青蒿琥酯對乳腺癌細(xì)胞的生長抑制作用及其機(jī)制

楊超，張彥收，張庚，杜凱鄴，李靜平，劉亮

1河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院乳腺中心，石家莊 050011；2河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所，石家莊 050011

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，發(fā)病率及病死率較高，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康[1]。其常規(guī)治療方法包括手術(shù)、化療及放療，其中手術(shù)仍是首選方法，但相當(dāng)一部分患者就診時(shí)已屬中晚期，失去了手術(shù)治療的機(jī)會。因此，化療成為其主要的治療方法之一。影響化療效果的主要因素為化療藥物的毒副作用及耐藥性。尋找高效低毒的抗乳腺癌藥物對提高治療效果、延長生存期具有重要意義。為了尋找低毒的抗癌藥物，目前研究者多傾向于從中草藥中尋找抗癌成分。中藥治療腫瘤歷史悠久且低毒、價(jià)廉[2-3]。青蒿素來源于植物黃花蒿，其多種衍生物具有較好的抗瘧作用[4-5]，如青蒿琥酯治療重型及耐藥型瘧疾效果較好[6-9]，還具有調(diào)節(jié)免疫[10]、 抗炎、抗氧化[11]及抗腫瘤的作用[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯具有抗多種腫瘤作用[13-16]，但其作用機(jī)制研究鮮有報(bào)道。本研究探討青蒿琥酯對乳腺癌細(xì)胞的生長抑制作用及其機(jī)制，為將青蒿琥酯應(yīng)用于臨床治療乳腺癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 注射用青蒿琥酯購自桂林南藥股份有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染檢測試劑盒購自美國Beckman Coulter公司；羅丹明123(Rhodanmine 123，Rho123)試劑購自中國Solarbio公司；CCK-8試劑購自中國博士德生物工程有限公司；Bcl-2及Bax抗體購自美國Santa Cruz公司；MatrigelTMMatrix Basement Membrane購自美國BD公司。Transwell 3422購自美國Corning公司；FC-500型流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.2 細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。接種細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中(補(bǔ)充青霉素、鏈霉素各100 U/L)，置于37 ℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的MDAMB-231細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2溫箱中。貼壁后倒去培養(yǎng)液，分別加入不同濃度的青蒿琥酯(0、0.1、0.5、1、5、10、50、100、200、400、800 μg/ml)，陰性對照組加入等體積培養(yǎng)液，反應(yīng)總體積200 μl/孔。另設(shè)空白對照孔，只加培養(yǎng)液，每個(gè)藥物濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h后，每孔加入CCK-8溶液20 μl，繼續(xù)孵育3 h，終止培養(yǎng)。用酶標(biāo)儀測定各孔450 nm波長處的吸光度(A450)值，計(jì)算生長抑制率(IR)及半數(shù)抑制濃度(IC50值)。IR(%)=(1－用藥組A450/對照組A450)×100%。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組及青蒿琥酯干預(yù)實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞(5×106個(gè))接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的青蒿琥酯，終濃度分別為0、25、50、100 μg/ml(根據(jù)IC50值選擇)，0 μg/ml青蒿琥酯以生理鹽水代替，作為對照組，作用24 h后，收集細(xì)胞，PBS液洗滌2次，300目尼龍網(wǎng)過濾制備成合格的單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 取1 ml單細(xì)胞懸液，用預(yù)冷PBS洗滌1次，100 μl預(yù)冷1×結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加入10 μl AnnexinV-FITC，冰上避光放置15 min，加入380 μl 1×結(jié)合緩沖液，然后加入10 μl PI染液冰上避光放置15 min，PBS洗滌1次，1 ml PBS懸浮細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 情況。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞線粒體膜電位 取1 ml單細(xì)胞懸液，用預(yù)冷PBS洗滌1次，100 μl PBS液懸浮細(xì)胞，加入Rho123染料，終濃度為10 μg/ml，在37 ℃下避光平衡30 min，PBS洗滌1次，1 ml PBS懸浮細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞線粒體膜電位。以平均熒光強(qiáng)度表示細(xì)胞線粒體膜電位水平。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞(5×106個(gè))接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的青蒿琥酯，終濃度分別為0、25 μg/ml，0 μg/ml青蒿琥酯以生理鹽水代替，作為對照組，作用24 h后，收集細(xì)胞。

先用Marker筆在6孔板背后均勻劃線，間隔0.5 cm，橫穿過孔，每孔穿過5條線。在每孔中加入約5×105個(gè)上述制備細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后融合度達(dá)到100%。第2天用10 μl槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭垂直，不能傾斜(不同孔之間使用同一只槍頭)。PBS洗滌3次，去除劃下的細(xì)胞，加入培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并于0、24 h拍照。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞(5×106個(gè))接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的青蒿琥酯，終濃度分別為0、25 μg/ml，0 μg/ml青蒿琥酯以生理鹽水代替，作為對照組，作用24 h后，收集 細(xì)胞。

用Matrigel和無血清RPMI 1640(1:8稀釋)包被Transwell小室底部膜的上室面，每孔加入60 μl稀釋后的Matrigel膠，37 ℃孵育4 h。此間Matrigel膠變?yōu)榘咨珜?，吸除培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50 μl無血清RPMI 1640，37 ℃孵育30 min，取上述收集的細(xì)胞去血清饑餓12 h后，向Transwell上室加入無血清RPMI 1640細(xì)胞懸液200 μl(含2×104個(gè)細(xì)胞)，下室加入600 μl全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，移去上室，用棉簽擦去上室細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，于100倍顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移至下室的細(xì)胞數(shù)量(隨機(jī)選取5個(gè)視野)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 青蒿琥酯可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，青蒿琥酯對MDA-MB-231細(xì)胞具有增殖抑制作用，且呈濃度依賴性(圖1)。青蒿琥酯對MDA-MB-231細(xì)胞的IC50為54.24 μg/ml。根據(jù)青蒿琥酯對乳腺癌細(xì)胞的IC50值，后續(xù)實(shí)驗(yàn)青蒿琥酯濃度選擇0、25、50及100 μg/ml，0 μg/ml青蒿琥酯以生理鹽水代替，作為對照組。

圖1 青蒿琥酯抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖曲線圖(CCK-8， n=3)Fig.1 Curative curve of MDA-MB-231 cells treated with artesunate (CCK-8, n=3)

2.2 青蒿琥酯可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，25、50及100 μg/ml青蒿琥酯作用于MDA-MB-231細(xì)胞24 h，細(xì)胞凋亡率顯著增高(P<0.01)，且呈濃度依賴性。100 μg/ml青蒿琥酯組細(xì)胞凋亡率顯著高于25及50 μg/ml青蒿琥酯組(P<0.01，圖2)。

2.3 青蒿琥酯可降低乳腺癌細(xì)胞線粒體膜電位 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，25、50 及100 μg/ml青蒿琥酯作用于MDA-MB-231細(xì)胞24 h，細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低(P<0.01)，且呈濃度依賴性。100 μg/ml青蒿琥酯組細(xì)胞線粒體膜電位顯著低于25及50 μg/ml青蒿琥酯組(P<0.01， 圖3)。

圖2 青蒿琥酯誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡(流式細(xì)胞術(shù)，n=3)Fig.2 Apoptosis of MDA-MB-231 cells induced by artesunate (Flow cytometry, n=3)

2.4 青蒿琥酯可抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移能力 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，25 μg/ml青蒿琥酯作用于MDA-MB-231細(xì)胞24 h，可以顯著抑制MDAMB-231細(xì)胞的遷移能力(圖4)。

2.5 青蒿琥酯可抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，25 μg/ml青蒿琥酯作用于MDA-MB-231細(xì)胞24 h，侵襲細(xì)胞數(shù)(42.33±5.51)較對照組(126.00±9.54)明顯減少(P<0.01，圖5)。

3 討 論

目前乳腺癌的常規(guī)治療方法包括手術(shù)、化療及放療[17-20]，其中手術(shù)是首選的治療方法，但由于諸多原因不能手術(shù)的患者往往會選擇化療及放療[21]。影響化療效果的因素主要包括藥物的毒副作用及多藥耐藥，因此尋找高效低毒的抗乳腺癌藥物具有重要意義。

圖3 青蒿琥酯調(diào)控MDA-MB-231細(xì)胞線粒體膜電位(流式細(xì)胞術(shù)，n=3)Fig.3 Mitochondrial membrane potential in MDA-MB-231 cells regulated by artesunate (Flow cytometry, n=3)

中藥治療腫瘤歷史悠久，具有低毒、高效、價(jià)廉的特點(diǎn)。從中草藥中尋找抗腫瘤藥物已成為目前腫瘤界研究的熱點(diǎn)[22-24]。青蒿素來源于植物黃花蒿，其衍生物青蒿琥酯具有重要的藥效價(jià)值。青蒿琥酯是經(jīng)典的抗瘧藥物，具有低毒、高效的特點(diǎn)，對重型和耐藥型瘧疾療效較好[25-27]。已知青蒿琥酯對多種腫瘤細(xì)胞具有生長抑制作用[28-30]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯對食管癌及胃癌細(xì)胞具有生長抑制作用，且其抑制作用與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有 關(guān)[31-32]。本研究主要探討青蒿琥酯對乳腺癌細(xì)胞的生長抑制作用及可能機(jī)制，為其作為抗乳腺癌藥物應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯對MDA-MB-231細(xì)胞具有生長抑制作用，且呈濃度依賴性。

細(xì)胞凋亡是受諸多因子調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡，亦是判斷藥物是否具有抗癌作用的主要指標(biāo)。線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)的控制中心，細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，以及細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心。線粒體跨膜電位下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，一旦線粒體跨膜電位劇變，則細(xì)胞凋亡將不可逆。本研究結(jié)果顯示，青蒿琥酯作用后，MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生凋亡，且呈濃度依賴性；細(xì)胞線粒體膜電位進(jìn)一步降低，且隨著青蒿琥酯濃度增高，線粒體膜電位進(jìn)一步降低。表明青蒿琥酯對乳腺癌細(xì)胞的生長抑制作用與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用有關(guān)，細(xì)胞線粒體膜電位降低，從而引起細(xì)胞凋亡。本研究還發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯可顯著抑制MDAMB-231細(xì)胞的遷移及侵襲能力。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力(×100)Fig.4 The migration ability of MDA-MB-231 cells was detected by wound healing test (×100)

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力(×200)Fig.5 The invasive ability of MDA-MB-231 cells was detected by Transwell assay (×200)

綜上所述，青蒿琥酯可抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，降低線粒體膜電位，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；還可抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲。青蒿琥酯是青蒿素的衍生物，來源于植物黃花蒿，具有低毒副作用的特點(diǎn)，若能將其開發(fā)為抗乳腺癌藥物，將會有廣泛的應(yīng)用前景。