染色質(zhì)重建因子BRG1介導(dǎo)Ile調(diào)節(jié)牛乳腺上皮細(xì)胞乳合成分子機(jī)理研究

高學(xué)軍，王 哲，祁 昊，王璐璐，甄 貞

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

牛奶中富含脂肪[1]。通過提高飼養(yǎng)水平，可增加牛奶中蛋白質(zhì)和脂肪含量，提高牛乳品質(zhì)。氨基酸通過 mTOR（Mechanistic target of rapamycin）途徑激活翻譯機(jī)制，影響牛乳蛋白基因表達(dá)[1-2]。支鏈氨基酸（Branched chain amino acid，BCAA）調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡及蛋白質(zhì)合成[3]。泌乳期間BCAA 在乳腺中轉(zhuǎn)運(yùn)較高[4]。Ile 和亮氨酸獨(dú)立調(diào)節(jié)牛乳腺組織mTOR 信號(hào)途徑中S6K1 磷酸化及蛋白質(zhì)合成[5]。氨基酸作為蛋白質(zhì)合成底物以外細(xì)胞生理信號(hào)分子，可通過G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR）、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體、磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinosi?tol 3-kinase，PI3K）和mTOR[6]調(diào)節(jié)細(xì)胞生理活動(dòng)，mTOR 激活后促進(jìn)核糖體蛋白S6 激酶1（S6 kinase 1，S6K1）磷酸化。S6K1 磷酸化可增加編碼核糖體蛋白如多聚腺苷酸結(jié)合蛋白。因此，S6K1 激活導(dǎo)致mRNA翻譯過程中蛋白質(zhì)合成量增多。mTOR激活后促進(jìn)生脂轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 1c（Sterol regulatory element binding protein 1c，SREBP-1c）基因表達(dá)和成熟，促進(jìn)細(xì)胞中脂肪合成[7]。部分氨基酸可通過調(diào)節(jié)BMECs 的mTORS6K1 等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)乳蛋白和乳脂肪合成。賴氨酸通過GPRC6A-PI3K信號(hào)通路促進(jìn)脂肪酸誘導(dǎo)的BMECs 乳脂合成[8]。蛋氨酸通過SNAT2-PI3K-mTOR 等信號(hào)通路促進(jìn)乳蛋白和脂肪合成及細(xì)胞增殖[9]。有關(guān)Ile 調(diào)節(jié)BMECs 中乳合成作用和分子機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。

ATP 依賴性染色質(zhì)重建因子Brahma-related gene 1（BRG1）是由SMARCA4基因編碼的染色質(zhì)重建蛋白，是具有ATP 酶活性的哺乳動(dòng)物開關(guān)/蔗糖不可發(fā)酵（SWItch/Sucrose non-fermentable，SWI/SNF）類染色質(zhì)重建復(fù)合物核心成分。BRG1包括催化ATP 酶結(jié)構(gòu)域，C-末端溴域、AT-掛鉤基序和N-末端區(qū)域等多個(gè)結(jié)構(gòu)域[10]。BRG1通過與轉(zhuǎn)錄因子和其他輔助因子相互作用影響基因激活和抑制[11]。在人類結(jié)腸癌細(xì)胞中，通過抑制PI3K/AKT通路，BRG1基因敲除下調(diào)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1表達(dá)水平[12]。BRG1 等SWI/SNF 成員調(diào)節(jié)基因表達(dá)機(jī)制是生命科學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一，有關(guān)BRG1調(diào)節(jié)基因表達(dá)分子機(jī)理研究尚待深入。

目前BMECs 中BRG1 對(duì)乳合成是否具有調(diào)節(jié)作用，BRG1是否介導(dǎo)氨基酸調(diào)節(jié)乳合成尚未見報(bào)道。本研究擬揭示BRG1 介導(dǎo)Ile 調(diào)節(jié)BMECs 中乳蛋白和乳脂肪合成作用和分子機(jī)理，旨在闡明Ile通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)重建調(diào)節(jié)乳合成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

試劑：DMEM/F12 粉末、Opti-MEM?I（1×）Reduced Serum Medium（31985-070）及胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）均購(gòu)自Gibco公司（美國(guó)）。Ile粉末（S20042）購(gòu)自源葉生物。BODIPY 493/503、Lipofectamine?3000 Reagent（L3000001）購(gòu)自Invitro?gen 公司（美國(guó)）。TG GPO（Glycerophosphate oxi?dase）-POD（peroxidase）Assay kit購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。BRG1 一抗（21634-1-AP）購(gòu)自Proteintech 公司。β-casein（bs-10032R）和SREBP-1c（14088-1-AP）抗體均購(gòu)自北京博奧森公司。AKT（sc-1618）、p-AKT (Thr308)（sc-135650）、βactin（sc-47778）和cytokeratin 18（sc-51582）均購(gòu)自Santa Cruz 公司。HRP 標(biāo)記二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（3 111）購(gòu)自Thermo 公司（美國(guó)）；倒置相差顯微鏡（DFC280）、激光掃描共聚焦顯微鏡（TCS SP2）和DLMB-2 正置熒光顯微鏡均購(gòu)自Leica 公司（德國(guó)）；MiniChemiTM化學(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)自北京賽智公司。

1.2 材 料

奶牛乳腺組織取自健康泌乳期中國(guó)荷斯坦奶牛（黑龍江雙城屠宰場(chǎng)）。通過組織塊培養(yǎng)法利用DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)原代細(xì)胞，培養(yǎng)純化方法參照文獻(xiàn)[13]。將純化后上皮細(xì)胞制成細(xì)胞爬片，利用上皮細(xì)胞分子標(biāo)志角蛋白18（Cytokeratin，CK18）作鑒定[11]。

1.3 Ile 對(duì)BMECs 乳合成調(diào)節(jié)及其相關(guān)信號(hào)通路的影響

取純化后生長(zhǎng)狀態(tài)良好BMECs，待細(xì)胞在六孔板中長(zhǎng)至30%～40%，更換不含F(xiàn)BS 的Opti-MEM I 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，分別添加至終濃度為0、0.25、0.5、0.75、1.0 和 1.25 mmol·L-1的 Ile，24 h后作Western blot、甘油三酯檢測(cè)及脂滴染色。

1.3.1 Western blot檢測(cè)

適量2×SDS 上樣緩沖液使細(xì)胞充分裂解，提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白。采用Western blot 技術(shù)檢測(cè)β-酪蛋白（β-casein）、SREBP-1c、S6K1、p-S6K1、BRG1 蛋白水平變化。按說明書操作配制SDSPAGE 凝膠。點(diǎn)樣后4 ℃條件下作SDS 凝膠電泳，恒壓80 V，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠界面時(shí)調(diào)節(jié)電壓為120 V，待電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)，恒壓75 V轉(zhuǎn)膜90 min。根據(jù)目的條帶分子質(zhì)量長(zhǎng)度剪膜。37 ℃恒溫?fù)u床封閉2 h；將NC 膜置于含對(duì)應(yīng)一抗稀釋液中4 ℃搖床過夜孵育。第2天，使用辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗于37 ℃恒溫?fù)u床孵育90 min。以β-actin 為內(nèi)參，使用Sag Capture 掃描蛋白條帶，ImageJ 64 SAAinc讀取蛋白灰度值。

1.3.2 甘油三酯檢測(cè)

制備細(xì)胞培養(yǎng)液上清，利用甘油三酯（Triglyc?eride，TG）酶法測(cè)定試劑盒檢測(cè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中TG含量。

1.3.3 脂滴染色

1 mL 4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min；PBS 洗2～3 遍，每次 10 min，1 μg·mL-1BODIPY 避光室溫染色 15 min；PBS 清洗 2～3 次，每次 10 min；1 μg·mL-1DAPI 標(biāo)記細(xì)胞核，37 ℃避光孵育 15 min；PBS 清洗 2～3 次，每次 10 min。在熒光顯微鏡觀察脂滴熒光染色情況，作熒光掃描和定量分析。用ImageJ 64 SAAinc 軟件分析每個(gè)細(xì)胞內(nèi)脂滴的面積積分光密度（Area-intergrated optical density,AIOD）。

1.4 Ile 介導(dǎo)BRG1 對(duì)乳蛋白、乳脂肪及其相關(guān)信號(hào)調(diào)節(jié)分子的影響

由上海吉瑪公司購(gòu)買3 組BRG1 干擾片段以及陰性RNA 對(duì)照（Negative control，NC），從3 條siR?NA 中篩選最有效的一條干擾片段（正義鏈：5'GCAUUCUUCAGCAUGCCAATT 3'，反義鏈：5'UUGGCAUGCUGAAGAAUGCTT 3'）用于 BRG1 siR?NA 干擾片段轉(zhuǎn)染。分為4 組：空白組、添加Ile組、空白對(duì)照同時(shí)轉(zhuǎn)NC組和添加Ile同時(shí)轉(zhuǎn)干擾片段組。利用Lipo3000 作轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，待細(xì)胞在六孔板中長(zhǎng)至 60%～70%；將混合物A（120 μLOpti-MEM I+5 μLLipo3000 轉(zhuǎn)染試劑）、B（120 μLOpti-MEM I + 5 μL BRG1siRNA）混合后靜置5 min；每孔加入1.25mL不含抗生素的Opti-MEM I培養(yǎng)基；靜置15 min 后將干擾片段與轉(zhuǎn)染試劑混合物逐滴加入六孔板。24 h收樣，作Western blot檢測(cè)SREBP-1c、S6K1、p-S6K1、BRG1、β-casein 蛋白表達(dá)。Western blot檢測(cè)方法同1.3.1。

1.5 PI3K對(duì)乳合成相關(guān)調(diào)節(jié)信號(hào)通路的影響

添加PI3K 抑制劑LY294002，分為4 組：正常培養(yǎng)組、添加Ile 組、空白對(duì)照同時(shí)加LY294002、添加Ile同時(shí)加LY294002組。待細(xì)胞在六孔板中匯合度為60%時(shí)，更換Opti-MEMⅠ培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)細(xì)胞 24 h。按照分組添加 Ile（0.75 mmol·L-1）和LY294002（15 μmol·L-1），處理 24 h，收集細(xì)胞，制備蛋白樣品。檢測(cè)BRG1、p-S6K1、S6K1、p-AKT、AKT 和SREBP-1c 蛋白水平變化。Western blot操作方法同1.3.1。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用ImageJ 64 SAAinc對(duì)Western blot條帶作灰度分析，對(duì)熒光染色圖片作AIOD 分析。采用SPSS 17.0 軟件對(duì)多組數(shù)據(jù)之間作方差分析。數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SE）表示，每組至少重復(fù)3次。不同肩標(biāo)小寫字母表示數(shù)據(jù)彼此差異顯著（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ile對(duì)BMECs乳合成的調(diào)節(jié)

不 同 濃 度 Ile（0、 0.25、 0.5、 0.75、 1.0 和1.25 mmol·L-1）處理BMECs 24 h后，Western blot 分析顯示，隨Ile濃度增加，細(xì)胞內(nèi)β-casein（見圖1A和1B）蛋白水升高，并在0.75 mmol·L-1處達(dá)到峰值，隨后蛋白水平下降。Ile 處理顯著增加培養(yǎng)基中TG 含量（見圖1C）并促進(jìn)細(xì)胞中脂滴積累（見圖1D和1E），在0.75 mmol·L-1處作用最顯著，隨后下降。以上數(shù)據(jù)表明Ile 以劑量依賴方式刺激BMECs乳蛋白、乳脂合成。

2.2 Ile對(duì)BMECs乳合成相關(guān)信號(hào)分子途徑的影響

不同濃度 Ile 處理細(xì)胞 24 h 后，Western blot 分析進(jìn)一步確定Ile處理增加S6K1磷酸化并顯著上調(diào)SREBP-1c蛋白質(zhì)水平，且在0.75 mmol·L-1Ile處理出現(xiàn)最大增加（見圖2）。此外，結(jié)果顯示在0.75 mmol·L-1Ile處理組，BRG1表達(dá)同樣顯著提高，灰度掃描分析以上蛋白表達(dá)水平，通過3個(gè)平行試驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)表明Ile上調(diào)乳蛋白、乳脂合成相關(guān)信號(hào)分子導(dǎo)致乳合成增加，同時(shí)Ile正向調(diào)節(jié)BRG1表達(dá)。

2.3 干擾BRG1 對(duì)乳蛋白和乳脂肪合成相關(guān)信號(hào)分子的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染BRG1siRNA 48 h 后，用Western blot篩選最佳干擾片段，結(jié)果見圖3A 和3B。由圖可知，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，BRG1siR?NA-3 組BRG1 表達(dá)量顯著降低，說明BRG1siR?NA-3可用于后續(xù)基因敲低試驗(yàn)。

細(xì)胞用Ile（0.75 mmol·L-1）處理并同時(shí)轉(zhuǎn)染 si-BRG1， Western blot 檢 測(cè) 各 組 S6K1、 p-S6K1、SREBP-1c、BRG1、 β-casein 和 β-actin 蛋白表達(dá)，結(jié)果見圖4。Ile 處理組較空白對(duì)照組β-ca?sein、p-S6K1、SREBP-1c、BRG1蛋白相對(duì)水平表達(dá)顯著增加，BRG1 敲低組p-S6K1、SREBP-1c 表達(dá)量均顯著降低，提示BRG1 敲低完全阻斷Ile 對(duì)S6K1磷酸化和SREBP-1c蛋白表達(dá)有促進(jìn)作用。

2.4 PI3K 對(duì)BMECs 乳合成調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路的影響

Western blot 分 析 顯 示 ， 經(jīng) PI3K 抑 制 劑LY294002（15 μmol·L-1）處理的細(xì)胞AKT 磷酸化幾乎消失（見圖5）。LY294002可抑制Ile刺激S6K1磷酸化、SREBP-1c和BRG1蛋白表達(dá)（見圖5）。表明PI3K 介導(dǎo)Ile 調(diào)節(jié)BRG1 在乳合成調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮作用。

3 討 論

細(xì)胞中BRG1 通常作為中心酶亞單位存在于SWI/SNF 染色質(zhì)重建復(fù)合體，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA復(fù)制、修復(fù)和重組中發(fā)揮作用。支鏈氨基酸促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，與mTOR激活mRNA翻譯啟動(dòng)有關(guān)。本試驗(yàn)以Ile 作為調(diào)節(jié)因子，探究BRG1 介導(dǎo)Ile 在乳腺上皮細(xì)胞中乳合成分子機(jī)理。結(jié)果顯示，Ile 通過S6K1 與SREBP-1c 相關(guān)信號(hào)途徑調(diào)控乳蛋白、乳脂合成。BRG1介導(dǎo)Ile正向調(diào)控S6K1 磷酸化和SREBP-1c 表達(dá)。抑制PI3K 途徑后BRG1 蛋白水平顯著下降，說明在乳合成過程中PI3K 介導(dǎo)Ile 調(diào)節(jié)BRG1 發(fā)揮作用。試驗(yàn)結(jié)果表明BRG1 可介導(dǎo) Ile 通過 S6K1 與 SREBP-1c 信 號(hào)通路調(diào)節(jié)BMECs中乳蛋白、乳脂肪合成。

當(dāng) Ile 濃度低于 0.75 mmol·L-1時(shí)，Ile 劑量依賴性促進(jìn)BMECs 乳蛋白質(zhì)合成、TG 分泌和脂滴形成。另外，Ile 增加p-S6K1 和SREBP-1c 蛋白水平表達(dá)，S6K1 和SREBP-1c 為乳蛋白和脂肪合成相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵成份。補(bǔ)充Ile 可改善泌乳母豬乳蛋白合成[14]。研究表明過量Ile 對(duì)大鼠空腸形態(tài)和抗菌肽表達(dá)具有顯著影響[15]。氨基酸適量范圍內(nèi)可改善細(xì)胞環(huán)境營(yíng)養(yǎng)水平，過量可能造成氨基酸之間拮抗與不平衡，甚至產(chǎn)生毒性。綜合本研究結(jié)果，表明Ile 以劑量依賴方式調(diào)節(jié)BMECs 中乳蛋白和乳脂肪合成及S6K1磷酸化和SREBP-1c表達(dá)。

添加Ile 同時(shí)抑制BRG1，Western blot 結(jié)果顯示p-S6K1 與SREBP-1c 蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比降低。BRG1作為染色質(zhì)重建因子可通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用。在乳腺癌細(xì)胞中，BRG1上調(diào)負(fù)責(zé)脂肪酸和脂質(zhì)生物合成酶表達(dá)[16]。推測(cè)BRG1 可介導(dǎo)Ile 促進(jìn)S6K1 與SREBP-1c 表達(dá)。但目前未見BRG1在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)具體研究。為了解Ile 調(diào)節(jié)BRG1 表達(dá)分子機(jī)制，利用LY294002抑制PI3K信號(hào)通路。結(jié)果表明，Ile調(diào)節(jié)S6K1、SREBP-1c 信號(hào)通路以及BRG1 表達(dá)需PI3K激活。在神經(jīng)母瘤細(xì)胞中，BRG1缺失影響與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖相關(guān)的基因，包括PI3K/AKT 通路組成部分[17]。研究表明BRG1 高表達(dá)哮喘小鼠的PI3K/AKT/mTOR 通路受抑制，而支氣管上皮細(xì)胞BRG1敲除則促進(jìn)PI3K/AKT/mTOR 通路表達(dá)[18]，綜合本試驗(yàn)結(jié)果，提示BRG1也影響PI3K信號(hào)途徑。

目前BRG1 通過何種調(diào)節(jié)方式影響S6K1 和SREBP-1c 信號(hào)通路尚不清楚。BRG1 除催化ATPase結(jié)構(gòu)域，N端和C末端均可能作為潛在蛋白質(zhì)相互作用模塊區(qū)域，這些區(qū)域可識(shí)別修飾的組蛋白，將BRG1 染色質(zhì)重建活性聚集于基因組靶上。Trotter 等研究表明，BRG1 通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，特別是通過影響關(guān)鍵組蛋白修飾調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[19]。因此，推測(cè)BRG1 介導(dǎo)Ile 調(diào)節(jié)S6K1 及SREBP-1c相關(guān)信號(hào)通路可能通過組蛋白修飾過程影響S6K1和SREBP-1c的mRNA表達(dá)，影響S6K1與SREBP-1c信號(hào)通路強(qiáng)弱。

4 結(jié) 論

Ile 以劑量依賴方式調(diào)節(jié)BMECs 中乳蛋白和乳脂肪合成，調(diào)節(jié)S6K1 磷酸化、SREBP-1c 表達(dá)及BRG1蛋白水平。BRG1介導(dǎo)Ile調(diào)控S6K1磷酸化和SREBP-1c 表達(dá)，而 Ile 通過 PI3K 調(diào)節(jié) BRG1 蛋白水平。