左旋奧拉西坦在腦缺血再灌注模型大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究

利 玲，胡 秀，利 莉 （1.鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院，湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 黃石 435000；2.腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435000）

奧拉西坦是一種臨床上用于治療認(rèn)知障礙、記憶障礙、缺血性中風(fēng)和癡呆的益智藥[1-2]。通過(guò)與谷氨酸受體的相互作用，奧拉西坦可以選擇性作用于大腦皮層和海馬，保護(hù)、激活或促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞功能的恢復(fù)，積極調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的興奮過(guò)程，而藥物本身沒有直接的血管活性，也沒有中樞興奮作用，對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響是一種持久的促進(jìn)作用[3-4]。此前有研究探討奧拉西坦對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果顯示僅有奧拉西坦的左旋體表現(xiàn)出活性[5-6]。在谷氨酸的存在下，左旋奧拉西坦刺激Ca2+被攝取到小腦，并呈現(xiàn)劑量依賴性，而右旋奧拉西坦是無(wú)效的[7-8]。盡管奧拉西坦的活性具有立體選擇性，目前臨床常用的仍為奧拉西坦的消旋混合物。由于機(jī)體的生物選擇性和潛在的對(duì)映體相互轉(zhuǎn)化，藥物對(duì)映異構(gòu)體可能有不同的藥代動(dòng)力學(xué)、毒理學(xué)和藥效學(xué)特性。因此闡明奧拉西坦對(duì)映異構(gòu)體中具有活性的左旋奧拉西坦在正常大鼠及腦缺血再灌注模型大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特性具有重要意義。

本文應(yīng)用高效液相色譜法（HPLC）建立了大鼠血漿中左旋奧拉西坦?jié)舛鹊臏y(cè)定方法，探討左旋奧拉西坦在正常大鼠及腦缺血再灌注模型大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)規(guī)律，旨為左旋奧拉西坦的藥代-藥效（PK-PD）研究和臨床應(yīng)用的合理性及安全性提供重要參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

日立L-7000型高效液相色譜系統(tǒng)，配有L-7110型泵，L-7200型自動(dòng)進(jìn)樣器，L-7420型UV檢測(cè)器；Vortex-5型渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；BS110S型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；高速低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo Scientific公司）；KQ 500DE型數(shù)控超聲波清潔器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

左旋奧拉西坦（純度＞ 99%，深圳斯坦德化工科技有限公司）；茴拉西坦（純度＞ 98.5%，北京萬(wàn)佳首化生物科技有限公司）；HPLC級(jí)乙腈和HPLC級(jí)甲醇均購(gòu)自美國(guó)天地高純?nèi)軇┯邢薰?；水為純凈水；其余試劑均為分析純?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠，體質(zhì)量230 ～ 270 g，購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（京）2014-0016。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[9-10]

色譜柱為APS-2 HYPERSIL柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為水-乙腈（12 : 88，v/v），流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，柱溫25 ℃。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取左旋奧拉西坦適量，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為20 mg·L-1儲(chǔ)備液，臨用前用甲醇稀釋成濃度為5、20、100、500、750、1000 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，同法配制質(zhì)控樣品的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為10、400、800 μg·mL-1。

精密稱取內(nèi)標(biāo)適量，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為1000 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 血漿樣品處理

取100 μL血漿，加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液和300 μL甲醇，充分渦旋振蕩，14 000 r·min-1離心10 min；將上清全部移入另一干凈EP管中，采用氮?dú)獯蹈蓛x將甲醇吹干完全，加入100 μL甲醇進(jìn)行復(fù)溶，再次充分渦旋振蕩，14 000 r·min-1離心10 min，取上清20 μL進(jìn)樣分析。

2.4 動(dòng)物模型建立

本實(shí)驗(yàn)采用改良Zea Longa線栓法[11]制作大腦中動(dòng)脈閉塞所致局灶性腦缺血再灌注大鼠模型。待大鼠麻醉后，使其仰臥并固定在手術(shù)平板上，頸部備皮并消毒；在頸部正中稍偏右切口，分離皮下和肌肉組織，使頸總動(dòng)脈暴露；剝離頸總動(dòng)脈（CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）和頸外動(dòng)脈（ECA）；用手術(shù)線結(jié)扎ECA，CCA的近心端，并在CCA的遠(yuǎn)心端備線用于止血，使用動(dòng)脈夾夾住ICA遠(yuǎn)心端；在CCA剪一“v”形口，將尼龍線栓插入CCA內(nèi)，將尼龍線栓沿ICA管腔緩慢送入顱內(nèi)，直至送至大腦中動(dòng)脈（MCA）的起始端，線栓入顱的長(zhǎng)度應(yīng)距離ECA和ICA的分叉處約18 mm，將止血線收緊；手術(shù)傷口采用以生理鹽水浸濕的紗布覆蓋，并保持在37 ℃和一定的濕度；40 min后緩慢拔出尼龍線栓，結(jié)扎止血線；皮膚縫合。

參照Z(yǔ)ea Longa 5分制評(píng)分方法對(duì)手術(shù)后2 ～ 4 h的動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行評(píng)分[12]。0分：無(wú)神經(jīng)功能損傷；1分：輕微神經(jīng)功能缺損，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：對(duì)側(cè)前肢卷曲；3分：輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4分：嚴(yán)重向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；5分：對(duì)側(cè)偏癱。選取2分～ 3分的腦缺血再灌注模型大鼠于術(shù)后24 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.5 藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)[13-14]

采用生理鹽水將左旋奧拉西坦配制成3 mg·mL-1的溶液，并用0.22 μm的濾膜過(guò)濾，用于大鼠的尾靜脈注射。12只SD大鼠隨機(jī)分為兩組，即正常對(duì)照組和腦缺血再灌注模型組，每組6只，兩組大鼠以15 mg·kg-1的劑量尾靜脈注射給予左旋奧拉西坦，于給藥前及給藥后2、5、15、30、45、60、90、120、240 min通過(guò)大鼠眼眥靜脈取血250 μL置于肝素化EP管中，以4500 r·min-1離心15 min，分離出100 μL血漿，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣20 μL分析。

2.6 數(shù)據(jù)處理

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)采用DAS 2.0軟件計(jì)算，兩組大鼠參數(shù)的統(tǒng)計(jì)采用SPSS 20.0計(jì)算，組間比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P ＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 分析方法的確證

3.1.1 專屬性 在“2.1”色譜條件下，左旋奧拉西坦和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為5.12 min和6.19 min，空白血漿、空白血漿中加入左旋奧拉西坦和內(nèi)標(biāo)、大鼠給藥后的血漿樣品色譜圖見圖1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明左旋奧拉西坦和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定不受血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)干擾。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及定量下限 分別取空白血漿90 μL，加入10 μL左旋奧拉西坦系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成相當(dāng)于左旋奧拉西坦?jié)舛葹?.5、2.0、10.0、50.0、75.0、100.0 μg·mL-1的血漿樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，以左旋奧拉西坦?jié)舛龋╔）為橫坐標(biāo)，左旋奧拉西坦和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得相應(yīng)的回歸方程Y = 0.359 5 X + 2.532，r2=0.996 8，權(quán)重因子W = 1/X2。定量下限為0.5 μg·mL-1（S/N≥ 10）。質(zhì)控樣品的血漿樣品溶液同法配制，濃度分別為1、40、80 μg·mL-1。

圖1 大鼠血漿色譜圖注：A -空白大鼠血漿，B -空白大鼠血漿+左旋奧拉西坦（0.5μg·mL-1）+內(nèi)標(biāo)，C -大鼠靜注左旋奧拉西坦后1 h血漿；1 - 左旋奧拉西坦，2 - 內(nèi)標(biāo)Fig 1 Chromatograms of plasma in ratNote: A- blank rat plasma, B - blank rat plasma + S-oxiracetam(0.5 μg·mL-1) + internal standard, C - plasma sample 1 h after administration of S-oxiracetam to a rat; 1 - S-oxiracetam, 2 - internal standard

3.1.3 提取回收率 按“3.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及定量下限”項(xiàng)下操作配制質(zhì)控血漿樣品（1、40、80μg·mL-1，n = 3），按“2.3血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣分析得到左旋奧拉西坦血漿樣品峰面積A。另用甲醇配制成左旋奧拉西坦的標(biāo)準(zhǔn)溶液（10、400、800 μg·mL-1），除不加入空白血漿外，其余操作同“3.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及定量下限”項(xiàng)下操作，每個(gè)濃度平行做3份，進(jìn)樣分析得到左旋奧拉西坦血漿樣品峰面積B。左旋奧拉西坦的回收率為A/B的平均值×100%，結(jié)果三濃度質(zhì)控樣品的回收率分別為（97.4 ± 5.3）%、（98.3 ± 4.1）%、（96.0 ± 6.8）%，回收率均大于90%，且在待測(cè)濃度范圍內(nèi)，樣品低、中、高濃度的回收率穩(wěn)定（RSD ＜ 15%），符合生物樣品分析要求。

3.1.4 精密度和準(zhǔn)確度 實(shí)驗(yàn)樣品為質(zhì)控樣品（n =6），按“2.3血漿樣品處理”提取處理后進(jìn)樣，測(cè)定日內(nèi)和日間變異，隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度，并與理論濃度比較計(jì)算其準(zhǔn)確度。結(jié)果見表1，所有樣品的日內(nèi)RSD和日間RSD均小于15%，同時(shí)低、中、高3個(gè)濃度準(zhǔn)確度在85% ～ 115%范圍內(nèi)，符合生物樣品分析要求。

3.1.5 穩(wěn)定性 實(shí)驗(yàn)樣品為質(zhì)控樣品（n = 6），分別考察室溫放置6 h、- 20 ℃冰箱凍存10 d和進(jìn)樣倉(cāng)放置12 h的穩(wěn)定性。按“2.3血漿樣品處理”提取處理后進(jìn)樣，三種條件下的測(cè)得值和理論值無(wú)顯著性差異，顯示樣品在上述儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定，詳見表1。

表1 精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性結(jié)果. n = 6Tab 1 Results of precision, accuracy and stability. n = 6

3.2 藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果

在主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)中，正常對(duì)照組大鼠和腦缺血再灌注模型組大鼠的AUC0-t、AUC0-∞、MRT0-t、t1/2z、CLz和Vz具有顯著性差異（P ＜ 0.05）。推斷由于腦缺血再灌注模型組大鼠的病理狀態(tài)導(dǎo)致了藥物在體內(nèi)的代謝速率減慢，清除率降低，平均駐留時(shí)間延長(zhǎng)，所得的平均藥-時(shí)曲線和主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見圖2和表2。

4 討論

4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

圖 2 大鼠靜注左旋奧拉西坦后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線. n = 6,Fig 2 Plasma concentration-time profile of S-oxiracetam following single intravenous administration in rats. n = 6,

表2 大鼠靜注左旋奧拉西坦后的主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù). n = 6Tab 2 Pharmacokinetic parameters of S-oxiracetam following single intravenous administration in rats. n = 6,

表2 大鼠靜注左旋奧拉西坦后的主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù). n = 6Tab 2 Pharmacokinetic parameters of S-oxiracetam following single intravenous administration in rats. n = 6,

注：與正常對(duì)照組比較，*P ＜ 0.05Note: compare with the normal group, *P ＜ 0.05

參數(shù) 正常對(duì)照組 模型組AUC0-t/μg·mL-1·min-1 734.5 ± 193.8 1391.3 ± 403.8*AUC0-∞/μg·mL-1·min-1 772.7 ± 199.7 1436.9 ± 410.4*MRT0-t/min 27.1 ± 12.4 50.5 ± 17.8*t1/2z /min 34.6 ± 14.5 59.7 ± 18.1*CLz /L·min-1·kg-1 0.02 ± 0.009 0.01 ± 0.004 Vz /L·kg-1 3.1 ± 1.0 0.8 ± 0.3*Cmax /μg·mL-1 38.1 ± 25.6 35.0 ± 20.1

從左旋奧拉西坦結(jié)構(gòu)看出其紫外吸收較弱，通過(guò)紫外掃描發(fā)現(xiàn)，該化合物僅在210 nm波長(zhǎng)處附近有較強(qiáng)吸收。雖考慮到210 nm與甲醇的最大截止波長(zhǎng)205 nm比較接近，造成基線的擾動(dòng)可能較大，但是為得到更高的靈敏度，通過(guò)固定相和流動(dòng)相的優(yōu)化，選擇214 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，左旋奧拉西坦和內(nèi)標(biāo)物的吸收度相對(duì)均較大，色譜峰尖銳、穩(wěn)定，可用于定量。

4.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

本研究選擇左旋奧拉西坦的結(jié)構(gòu)類似物茴拉西坦作為內(nèi)標(biāo)，該化合物穩(wěn)定性良好，價(jià)廉易得，便于推廣使用。在本實(shí)驗(yàn)的色譜條件下，內(nèi)標(biāo)物和被測(cè)物得到了良好的分離，提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度，可以用于生物樣品中左旋奧拉西坦的定量檢測(cè)。

4.3 前處理方法確定

本研究探索了幾種血漿樣品前處理的方法，包括有機(jī)溶劑直接沉淀法，液液萃取法等。直接沉淀法會(huì)對(duì)血漿樣品進(jìn)行稀釋，大大降低了方法的靈敏度，無(wú)法成功用于大鼠體內(nèi)的左旋奧拉西坦的藥動(dòng)學(xué)研究；由于左旋奧拉西坦化合物的極性較大，采用常規(guī)的乙酸乙酯萃取法會(huì)顯著降低方法的回收率。因此，本研究采用甲醇沉淀蛋白后，吹干，再用小體積甲醇復(fù)溶的方法，簡(jiǎn)便易行，且提高了靈敏度。

4.4 色譜柱的選擇

由于左旋奧拉西坦的極性較大，采用普通C18色譜柱時(shí)保留時(shí)間太短，本研究通過(guò)不斷實(shí)踐，采用氨基柱作為固定相，得到了合適的左旋奧拉西坦和內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間和分離度。

4.5 臨床意義

本研究首次根據(jù)左旋奧拉西坦的理化性質(zhì)對(duì)色譜柱的填料類型、流動(dòng)相的組成及配比、紫外檢測(cè)波長(zhǎng)等條件進(jìn)行了摸索，最后采用了高效液相色譜法建立了大鼠血漿中左旋奧拉西坦的濃度測(cè)定方法，該法操作快速簡(jiǎn)便，方法穩(wěn)定，適用于大鼠體內(nèi)的左旋奧拉西坦藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究，以及其它相關(guān)的研究。左旋奧拉西坦在大鼠體內(nèi)代謝迅速，本研究采用腦缺血再灌注模型大鼠進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠和腦缺血再灌注模型大鼠的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)具有顯著性的差異，腦缺血再灌注模型組大鼠較正常組大鼠藥-時(shí)曲線下面積增加，消除速率減慢。因此該藥物在臨床應(yīng)用于腦缺血再灌注病人時(shí)，應(yīng)該注意其劑量的設(shè)計(jì)，從而保證藥物在臨床應(yīng)用過(guò)程中的安全性和有效性。當(dāng)然由于人類和大鼠的種屬差異明顯，左旋奧拉西坦在患者體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征仍需要進(jìn)一步評(píng)估。