人參皂苷Rb1對腦缺血再灌注損傷小鼠LncRNAMalat1表達的調控作用

王雷雷　戴勤學

[摘要] 目的 探討人參皂苷Rb1是否可以增加腦缺血再灌注損傷小鼠腦梗死半暗帶區(qū)LncRNA Malat1的表達。方法 將30只C57/B6小鼠按隨機數字表法分成假手術組、模型+生理鹽水對照組、模型+人參皂Rb1組，每組10只。采用大腦中動脈閉塞（MCAO）法建立小鼠腦缺血再灌注損傷模型。人參皂苷Rb1組和模型組大鼠在制模后即刻分別腹腔注射人參皂苷Rb1（40 mg/kg）和等量生理鹽水。再灌注損傷后24 h觀察各組小鼠的神經行為學評分、腦梗死體積、Bcl-2蛋白表達量和LncRNA Malat1含量。 結果 與假手術組相比，模型組小鼠神經行為學評分和腦梗死體積明顯增加（P<0.05），Bcl-2蛋白表達量和LncRNA Malat1表達水平明顯增加（P<0.05）;與模型組相比，人參皂苷Rb1組小鼠神經行為學評分和腦梗死體積明顯減少（P<0.05），Bcl-2蛋白表達量和LncRNA Malat1表達水平進一步增加（P<0.05）。 結論 人參皂苷Rb1可以改善MCAO小鼠的神經行為學評分、減小腦梗死體積和增加Bcl-2蛋白表達量。人參皂苷Rb1具有腦保護作用，其可能的機制與增加小鼠腦梗死半暗帶區(qū)LncRNA Malat1的表達有關。

[關鍵詞] 人參皂苷Rb1;腦缺血再灌注損傷;LncRNA Malat1;MCAO

[中圖分類號] R285.5 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）23-0041-04

Regulation effect of ginsenoside Rb1 on the expression of LncRNA Malat1 in mice with cerebral ischemia-reperfusion injury

WANG Leilei ? DAI Qinxue

The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou ? 325800， China

[Abstract] Objective To investigate whether ginsenoside Rb1 can increase the expression of LncRNA Malat1 in the penumbra of cerebral infarction in mice with cerebral ischemia-reperfusion injury. Methods Thirty C57/B6 mice were divided into sham operation group， model+normal saline control group， model+ginsenoside Rb1 group according to random number table method， with 10 mice in each group. The cerebral ischemia-reperfusion injury model in mice was established by using middle cerebral artery occlusion（MCAO） method. Rats in the ginsenoside Rb1 group and model group were injected intraperitoneally with ginsenoside Rb1（40 mg/kg） and the same amount of normal saline immediately after modeling. The neuroethology score， cerebral infarction volume， Bcl-2 protein expression and LncRNA Malat1 content of mice in each group were observed 24 hours after reperfusion injury. Results Compared with those of the sham operation group， the neurobehavior score and cerebral infarction volume of the model group were significantly increased（P<0.05）， the expression levels of Bcl-2 protein and LncRNA Malat1 were significantly increased（P<0.05）. Compared with those of the model group， the neurobehavioral score and cerebral infarction volume of the ginsenoside Rb1 group were significantly reduced（P<0.05）， and the expression levels of Bcl-2 protein and LncRNA Malat1 were further increased（P<0.05）. Conclusion Ginsenoside Rb1 can improve the neuroethology， reduce the volume of cerebral infarction and increase the expression of Bcl-2 protein in MCAO mice. Ginsenoside Rb1 has a protective effect， and its possible mechanism is related to the increased expression of LncRNA Malat1 in the penumbra of cerebral infarction in mice.

[Key words] Ginsenoside Rb1; Cerebral ischemia-reperfusion injury; LncRNA Malat1; MCAO

中風是全球死亡的主要原因之一，也是長期致殘的主要原因[1]。盡管許多中風治療的臨床試驗已經完成，但迄今為止唯一有效的治療方法是溶栓治療，其僅在狹窄的時間窗內有效。臨床環(huán)境中有效治療的發(fā)展受到多種原因的嚴重限制，包括缺血后腦損傷的快速發(fā)展、信號通路之間復雜的相互作用以及特定靶標的治療窗口[2]。人參皂苷是一類特殊的三萜皂苷，可治療多種炎癥信號通路失調的疾病。人參皂苷Rb1，是從人參提取出的最豐富的生物活性形式[3]，具有腦保護作用[4，5]。長鏈非編碼RNA Malat1是研究最廣泛的LncRNA之一。Malat1 RNA的3'末端形成獨特的三螺旋結構，能夠保護其3'末端免受3'-5'外切核酸酶的影響[6]。研究報道LncRNA Malat1在糖氧剝奪后培養(yǎng)的腦微血管內皮細胞和缺血性卒中后的小鼠中發(fā)揮抗凋亡和抗炎作用[7]。另有研究報道，LncRNA Malat1通過調節(jié)MDM2和p53信號通路影響缺血性卒中，為缺血性卒中患者提供更有效的臨床治療策略[8]?？偟膩碚f，這些結果表明Malat1在缺血性卒中中起著重要的保護作用。然而人參皂苷Rb1對LncRNA的調控效應近年來未有報道。本實驗觀察人參皂苷Rb1對MCAO小鼠腦梗死半暗帶區(qū)LncRNA Malat1的表達，為人參皂苷Rb1的腦保護機制探討新的機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

人參皂苷Rb1（上海同田生物技術有限公司，批號：10073425）;2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC） 溶液（美國Sigma化學試劑公司）;蛋白定量 BCA 試劑盒（Thermo 科技公司）;多波長酶標儀（美國 Bio-TEK 公司）;0.9%氯化鈉溶液;4%水合氯醛;PCR試劑盒（美國賽默飛世爾科技）。

1.2 動物選擇與分組

健康雄性C57/B6小鼠48只，體重（22±3）g，動物編碼：2017010422641。由溫州醫(yī)科大學動物房提供，飼養(yǎng)于標準動物房中并自由覓食。手術前一日禁食但不禁飲。將30只小鼠按隨機區(qū)組的原則分為三組：假手術組、模型+生理鹽水對照組、模型+人參皂苷Rb1組，每組10只。

1.3 小鼠局灶性腦缺血模型

雄性C57/B6小鼠，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK（浙）2015-0009。將小鼠圈養(yǎng)在環(huán)境受控的室內，在12 h光照/黑暗循環(huán)下，隨意自由獲取食物和水。按照大腦中動脈栓塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）法建立小鼠腦缺血再灌注損傷模型[9]，小鼠全身麻醉（10%水合氯醛，0.3 mL/100g，i.p.）后仰臥位固定，取出頸部毛發(fā)后，頸部正中切口，逐步分離右側頸內動脈與頸外動脈，并將頸外動脈結扎并剪斷，然后再拉直頸內動脈與頸外動脈成一條直線。將專用的線栓（線頭直徑為0.32 mm）由頸外動脈斷端處插入，經頸總動脈進入大腦中動脈起始處。栓塞1 h后拔出線栓，形成缺血再灌注損傷模型，切口處結扎縫合。當小鼠蘇醒后進行神經行為學評分（標準見1.5），評分≥1分則視為制模成功。假手術組動物接受與MCAO相同的頸動脈手術暴露。再灌注24 h后取出小鼠的腦梗死半暗帶區(qū)和腦組織用于進一步分析。

1.4 人參皂苷Rb1給藥方法

將人參皂苷Rb1粉末溶解于生理鹽水中配置成2 mg/mL注射液。人參皂苷Rb1組的小鼠在模型建立成功后立刻注射人參皂苷Rb1注射液（40 mg/kg，i.p.）[10]，假手術組的小鼠腹腔注射等量生理鹽水，其他操作同模型組小鼠。

1.5 神經行為學評分

采用單盲法在腦缺血再灌注損傷24 h時對各組小鼠行神經行為學評分[9]。具體評分標準：0分：無功能障礙;1分：造模對側前肢不能伸展;2分：向左側旋轉圈;3分：左側傾倒;4分：沒有自主活動并伴有意識障礙。

1.6 小鼠腦梗死體積測定方法

再灌注24 h時，小鼠麻醉斷頭處理，在冰面上取出腦組織，將腦組織放置在腦模具中進行冠狀切片，置于氯化三苯四唑（TTC）溶液中常溫浸泡20 min，未染色部分（白色）為腦梗死區(qū)域，染色為紅色的部分為正常組織。用照相機拍照后存儲于電腦上，再用Image-Plus 6.0軟件進行分析。腦梗死體積（%）=腦梗死體積/全腦體積×100%。

1.7 定量實時PCR

用Trizol法從小鼠腦梗死半暗帶區(qū)（1 mL/100 mg）提取總RNA。在測量單鏈RNA的濃度后，使用隨機六聚體（Thermo fisher scientific）在以下條件下合成cDNA：25℃下5 min，42℃下60 min和70℃下5 min。使用iTap Universal SYBR Green supermix（Bio-Rad）和以下引物進行實時RT-PCR： Malat1 forward（5'-GGCGGAATTGCTGGTAGTTT-3'）; Malat1 reverse（5'-AGCATAGCAGTACACGCCTT-3'）;GAPDH forward（5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'）;GAPDH reverse（5'-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3'）。使用以下條件進行PCR反應：95℃3 min，39個循環(huán)95℃10 s，55℃30 s。在CFX96實時PCR檢測系統(tǒng)（Bio-Rad）上進行反應，并用CFX Manager軟件（Bio-Rad）分析結果。采用相對定量法（△△Ct法）進行半定量分析，目的基因的相對表達量用2-△△Ct數值表示。

1.8 Western Blot法檢測腦梗死半暗帶區(qū)Bcl-2蛋白表達量

各組大鼠再灌注損傷24 h時處死取出腦梗死半暗帶區(qū)?？偟鞍椎奶崛〔捎眉毎鞍滋崛≡噭┖?，按照說明書的步驟操作。等量樣品經聚偏二氟乙烯膜分離蛋白轉移至NC膜上，轉移后的NC膜經BSA孵育1 h，再封閉后，分別加入Bcl-2抗體單克隆抗體，4℃孵育12 h。室溫下搖床沖洗，再孵育二抗后顯影、成像。β-actin作為內參對照。應用Alphaimager 2200凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的蛋白。蛋白表達水平用目的蛋白條帶光密度值與β-actin條帶光密度值的比值來表示。

1.9 統(tǒng)計學分析

使用GraphPad Prism 7.0軟件分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示。使用單向ANOVA和雙向ANOVA，然后進行方差分析檢驗。神經行為學評分采用中位數（范圍）表示，組間比較采用非參數秩和檢驗 Kruskal-Wallis法，兩兩比較用Nemenyi法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人參皂苷 Rb1可以改善MCAO小鼠神經行為學評分

評估再灌注后24 h時MCAO小鼠神經行為學評分。與假手術組相比，模型組小鼠神經行為學評分明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組相比，人參皂苷Rb1組小鼠神經行為學評分明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 人參皂苷 Rb1減少MCAO小鼠腦梗死體積

評估再灌注后24 h時MCAO小鼠腦梗死體積。與假手術組相比，模型組小鼠腦梗死體積明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組相比，人參皂苷Rb1組小鼠腦梗死體積明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2、封三圖7。

2.3 人參皂苷Rb1增加MCAO小鼠腦梗死半暗帶區(qū)Bcl-2蛋白表達量

評估再灌注后24 h后小鼠腦梗死半暗帶區(qū)Bcl-2蛋白表達量。與假手術組相比，模型組Bcl-2蛋白表達量增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;人參皂苷Rb1組Bcl-2蛋白表達量較模型組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2、圖1。

2.4人參皂苷 Rb1增加MCAO小鼠腦梗死半暗帶區(qū)LncRNA Malat1的表達

評估再灌注后24 h后小鼠腦梗死半暗帶區(qū)LncRNA Malat1的表達。與假手術組相比，模型組LncRNA Malat1表達水平增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;人參皂苷Rb1組LncRNA Malat1表達水平較模型組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

表2 ? 各組小鼠腦梗死體積、Bcl-2蛋白表達量、LncRNA Malat1表達水平比較（x±s）

注：與假手術組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05

3 討論

越來越多的證據表明LncRNAs是生理和病理反應的重要調節(jié)因子[11，12]。最近，表觀基因組學的進展正集中于缺血性卒中LncRNAs的神經保護作用[13]。據研究報道成年大鼠經短暫MCAO后LncRNA FosDT表達增加，且LncRNA FosDT 敲除后可顯著改善缺血后運動障礙，并減少梗死體積[14]。LncRNA Malat1首次報道是與肺腫瘤的轉移相關;Ji P等[15]發(fā)現，Malat1的表達與非小細胞肺癌患者的轉移顯著相關。在一項RNA測序研究中，Malat1首次報道參與了腦微血管缺血損傷后的保護作用;體外模擬缺血性卒中條件的缺氧-葡萄糖剝奪（OGD）后，培養(yǎng)的腦血管內皮細胞（BMECs）中Malat1水平升高;短暫MCAO 1 h和再灌注24 h后，小鼠大腦微血管中的Malat1水平也升高[14]。Malat1敲除顯著增加糖氧剝奪誘導的內皮細胞死亡，且Malat1敲除顯著增加小鼠局灶性缺血后梗死體積，加重神經功能缺損[7]。結果表明LncRNA Malat1在開發(fā)新的卒中治療具有巨大的潛力。

人參皂苷是人參根中主要的生物活性化合物，具有抗氧化、免疫調節(jié)和抗炎活性。大量的研究證實人參皂苷Rb1腦保護作用的存在。人參皂苷Rb1通過激活PI3K/Akt通路抑制自噬有助于保護神經元免受缺血性損傷[16]。血腦屏障可使腦組織少受甚至不受循環(huán)血液中有害物質的損害，從而保持腦組織內環(huán)境的基本穩(wěn)定，對維持中樞神經系統(tǒng)正常生理狀態(tài)具有重要的生物學意義[17]。Chen W等[18]發(fā)現ICR小鼠接受MCAO并在再灌注后3 h通過腹膜內注射接受GS-Rb1，可抑制血腦屏障的破壞，增加緊密連接蛋白（跨膜蛋白、細胞質輔助蛋白）的表達，抑制MMP-9和NOX4衍生的自由基來保護缺血性卒中血腦屏障完整性的喪失，發(fā)揮腦損傷治療作用。本研究顯示人參皂苷Rb1可以改善MCAO小鼠的神經行為學評分、減少腦梗死體積以及增加腦梗死半暗帶區(qū)Bcl-2蛋白表達量，說明人參皂苷Rb1對MCAO小鼠具有腦保護作用，但具體的機制并不完全明確。

本研究顯示，人參皂苷Rb1增加腦缺血再灌注損傷小鼠腦梗死半暗帶區(qū)LncRNA Malat1的表達水平。因此，人參皂苷Rb1對腦缺血再灌注損傷小鼠的腦保護作用可能是通過上調LncRNA Malat1表達來實現的。但本研究也有不足之處，對其下游分子未做進一步研究。Xu Y等[19]報道LncRNA Malat1可通過下調miR-145和上調SOX9來促進結直腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移，并抑制細胞周期和凋亡。徐慧等[20]報道人參皂苷Rb1可以通過減少MCAO大鼠腦組織中miR-145含量，從而上調SOD活性，最終對MCAO大鼠產生腦保護作用。因此，人參皂苷Rb1可能通過上調LncRNA Malat1含量，競爭性結合miR-145發(fā)揮海綿作用，從而增加MCAO小鼠腦組織SOD活性，進而產生腦保護作用。但其結論還有待進一步研究。

綜上所述，人參皂苷Rb1可以改善MCAO小鼠的神經行為學評分、減小腦梗死體積以及增加腦梗死半暗帶區(qū)Bcl-2蛋白表達量。人參皂苷Rb1具有腦保護作用，其可能的機制與增加小鼠腦梗死半暗帶區(qū)LncRNA Malat1的表達有關。

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（收稿日期：2020-03-27）