羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白酶法提取工藝及特性研究

王 晴，錢(qián)玉梅，李紅俠，陳紅玲

(1.宿州學(xué)院，安徽 宿州 234000； 2. 宿州市天然產(chǎn)物與功能性食品工程技術(shù)研究中心，安徽 宿州 234000)

0 引言

近些年來(lái)，我國(guó)漁業(yè)發(fā)展迅速，已躋身于全球第一漁業(yè)大國(guó)，在加工生產(chǎn)過(guò)程中不可避免地產(chǎn)生魚(yú)皮、魚(yú)鱗、魚(yú)鰾等廢棄物，這些廢棄物的充分利用可以提高漁業(yè)加工的附加價(jià)值，增加經(jīng)濟(jì)效益，反過(guò)來(lái)促進(jìn)漁業(yè)的發(fā)展[1-2]。經(jīng)研究表明魚(yú)皮中含有豐富的膠原蛋白，膠原蛋白是一種白色不透明無(wú)支鏈的纖維狀蛋白質(zhì)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和食品工業(yè)中，例如功能食品、食品添加劑、食品包裝材料等[3]，因此以水產(chǎn)加工廢棄物魚(yú)皮為原料制備膠原蛋白具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。以羅非魚(yú)魚(yú)皮為材料，采用胃蛋白酶法提取，利用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化胃蛋白酶酶法提取的最優(yōu)條件，并對(duì)胃蛋白酶法提取的膠原蛋白的溶解性能和保水性能進(jìn)行研究，為水產(chǎn)膠原蛋白的進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)，以期提高漁業(yè)的附加價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚(yú)魚(yú)皮(廣東湛江水產(chǎn)有限公司)、胃蛋白酶、無(wú)水乙醇、氯化鈉、硫酸銅、氫氧化鈉、硫酸、氯胺T、乙酸等均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)等。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-723分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)、GL-23M高速離心機(jī)(湖南湘儀集團(tuán))等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 羅非魚(yú)魚(yú)皮的預(yù)處理

將去鱗魚(yú)皮剪碎(約3 × 3 mm)，用 0.1 M NaOH溶液浸泡24 h，以去除脂肪和部分雜蛋白，然后洗至中性，再用正己烷浸泡脫脂24 h，真空冷凍干燥后，粉碎(10目)[4]。

1.3.2 胃蛋白酶法提取魚(yú)皮膠原蛋白單因素試驗(yàn)

將粉碎后的魚(yú)皮置于含有胃蛋白酶(200 U/mg)的預(yù)冷0.5 M乙酸溶液中，調(diào)節(jié)pH，并于水浴鍋中在一定溫度下連續(xù)攪拌提取一定時(shí)間，取上清，緩慢加入NaCl至最終濃度0.9 M，鹽析過(guò)夜，然后2 500 g離心30 min，棄上清，將沉淀溶解于含1.0 M NaCl的Tris-HCl緩沖液中，再次于20 000 g離心1 h，取上清透析脫鹽48 h得到膠原蛋白提取液[5]。

1.3.3膠原蛋白提取率測(cè)定

羥脯氨酸含量按GB/T 9695.23-2008測(cè)定，膠原蛋白提取率含量按下式計(jì)算[4]：

其中，X——膠原蛋白提取率，%；c——羥脯氨酸含量；11.1——換算系數(shù).

1.3.4正交試驗(yàn)

以單因素結(jié)果為依據(jù)建立因素水平表(表1)，以膠原蛋白提取率為評(píng)判指標(biāo)，按照L9(34)正交表來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化方案的設(shè)計(jì)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表

1.3.5 溶解性測(cè)定

酶解提取的膠原蛋白冷凍干燥，取一定質(zhì)量溶于0.5 mol/L醋酸中，使得濃度為5 mg/mL。取5 mL分別調(diào)至pH為2、3、4、5、6、7、8、9，保持pH值不變，蒸餾水定容至10 mL， 4000 r/min離心15 min，，雙縮脲法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)含量，并同時(shí)將樣品溶于0.5 mol/L醋酸溶液，采用雙縮脲法測(cè)定樣品總蛋白含量，用公式(1)計(jì)算溶解性[6]。

(1)

1.3.6 保水性測(cè)定

量取50 mL蒸餾水，加入凍干后的膠原蛋白 0.05 g，攪拌，置于1000 r/min條件下離心5 min，棄分離水，稱(chēng)量殘留物質(zhì)量，并置于25℃干燥箱中，每隔20 min測(cè)一次質(zhì)量，按公式(2)計(jì)算水分殘存率[6]，以測(cè)定其保水性強(qiáng)弱。

(2)

式中：Y表示水分殘存率%；m0表示離心剩余物質(zhì)量/g；m表示每隔一段時(shí)間剩余物質(zhì)量/g。

2結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

設(shè)置酶解溫度40℃，料液比1:70，pH 3，酶解時(shí)間分別為5、10、15、20、25 h時(shí)，膠原蛋白的提取率如圖1所示，當(dāng)提取時(shí)間較短時(shí)，膠原蛋白尚未被完全酶解，故隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，膠原蛋白與酶能夠充分結(jié)合，反應(yīng)速率加快，膠原蛋白的酶解量不斷增大，膠原蛋白提取率也不斷增加，但當(dāng)膠原蛋白提取率上升到某一極限值后，再延長(zhǎng)提取時(shí)間則對(duì)膠原蛋白提取率影響較小[7]。因此，從使膠原蛋白充分被酶解且節(jié)省時(shí)間的角度考慮，最適宜提取時(shí)間選取15 h。

圖1 提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響 圖2 提取溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響

2.1.2提取溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響

設(shè)置酶解時(shí)間15 h，料液比1:70，pH 3，酶解溫度分別為40、45、50、55、60、65℃時(shí)，膠原蛋白的提取率如圖2所示，在35～50 ℃時(shí)，膠原蛋白提取率隨溫度的上升持續(xù)增加，但當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃，膠原蛋白提取率出現(xiàn)下降，因?yàn)闇囟冗^(guò)高，不利于胃蛋白酶活性的發(fā)揮，致使其酶解作用減弱[8]。因此，最適提取溫度選用50 ℃。

2.1.3料液比對(duì)膠原蛋白提取率的影響

設(shè)置酶解時(shí)間15 h，酶解溫度50 ℃，pH 3，料液比分別為1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90 g/mL時(shí)，膠原蛋白的提取率如圖3所示，料液比位于1:40至1:70之間，膠原蛋白提取率不斷上升，料液比為1:80時(shí)，膠原蛋白提取率開(kāi)始下降，可能由于當(dāng)液料比低于1:70時(shí)，膠原蛋白酶解時(shí)溶劑不充足，當(dāng)料液比大于1:70時(shí)，溶劑開(kāi)始過(guò)量，此時(shí)酶解液稀釋?zhuān)z原蛋白提取率反而降低[9]，因此料液比選為1:70。

2.1.4 pH對(duì)膠原蛋白提取率的影響

設(shè)置酶解時(shí)間15 h，酶解溫度50 ℃，料液比1:70，pH分別為1、2、3、4、5、6時(shí)，膠原蛋白的提取率如圖4所示，pH小于3時(shí)，膠原蛋白提取率隨酸性減少而增加，當(dāng)pH值增加到3時(shí)，膠原蛋白提取率最大，隨后便隨著酸性減少而減低。且酸性越低降低越迅速，表明pH值過(guò)低或過(guò)高均會(huì)對(duì)胃蛋白酶的活性有所抑制，可能通過(guò)影響胃蛋白酶分子的構(gòu)象、解離狀態(tài)及膠原蛋白的解離狀態(tài)，進(jìn)而影響胃蛋白酶活力和酶解反應(yīng)速率，另一方面，較高的pH可能引入更多的雜質(zhì)離子，污染反應(yīng)環(huán)境[10]。所以，胃蛋白酶提取膠原蛋白的最適pH為3。

圖3 料液比對(duì)膠原蛋白提取率的影響 圖4 pH對(duì)膠原蛋白提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

如表2所示，四個(gè)因素主次順序?yàn)锳>B>C>D，最優(yōu)條件組合為A2B2C1D1，即最佳的提取條件為酶解時(shí)間15 h、酶解溫度50 ℃、料液比1:60、pH為2。按照最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得膠原蛋白提取率為90.3%，高于表2中各組合的膠原蛋白提取率，說(shuō)明了該方法可靠定，因此可用于優(yōu)化胃蛋白酶酶解提取膠原蛋白的最佳提取工藝條件。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 酶法提取膠原蛋白特性分析

2.3.1羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白溶解性能

從圖5可以看出，隨著pH值的上升，羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白的溶解度呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢(shì)，在酸性條件下溶解性能大于堿性，且酸性越高，溶解性能越好，pH在3以下，膠原蛋白溶解度達(dá)70%以上，當(dāng)pH超過(guò)3，溶解性能開(kāi)始迅速下降，中性條件下，溶解性能僅為25%左右。膠原蛋白溶解性隨 pH 的變化跟其等電點(diǎn)位置有關(guān)，當(dāng)處于等電點(diǎn)，兩性離子達(dá)到電荷平衡，溶解度達(dá)到最低，因此結(jié)果表明羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白等電點(diǎn)位于7 附近。

圖5 羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白溶解性能 圖6 羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白保水性能

2.3.2羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白保水性能

由圖6可以看出，胃蛋白酶法提取的羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白水分殘存率隨時(shí)間增加現(xiàn)迅速后緩慢降低，但在360 min后仍保持在90%以上，可見(jiàn)其保水性能較好，可能由于胃蛋白酶酶切位點(diǎn)使得膠原蛋白暴露了較多的親水基團(tuán)。

3 結(jié)論

研究了酶解時(shí)間、酶解溫度、料液比、pH對(duì)胃蛋白酶提取羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白提取率的影響，得到最佳酶解條件：酶解時(shí)間15 h、酶解溫度50 ℃、料液比1:60、pH為2時(shí)，膠原蛋白提取率高達(dá)90.3%，該法提取的膠原蛋白溶解性能及保水性能較好，本研究為漁業(yè)資源的有效利用及膠原蛋白的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。