光5 d，每天取樣溶解后測(cè)定吸光度，按熱穩(wěn)定性考察方法計(jì)算保存率。

2 結(jié)果與分析

2.1 矢車菊素3-O-(6″-O-α-鼠李糖基-β-半乳糖苷)與不同蛋白質(zhì)的結(jié)合能力分析

矢車菊素3-O-(6″-O-α-鼠李糖基-β-半乳糖苷)與6種蛋白質(zhì)的對(duì)接評(píng)分結(jié)果見表2。配體與蛋白質(zhì)對(duì)接時(shí)產(chǎn)生結(jié)合構(gòu)象（pose），其與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合自由能，即為Escore值。通常，配體-蛋白質(zhì)間的結(jié)合自由能越低（負(fù)值，其絕對(duì)值越大），則配體與該蛋白質(zhì)的結(jié)合能力越強(qiáng)[23]。根據(jù)對(duì)接前的設(shè)置，矢車菊素3-O-(6″-O-α-鼠李糖基-β-半乳糖苷)與各個(gè)蛋白質(zhì)對(duì)接完成后，MVD軟件為每個(gè)蛋白質(zhì)返回5個(gè)pose，代表配體與蛋白質(zhì)相互作用的5種可能狀態(tài)。利用MVD軟件內(nèi)置的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法對(duì)這5個(gè)pose的數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，并根據(jù)模型重新預(yù)測(cè)，可得到較為合理的對(duì)接評(píng)分。表2的Escore值即為人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模后預(yù)測(cè)值。

表2 對(duì)接參數(shù)評(píng)分表

對(duì)比6個(gè)蛋白質(zhì)的Escore值可知，大豆蛋白3AUP、6J4J較卵清蛋白和牛乳蛋白與矢車菊素3-O-(6″-O-α-鼠李糖基-β-半乳糖苷)的結(jié)合能力更強(qiáng)。而且，它們的配體效率也優(yōu)于其余4種蛋白質(zhì)。雖然配體效率通常用于表示分子量與活性的關(guān)系，但此處也說明大豆蛋白的結(jié)構(gòu)更適宜其配體。另外，花色苷分子中含有較多的氫鍵供體和受體，能與蛋白質(zhì)的多種氨基酸殘基和結(jié)合水形成氫鍵;因此，氫鍵是影響其與蛋白質(zhì)相互作用的主要因素之一。表2中，雖然1UHG所形成的氫鍵最強(qiáng)（-22.069 kcal/mol）、1BEB中結(jié)合水的作用最強(qiáng)（-36.129 kcal/mol），但由于其配體pose具有較高的內(nèi)能（75.889 kcal/mol、54.554 kcal/mol），故它們的Escore值較低。而3AUP、6J4J的氫鍵評(píng)分和EW評(píng)分均較高，且都具有相對(duì)較低的內(nèi)能，表明配體pose處于較為理想的低能構(gòu)象狀態(tài)，能夠形成較為穩(wěn)定的配體-蛋白質(zhì)復(fù)合物。

矢車菊素3-O-(6″-O-α-鼠李糖基-β-半乳糖苷)與3AUP的結(jié)合位置見圖1，結(jié)合口袋位于A～D亞基之間，由氫鍵支撐在體積為3.895 3 nm3的活性口袋的正中間；氫鍵分布見圖2，氫鍵數(shù)據(jù)見表3。

圖1 3AUP中矢車菊素3-O-(6″-O-α-鼠李糖基-β-半乳糖苷)的結(jié)合位置和構(gòu)象

圖2 矢車菊素3-O-(6″-O-α-鼠李糖基-β-半乳糖苷)與3AUP形成的氫鍵

矢車菊素3-O-(6″-O-α-鼠李糖基-β-半 乳 糖苷)與6J4J的結(jié)合位置見圖3，結(jié)合口袋位于A、B亞基之間，體積為0.051 7 nm3；氫鍵分布見圖4，氫鍵數(shù)據(jù)見表4。

綜合以上分析可知，桑椹紅色素的主要成分矢車菊素3-O-(6″-O-α-鼠李糖基-β-半乳糖苷)與大豆蛋白的結(jié)合能力強(qiáng)于卵清蛋白和牛乳蛋白，大豆蛋白更適宜用作桑椹紅色素微膠囊的壁材成分。

2.2 桑椹紅色素提取純化的結(jié)果

原料樣品中桑椹紅色素的提取率為6.88 mg/g。大孔樹脂純化前，粗提物的色價(jià)為=42.3；純化后提取物的色價(jià)為=86.2。

2.3 大豆蛋白用于桑椹紅色素微膠囊制備的結(jié)果分析

2.3.1 壁材組成對(duì)微膠囊包埋率的影響

從由圖5（a）可知：大豆分離蛋白與β-環(huán)糊精的質(zhì)量比例的改變對(duì)桑椹紅色素的包埋效果有著明顯的影響；包埋率隨著壁材中大豆分離蛋白比例的增加而增加；壁材中大豆分離蛋白的比例從20%增加到80%時(shí)，桑椹紅色素包埋率的增幅達(dá)10%以上。這表明桑椹紅色素中的花色苷分子與大豆分離蛋白分子之間的確存在著較強(qiáng)的相互作用。因此，上述分子對(duì)接研究的預(yù)測(cè)結(jié)果是準(zhǔn)確的。同時(shí)，有關(guān)以大豆分離蛋白和麥芽糊精為壁材能很好地包埋花色素類成分的報(bào)道[24-26]也能與上述結(jié)果相互印證。

表3 矢車菊素3-O-(6″-O-α-鼠李糖基-β-半乳糖苷)與3AUP間的氫鍵

2.3.2 芯壁比對(duì)微膠囊包埋率的影響

芯壁比的考察所采用的壁材為質(zhì)量比1∶1的大豆分離蛋白和β-環(huán)糊精的混合物。由圖5（b）可知，壁材用量為芯材用量的10倍時(shí)，與用量為6倍、8倍相比，包埋率有明顯的增加，增幅達(dá)10%以上。按理，若進(jìn)一步增加壁材用量，包埋率可進(jìn)一步增大，但壁材用量增到12、14倍時(shí)包埋率略有下降。不過，下降幅度在3%以內(nèi)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)操作過程分析，這應(yīng)當(dāng)是由于壁材比例偏高、研磨不均勻所致。若從分組的角度看，1:6、1:8可歸為一組，1:10～1:14可歸為另一組。這兩組實(shí)際上代表了包埋率的兩個(gè)梯度，而梯度間的轉(zhuǎn)折比例在1:8和1:10之間。因此，為了得到較好的包埋率，1:10是較適宜的選擇。

2.3.3 微膠囊的微觀表面性狀

以質(zhì)量比為8:2的大豆分離蛋白和β-環(huán)糊精混合物為壁材，按照芯材比1:10制備桑椹紅色素微膠囊，用于顯微分析和穩(wěn)定性考察。

由圖6（a）、圖6（b）的顯微圖像可知：在500、250 nm分辨率下均觀察到桑椹花色素微膠囊具有完整的包合結(jié)構(gòu)，微膠囊呈類圓形；其中的鑲嵌物清晰可見，表明大豆分離蛋白和β-環(huán)糊精對(duì)桑椹紅色素成分具有很好的包埋效果。

2.3.4 微膠囊穩(wěn)定性考察結(jié)果的分析

由圖7（a）可知，隨著加熱時(shí)間的增加，桑椹花色素及其微膠囊產(chǎn)品的保存率都有一定程度的下降，但微膠囊的下降幅度較小，表明由大豆分離蛋白和β-環(huán)糊精為壁材制備的微膠囊，能明顯提高桑椹紅色素的穩(wěn)定性。另外，從圖6（c）、圖6（d）的顯微圖像可知，考察熱穩(wěn)定性后的桑椹微膠囊，經(jīng)重新凍干，在500、250 nm分辨率下仍然可以觀察到微膠囊的完整形態(tài)，因此，由大豆分離蛋白和β-環(huán)糊精為壁材制備的微膠囊具有比較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。這也在一定程度上表明以上分子對(duì)接的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際情況較為吻合。

圖3 6J4J中矢車菊素3-O-(6″-O-α-鼠李糖基-β-半乳糖苷)的結(jié)合位置和構(gòu)象

圖4 矢車菊素3-O-(6″-O-α-鼠李糖基-β-半乳糖苷)與6J4J形成的氫鍵

表4 矢車菊素3-O-(6″-O-α-鼠李糖基-β-半乳糖苷)與6J4J間的氫鍵

由圖7（b）可知，隨著光照時(shí)間的增加，桑椹紅色素及微膠囊產(chǎn)品的保存率都有一定程度的下降，但微膠囊的下降幅度較小，表明由大豆分離蛋白和β-環(huán)糊精為壁材制備的微膠囊能夠提高桑椹紅色素的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

經(jīng)分子對(duì)接方法預(yù)測(cè)，大豆蛋白與桑椹紅色素的主要成分矢車菊素3-O-(6″-O-α-鼠李糖基-β-半乳糖苷)的結(jié)合能力強(qiáng)于雞蛋蛋白和牛奶蛋白，這為桑椹紅色素微膠囊壁材的選擇提供了導(dǎo)向；以大豆分離蛋白和β-環(huán)糊精作為微膠囊壁材，桑椹紅色素的包埋率隨大豆分離蛋白比例增加而增加，驗(yàn)證了分子對(duì)接的預(yù)測(cè)結(jié)果；顯微分析表明該微膠囊具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)；對(duì)熱、對(duì)光穩(wěn)定性試驗(yàn)表明該微膠囊能提高桑椹紅色素的穩(wěn)定性。因此，基于分子對(duì)接結(jié)果選擇食品、藥品原輔料的研究方法具有可行性。

圖5 微膠囊不同配方對(duì)包埋率的影響

圖6 桑椹紅色素微膠囊顯微圖像

圖7 加熱和光照對(duì)桑椹紅色素微膠囊穩(wěn)定性的影響

致謝：丹麥Molegro ApS公司為本研究提供了Molegro Virtual Docker 軟件，在此表示感謝。