生物功能化聚乙二醇基復(fù)合水凝膠的制備、性能研究及在感染創(chuàng)口修復(fù)中的初步應(yīng)用*

馮楊英凡， 陳楷文， 王華楠， 陳 陶， 季 平△

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，重慶 401120 2大連理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，大連 116000

傷口愈合過程由止血、炎癥、組織增殖和重塑4個階段組成，各階段相互交織且受到細胞、體液和分子信號等因素復(fù)雜而精細的調(diào)控[1]。皮膚屏障的破壞增加了病原微生物的侵入風(fēng)險，由此導(dǎo)致創(chuàng)口的局部微環(huán)境發(fā)生變化。傷口愈合過程中自身的調(diào)控受到微生物干擾后，大量炎性細胞堆積，成纖維細胞代謝和血管重建受損，最終傷口遷延不愈形成疤痕組織[1-2]。有研究表明傷口感染在住院患者中的比例高達67.5%，這不僅嚴重降低了患者的生活質(zhì)量，而且極大地消耗了醫(yī)療成本，造成了嚴重的社會經(jīng)濟負擔[3]。目前針對感染傷口等復(fù)雜愈合環(huán)境，各種傳統(tǒng)敷料如紗布、繃帶等，多為干性結(jié)合易產(chǎn)生傷口粘連，且不易攜帶藥物僅起到物理屏障的作用，因此促進愈合及防止感染的能力有限[4]。隨著對傷口愈合研究的深入及技術(shù)的發(fā)展，各種新型的傷口修復(fù)材料不斷更新并以加快傷口皮層細胞的修復(fù)過程并恢復(fù)組織功能為目的[5]，其中，水凝膠由于其獨特的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可作為新型感染傷口修復(fù)材料而受到研究者的廣泛關(guān)注。

水凝膠是水溶性分子通過物理交聯(lián)(氫鍵、主客體作用、離子鍵等)或動態(tài)化學(xué)鍵結(jié)合(亞胺鍵、二硫鍵等)所形成三維網(wǎng)絡(luò)[6]。這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中富含水分子，其內(nèi)部交錯的孔隙通道有利于細胞物質(zhì)交換及內(nèi)部負載藥物的擴散，使得水凝膠類材料在針對感染傷口，構(gòu)建藥用型傷口敷料上具有獨特的優(yōu)勢[6-7]。此外，水凝膠具有良好的生物力學(xué)性能和可塑性，成膠前大多可流動及注射，適用于感染、潰瘍等不規(guī)則慢性創(chuàng)口的覆蓋[6，8]。但水凝膠在傷口愈合的臨床轉(zhuǎn)化上依然存在機械性能與生物相容性難以平衡；成本高昂、合成復(fù)雜不適宜批量生產(chǎn)；對不同愈合的復(fù)雜環(huán)境缺乏針對性等問題[5，9-10]。如何在易于生產(chǎn)的前提下，選擇一種能可控地提升水凝膠的機械性能及生物相容性的水凝膠敷料，通過負載針對性藥物來進行抗菌及抗感染治療，對復(fù)雜病理環(huán)境下的傷口愈合具有重要的臨床意義。

課題組前期成功構(gòu)建了基于“纏結(jié)效應(yīng)”的新型合成策略，通過將分散性聚合物鏈引入初級共價網(wǎng)絡(luò)促進網(wǎng)絡(luò)物理纏結(jié)，形成雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠(DN)。該水凝膠選用簡單而低毒性的聚乙二醇(PEG)作為模型，具有可調(diào)節(jié)的機械性能和理想的生物相容性，易于制備，可批量生產(chǎn)，具有臨床運用的潛力[11]。但對于臨床常見的感染傷口，該水凝膠未負載針對性藥物，對細菌及炎癥的控制能力有限；加之PEG本身缺乏粘附位點，不利于成纖維細胞、表皮細胞等長入[12-13]，在感染傷口等復(fù)雜病理環(huán)境下的促愈合能力有限。因此，本研究擬在DN水凝膠中增加甲基丙烯酸酐化明膠(GelMA)，進一步改善DN水凝膠的生物相容性，構(gòu)建利于傷口愈合的微環(huán)境，同時加載抗菌藥物慶大霉素以控制感染，促進復(fù)雜病理環(huán)境下傷口愈合過程，為后期水凝膠的臨床應(yīng)用及建立藥用型水凝膠傷口敷料提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

所有化學(xué)品均至少采用分析試劑級。PEG(分子量：6000，35000 D)、丙烯酰氯(99%)、乙醚、二氯甲烷、2-羥基-4-(2-羥基乙氧基)-2甲基丙哌酮(Irgacure 2959)和明膠A(取自豬皮，300 Bloom)購自Sigma-Aldrich公司。以丙烯酰三乙胺(99%)、碳酸鉀(95%)、甲氧基酸酐為原料，采用加料法生產(chǎn)制備實驗所需水凝膠。

1.2 聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的制備

PEGDA的合成方式參照文獻進行[11]。將不同分子量的PEG溶于100 mL二氯甲烷，獲得澄清溶液后，在氮氣條件下緩慢加入過量丙烯酰氯和三乙胺，置于冰浴條件下充分反應(yīng)24 h。過濾沉淀并加入碳酸鹽溶液以除去氯酸。收集濾液后加入乙醚結(jié)晶，真空干燥24 h以獲得PEGDA。將所得PEGDA溶于去離子水，透析3 d純化(透析袋分子量3 500 D)，所得終產(chǎn)物真空干燥24 h備用。

1.3 甲基丙烯酸酐化明膠(GelMA)的制備

稱取10 g明膠加入100 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)，60℃攪拌至完全溶解。取2 mL甲基丙烯酸酐單體緩慢加入緩沖液，連續(xù)攪拌1 h后，加入200 mL磷酸鹽緩沖液猝滅反應(yīng)。將所得產(chǎn)物置于37℃透析純化3 d(透析袋分子量14000 D)，冷凍干燥24 h后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 合成DN-G復(fù)合水凝膠

稱取400 mg PEGDA溶于1 mL去離子水，40℃下攪拌溶解以制備40%(W/V)PEGDA溶液，加入400 mg PEG溶液(分子量按前期篩選，采用35 000D以構(gòu)建雙網(wǎng)絡(luò)體系)，制備DN水凝膠預(yù)聚液[11]。向DN水凝膠預(yù)聚液中添加GelMA進行初篩(1%、2%、5%，W/V)，40℃下充分混合溶解。最后，加入光引發(fā)劑I-2959使其質(zhì)量分數(shù)為0.3%。將混合均勻的復(fù)合物預(yù)聚液放置在紫外燈(365 nm，100 mW/cm2)下光照1 min后成膠(DN-G-1或DN-G-2)。實驗過程中充分混合5%GelMA的DN水凝膠成膠時間延長至3 min，為排除紫外光照時間對后續(xù)實驗的影響，添加的GelMA濃度選用1%及2%。純PEGDA水凝膠以相同步驟加入GelMA作為對照(PEG-G-1或PEG-G-2)。

1.5 水凝膠的微觀形態(tài)

通過掃描電子顯微鏡SEM觀察水凝膠形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)。將成膠后的水凝膠樣本置于真空干燥機中凍干48 h。切成薄片后的凍干水凝膠噴金后掃描檢測觀察。利用Image J軟件對水凝膠的孔徑進行分析。

1.6 力學(xué)性能檢測

通過壓縮測試檢測DN-G復(fù)合水凝膠的力學(xué)性能。按照1.4所述方法制備復(fù)合水凝膠預(yù)聚液并置于直徑1 cm，高度為1 cm的圓柱型模具中，紫外燈(365 nm，100 mW/cm2)下光照1 min成膠(DN-G)。室溫下，采用MTS-E43設(shè)備測試其壓縮性能，加載速度為10 mm/min，每種凝膠測試4個平行樣品，計算平均值和方差，并繪制應(yīng)力-應(yīng)變曲線。

1.7 復(fù)合水凝膠的生物相容性驗證

通過以下2種方式檢測水凝膠的細胞毒性：①將小鼠成纖維細胞L929于水凝膠上二維培養(yǎng)并進行CCK-8分析：將200 μL DN-G(或PEG-G)預(yù)聚液加入48孔板，按照1.4的方式成膠，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中浸沒預(yù)處理DN-G(或PEG-G)水凝膠24 h。采用純GelMA水凝膠作為陽性對照(濃度為5%)。將L929培養(yǎng)至對數(shù)生長期，胰酶消化后培養(yǎng)液中和并計數(shù)，在48孔板中以8000個/孔的密度接種。每2天更換培養(yǎng)液，動作輕柔以保證孔板底部水凝膠保持完整。在培養(yǎng)后不同時間點(1、4、7、10 d)進行CCK-8分析測定，并于450 nm下測量吸光度(A)值。細胞存活率(cell viability)通過如下公式進行計算：細胞存活率(%)=(A樣本-A空白/A對照-A空白)× 100%，式中：A樣本和A對照分別為樣品組和對照組的吸光度，A空白為單純基礎(chǔ)培養(yǎng)液即空白組的吸光度。每組實驗平行進行3次，取平均值。②將L929細胞置于水凝膠上進行二維培養(yǎng)并通過Live/Dead染色后置于熒光顯微鏡下觀察。將水凝膠成膠后用直徑為8 mm打孔器制作成圓形薄膜塊，厚度均為1.5 mm，48孔板中紫外滅菌處理2 h后，置于基礎(chǔ)培養(yǎng)液中37℃過夜預(yù)處理。將L929以1×104個/孔的密度接種。培養(yǎng)24 h進行Live/Dead染色，按照說明書中A液(Calcein AM)、B液(PI)均按1 μL/mL的濃度與Live/Dead染色工作液均勻混合，將種植了細胞的支架材料用PBS清洗3遍，隨后用Live/Dead染液37℃避光孵育30 min，并于熒光顯微鏡下觀察拍照，計數(shù)活細胞數(shù)目。每組隨機選取3個視野，實驗重復(fù)3次。

1.8 體外藥物釋放實驗及抗菌實驗

按照上述方式合成DN-G或PEG-G水凝膠后，使用10 mm打孔器打孔，制作大小均一，厚度為1 mm的水凝膠片。將水凝膠片置于5 mL 20 mg/mL的慶大霉素溶液中24 h以加載藥物，濾紙吸干水分并真空干燥。將載藥水凝膠片置于10 mL PBS(pH=7.2)緩沖液中，37℃溫箱中以60 r/min進行釋放實驗。在預(yù)先設(shè)置的時間間隔內(nèi)取出1 mL的釋放液，并補充相同體積的新鮮釋放液。釋放液中慶大霉素的含量通過衍生物反應(yīng)及紫外分光光度計進行測定[14]，以鄰苯二醛為衍生劑，檢測波長為332 nm。

實驗采用金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)檢測載藥水凝膠的抗菌性能，將含有或不含慶大霉素的DN-G(或PEG-G)水凝膠片置于2 mL金黃色葡萄球菌菌液中，菌液濃度采用梯度稀釋法稀釋至1×106CFU/mL，24 h后拍照記錄并取適量測定吸光度值，檢測波長600 nm，每組3個樣本并計算平均值。

1.9 感染傷口模型建立

選擇SPF級體質(zhì)量約250 g的Sprague Dawley雄性大鼠，背部脫毛，1%戊巴比妥麻醉并消毒后，用打孔器制造10 mm×10 mm的圓形皮膚全層缺損創(chuàng)面。傷口涂濃度為2×108CFU/mL的金黃色葡萄球菌50 μL，利用槍頭輕輕涂抹均勻，2 h后同樣操作再次接種1次，觀察傷口愈合情況。24 h后有淡黃色膿液滲出，創(chuàng)面邊緣出現(xiàn)炎癥反應(yīng)證明造模成功。

選擇12只SD雄性大鼠，按上述造模同法操作，在金黃色葡萄球菌傷口感染后，給予水凝膠敷料覆蓋傷口。將大鼠隨機分成3組，感染傷口未處理組(對照組)、DN-G組、DN-G+慶大霉素組(將慶大霉素溶于DN-G水凝膠預(yù)聚液中，藥物濃度為2%，GS/DN-G組)；每組4只小鼠，每天拍照記錄并觀察傷口愈合情況，隔天給予傷口換藥，以制造傷口時間為起點，21 d后處死取材，4%多聚甲醛固定后用于后續(xù)組織學(xué)評價。利用Image J軟件計算小鼠傷口愈合面積并統(tǒng)計傷口愈合率。

1.10 組織學(xué)評價

以形成傷口時間為1 d，在21 d后按照重慶醫(yī)科大學(xué)動物倫理標準處死實驗動物，取傷口皮膚標本并放于4%多聚甲醛中固定24 h后，制作石蠟切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察傷口的組織學(xué)變化。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

所有定量結(jié)果均使用Image J(v.1.8.0-172)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計并采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DN-G水凝膠的微觀形態(tài)及力學(xué)性能

實驗以初步探究GelMA在雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠DN中的最低有效濃度為目的。在DN水凝膠中加入5%的GelMA時，成膠時間延長至3 min，考慮紫外光照時間會影響水凝膠的交聯(lián)度及細胞毒性[13]，為保證實驗的一致性及DN水凝膠的性質(zhì)，實驗中在DN中加入GelMA的濃度選用1%及2%進行(成膠時間與DN水凝膠一致)。DN-G水凝膠的掃描電鏡觀察如圖1A所示。圖中可見DN-G水凝膠樣品均呈現(xiàn)出均勻的多孔結(jié)構(gòu)，1%及2%GelMA的加入均可將水凝膠的孔徑大小維持在16～24 μm(圖1B)。

通過壓縮實驗評估GelMA改性的復(fù)合DN水凝膠(DN-G)的機械性能。如圖2中所示，GelMA加入后DN水凝膠的壓縮模量及壓縮強度無明顯改變，形變量50%時壓縮強度在1500 Pa左右。

圖1 DN-G復(fù)合水凝膠掃描電鏡圖(A)及通過Image J軟件定量測量水凝膠孔徑大小(B)Fig.1 Representative scanning microscopic images of the lyophilized hydrogels of DN-G(A)and Corresponding evaluation of the porosity of the hydrogels using Image J software(B)

圖2 DN-G水凝膠的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線Fig.2 Compression stress-strain curves of the DN-G hydrogel

2.2 DN-G水凝膠的細胞相容性

實驗中常以細胞毒性作為材料生物應(yīng)用毒性評估的前期基礎(chǔ)，可檢測水凝膠在體內(nèi)實驗和臨床應(yīng)用中的潛在危害。我們將小鼠成纖維細胞L929二維培養(yǎng)于DN-G及其相應(yīng)組分的水凝膠上，通過CCK-8法測定成纖維細胞(L929)的存活率，評估材料的毒性大小。圖3為L929細胞在水凝膠上培養(yǎng)不同時間后CCK-8所測得的細胞活性?？梢钥闯?，1 d后各組間細胞活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，PEG-G及DN-G的細胞相對生長率均大于90%，可見材料用于細胞培養(yǎng)時無明顯細胞毒性。當培養(yǎng)時間延長至14 d時，PEG基水凝膠上的細胞增殖相對于陽性對照純GelMA組有所減慢，但DN-G水凝膠的細胞增殖趨勢好于PEG-G，其中DN-G-2的增殖好于其他PEG基水凝膠組及DN-G-1組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

同時，為了更為直觀地觀察細胞存活狀態(tài)及形態(tài)，通過Live/Dead染色觀察二維培養(yǎng)于水凝膠上的L929細胞。圖4是L929在不同水凝膠上培養(yǎng)24 h后的共聚焦顯微鏡成像。如圖所見，細胞存活狀態(tài)良好，無明顯細胞死亡，在陽性對照純GelMA水凝膠上細胞基本呈現(xiàn)梭型或多邊形，PEG-G及DN-G水凝膠上均可見部分細胞聚集并多為球形，GelMA的加入對成纖維細胞的鋪展有所改善，其中DN-G-2中細胞鋪展呈梭型的情況較多。根據(jù)細胞增殖及鋪展情況，后續(xù)實驗中DN-G均采用2%GelMA進一步驗證。

與DN-G-2組比較，*P<0.05圖3 L929細胞在不同水凝膠表面隨培養(yǎng)時間延長的增殖變化Fig.3 The proliferation of L929 cells cultured on the surface of the different gels as a function of culture time

2.3 DN-G水凝膠加載慶大霉素后的體外釋放及抗菌實驗

水凝膠本身的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可作為藥物緩釋系統(tǒng)，在感染傷口釋放藥物抑制細菌增殖。實驗采用水凝膠吸收硫酸慶大霉素并監(jiān)測其對藥物釋放的影響，結(jié)果如圖5A所示。在pH=7.4緩沖溶液中，3種水凝膠聚合物在前2 h時釋放相對較快，均達到近30%，這主要來源于水凝膠表面負載藥物的擴散；隨后藥物的釋放呈緩慢上升趨勢，DN-G水凝膠相對更為平穩(wěn)，72 h的藥物釋放量為63%，藥物釋放性能良好。載藥水凝膠的抑菌實驗如圖5B，與未負載藥物的水凝膠對比，負載慶大霉素的DN-G水凝膠(GS/DN-G)72 h后培養(yǎng)液相對于其他組較為澄清，細菌生長受到抑制，具有良好的抗菌能力。

圖4 L929細胞在不同水凝膠表面培養(yǎng)24 h時Live/Dead細胞染色情況(標尺=100 μm)Fig.4 Representative fluorescence microscopic images of Live/Dead staining for L929 cells cultured on different hydrogels for 24 h(Scale bar=100 μm)

圖5 不同水凝膠負載慶大霉素的藥物累計釋放(A)及負載或不負載慶大霉素的不同水凝膠的抗菌活性及72 h細菌培養(yǎng)的宏觀圖片(B)Fig.5 Cumulative release of hydrogels loading gentamicin(A).Antimicrobial activity evaluation of various hydrogels loading gentamicin or not against S.aureus after 1 and 3 day(s) of culture；Representative photographs showing bacterial culture with different hydrogels after 3 days(B)

2.4 DN-G水凝膠加載慶大霉素用于感染傷口的治療作用

選擇SD大鼠構(gòu)建的感染傷口模型評價復(fù)合水凝膠作為傷口敷料的治療作用，實驗分別設(shè)置DN-G組，GS/DN-G組和感染傷口未處理組(對照組)。由圖6A可見，GS/DN-G組相對于其他兩組傷口愈合速度較快，21 d后傷口基本痊愈。傷口愈合面積的統(tǒng)計分析結(jié)果顯示(圖6B)：DN-G組與對照組傷口愈合速率相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；第4 天，傷口愈合在GS/DN-G組出現(xiàn)改善趨勢(無統(tǒng)計學(xué)差異)，第7天后GS/DN-G組傷口愈合面積明顯減小，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，第21天后感染傷口基本愈合。

圖6 SD大鼠背部感染傷口愈合圖片(A)及不同時間SD大鼠背部感染傷口愈合面積(B)Fig.6 Representative photographs showing the healing process of the skin wounds at different time points after treatments using the different treatments(A)and quantitative analysis of wound size of gradually healing wounds on day 21 after treatments(B)

2.5 組織學(xué)評價

通過HE染色對傷口進行組織學(xué)評價，如圖7所示：對照組仍可見大量炎性細胞，肉芽組織形成較厚的瘢痕，幾乎無上皮組織向傷口中心長入；DN-G組仍存在一定程度的炎性浸潤，可見瘢痕組織；GS/DN-G組炎性細胞浸潤聚集相對于前兩組明顯減輕，可見纖維細胞及血管等結(jié)構(gòu)，上皮向傷口中心長入使得傷口間隙減小，疤痕增生不明顯。

A：GS/DN-G組；B：DN-G組；C：對照組；下圖為黑色方框的放大圖圖7 不同處理組小鼠傷口愈合21 d后組織HE染色Fig.7 Representative HE staining of the skin wounds after 21 days of treatment

3 討論

傷口的愈合過程易受到一系列因素如年齡、全身基礎(chǔ)性疾病、感染及異物等的影響，其中微生物定植帶來的感染是如今導(dǎo)致傷口遷延不愈最為重要的因素[2]。細菌在傷口定居并繁殖，與應(yīng)激產(chǎn)生的炎癥細胞共同消耗大量氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，進而成纖維細胞代謝及增殖受損，導(dǎo)致傷口愈合的炎癥期延長，增殖和重塑期推遲[15]。此外，機體免疫細胞吞噬細菌后釋放蛋白酶和氧自由基，破壞膠原沉積形成大量疤痕組織[15-16]。對于慢性感染傷口，現(xiàn)有的傷口敷料總體治療效果不佳且治療費用較高，因此，開發(fā)能夠早期抑菌、控制炎癥、加快皮層細胞增生的針對性敷料一直是傷口愈合的研究重點及熱點。近年來水凝膠類材料所構(gòu)建的三維網(wǎng)絡(luò)體系使其柔軟且含水量高，與軟組織及細胞外基質(zhì)的性能匹配的同時可作為藥物輸送系統(tǒng)，因而受到研究者的廣泛關(guān)注[7，17]。事實上，目前已有部分研究將水凝膠材料用于治療感染傷口，以自身抗菌類水凝膠及負載抗菌劑的水凝膠最為常見，前者以殼聚糖及其衍生物為代表，通過聚合物分子自身實現(xiàn)廣譜抗菌但其作用非常有限[18]；后者則形式多樣，通過負載無機或有機抗菌劑抑制感染，構(gòu)建利于促進愈合的微環(huán)境，但水凝膠的成膠時間、機械性能及藥物釋放等仍需進一步的精確控制[18-19]。

本課題組前期基于“網(wǎng)絡(luò)纏結(jié)效應(yīng)”，選用低毒性、低免疫原性PEG構(gòu)建了機械性能可控的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠(DN)，但對于感染等復(fù)雜的病理性傷口愈合環(huán)境，DN水凝膠缺乏對細菌感染的有效控制，且PEG缺乏粘附位點不利于引導(dǎo)成纖維細胞等宿主細胞的生長[11-12]。因此，本實驗在DN水凝膠中增加了GelMA以促進成纖維細胞的增殖及鋪展，以改善愈合環(huán)境，促進傷口增殖及重塑的發(fā)生；同時，為減少細菌定植、控制早期炎癥，實驗在DN-G水凝膠內(nèi)負載了慶大霉素，通過局部緩釋作用達到早期抑菌，減少炎癥細胞的產(chǎn)生，進而有效地促進了感染傷口的愈合。

事實上，水凝膠作為良好的細胞外基質(zhì)類似物，具有適宜的機械性能，能夠維持細胞所需微環(huán)境進而調(diào)節(jié)細胞的行為[20]，這也為研究者通過改善水凝膠的性能，構(gòu)建感染等病理狀態(tài)下傷口愈合所需微環(huán)境提供了新的思路。如Zhu等[21]在PPCN溫敏性水凝膠上修飾了特征性短肽A5G81，增強整合素β3的作用以促進細胞遷移及增殖，從而改善了糖尿病慢性感染情況下的傷口愈合。現(xiàn)已有大量研究驗證了細胞外基質(zhì)的機械性能如剛度、應(yīng)力松弛、粘附受體濃度等均可顯著調(diào)節(jié)細胞的增殖、鋪展及分化[22-24]。但眾所周知，PEG作為人工合成類水凝膠缺乏粘附位點而對細胞的調(diào)控作用有限[12-13]，在感染等本就存在成纖維細胞功能受限的慢性傷口愈合的環(huán)境中，PEG基水凝膠的應(yīng)用受到限制?？紤]GelMA來源于天然細胞外基質(zhì)，簡單易得且保留了天然的細胞結(jié)合位點如RGD及基質(zhì)金屬蛋白酶解位點等[24]，本實驗通過在雙網(wǎng)絡(luò)纏結(jié)水凝膠DN中加入GelMA，初步篩選改善成纖維細胞增殖及鋪展的最小有效濃度，使水凝膠可進一步模擬細胞外基質(zhì)的自然狀態(tài)從而推動機體自身愈合進程。同時，DN-G水凝膠維持了DN雙網(wǎng)絡(luò)纏結(jié)水凝膠的孔徑大小及機械性能，允許物質(zhì)擴散及細胞長入，使得DN-G具有作為三維細胞支架的潛能，有利于后續(xù)進一步探究粘附位點的調(diào)控機制及作用。但值得注意的是直接物理共混高濃度的GelMA可能影響水凝膠的成膠效能(在DN水凝膠中加入5%GelMA使得成膠時間延長)，這可能是由于GelMA與PEGDA發(fā)生共價交聯(lián)，影響次級物理纏結(jié)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建有關(guān)，這提示后續(xù)研究可采用如接枝RGD短肽等方式提供粘附位點，保證纏結(jié)發(fā)生的同時精確調(diào)控細胞行為。

此外，水凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)及貫穿通道在運載藥物及生物活性分子上具有得天獨厚的優(yōu)勢。DN-G水凝膠負載慶大霉素后有效抑制了感染傷口的炎癥，加速愈合，這可歸功于水凝膠良好的載藥能力，其局部緩釋作用使藥物持續(xù)維持一定濃度從而在早期抑制細菌增殖，避免大量炎性細胞堆積，改善了感染傷口愈合的環(huán)境，成纖維細胞得以進入傷口床觸發(fā)后續(xù)愈合過程[25-26]。此外，使用水凝膠局部運載藥物治療感染傷口，可降低全身用藥所帶來的不良反應(yīng)，在局部維持藥物的治療濃度，這對于局部感染性傷口的治療具有重要意義[25]?，F(xiàn)已有部分研究關(guān)注水凝膠自身材料的改性或?qū)Χ喾N藥物聯(lián)合應(yīng)用釋放策略的調(diào)整，以使水凝膠得以適應(yīng)感染傷口愈合的復(fù)雜環(huán)境[26-27]，但在水凝膠類材料作為感染傷口愈合敷料的臨床轉(zhuǎn)化上，仍然需要進一步建立精確的控制策略，實現(xiàn)對藥物釋放的靶向及時空控制，通過建立針對復(fù)雜環(huán)境的控釋體系以應(yīng)對感染等病態(tài)條件下的愈合延遲。

綜上所述，本實驗基于前期“纏結(jié)效應(yīng)”合成的PEG基雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠(DN)，通過GelMA生物功能化改性形成復(fù)合水凝膠DN-G，可維持穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及良好的機械性能，GelMA的加入為細胞提供了DN水凝膠缺乏的細胞粘附位點，可有效促進成纖維細胞在水凝膠網(wǎng)絡(luò)中的增殖及鋪展；另外，我們利用水凝膠良好的載藥性能，將負載慶大霉素的復(fù)合水凝膠DN-G用于感染傷口，達到持續(xù)抗菌及促進愈合的作用，驗證了DN-G水凝膠搭載藥物用于病理狀態(tài)下復(fù)雜環(huán)境傷口愈合的潛力?？傊珼N-G水凝膠提供了一種成本低廉且操作簡單的生物材料策略，可以作為一種新型的水凝膠敷料用于感染創(chuàng)面的保護及治療。