木藤蓼不同提取部位抑制黃嘌呤氧化酶活性研究

馬倩 趙品成 盧永昌

【摘 要】 目的：建立體外抗痛風(fēng)藥物篩選模型，對木藤蓼不同部位提取物進行抗痛風(fēng)體外活性篩選研究。方法：利用黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶篩選模型，用木藤蓼不同部位的提取物進行抗痛風(fēng)活性篩選，并測定IC50值。結(jié)果：木藤蓼不同部位提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制率大小順序為：95%乙醇>正丁醇>乙酸乙酯>水>石油醚。結(jié)論：為進一步合理開發(fā)和利用木藤蓼資源提供了數(shù)據(jù)支撐。

【關(guān)鍵詞】 木藤蓼;酶促反應(yīng);黃嘌呤氧化酶;別嘌呤醇

【中圖分類號】R285.5 【文獻標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2020）15-0016-05

Abstract：Objective To establish a screening model for antigout drugsand study anti-gout activity screening of extracts from different parts of Fallopia aubertii L.Henry Holub in vitro.Methods The antigout activity of extracts from different parts of Fallopia aubertii L.Henry Holub was screened by the model ofxanthine-xan-thineoxidase， and the IC50 value was determined.ResultsThe inhibition rate of xanthine oxidase in different extract parts of Fallopia aubertii L.Henry Holub was different， and the order of inhibition rate was： 95% ethanol >n-butyl>ethyl acetate>water>petroleum ether. Conclusion It provides data support for further rational development and utilization of Fallopia aubertii L.Henry Holub resources.

Keywords：Fallopia aubertii L.Henry Holub; Enzymatic Reaction; Xanthine Oxidase;Allopurinol

木藤蓼（Fallopia aubertii L.Henry Holub）為蓼科何首烏屬半灌木，常以藤莖入藥。藏藥名“勒哲”，多生長于海拔900～2000m的山坡灌叢，主要分布于我國西藏、青海、山西、河南、甘肅等地區(qū)。味甘、苦、澀，清熱解表，藏醫(yī)常用其治療熱性隆病、痹病、黃水病引起的關(guān)節(jié)腫痛[1]。

[JP2]痛風(fēng)是由于體內(nèi)嘌呤代謝或尿酸排泄異常而引發(fā)的疾病，目前無法徹底治愈。國內(nèi)高尿酸血病癥患者已高達2億人，其中痛風(fēng)病患者已超9000萬，且患者人數(shù)每年仍持續(xù)增長[2-3]。在我國，痛風(fēng)已然成為僅次于糖尿病的第二大代謝類疾病。

研究顯示，黃嘌呤氧化酶（XOD）可以持續(xù)氧化次黃嘌呤和黃嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩幔蛩徇^高是痛風(fēng)發(fā)病的一大誘因，臨床上常通過抑制XOD的活性來降低血液中的尿酸水平，從而達到治療痛風(fēng)的目的。目前臨床常用的XOD抑制劑主要有別嘌呤醇和非布司他[4-5]。但別嘌呤醇有一定的副作用，如肝腎損傷、發(fā)燒等，因此別嘌呤醇在臨床上的應(yīng)用受到了一定的限制;非布司他是一種非嘌呤類XOD抑制劑，相比于別嘌呤醇藥效更強、更長，毒副作用更小，但實驗表明其會加大心血管病的發(fā)病率[6]。

中藥應(yīng)用于痛風(fēng)的治療早有先例。相比化學(xué)藥物而言，中藥的毒副作用更小。中藥材具有多成分協(xié)同作用的特點，文獻曾報道過多種中藥可以通過抑制XOD的活性來治療痛風(fēng)。結(jié)合藏醫(yī)臨床用藥和文獻報道，本實驗研究藏藥材木藤蓼及其不同部位提取物的降尿酸作用及抗痛風(fēng)作用。用95%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚和水分別得到木藤蓼5個部位提取物的浸膏，通過研究其對XOD的抑制活性來研究不同部位提取物的抗痛風(fēng)作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器 低溫冷卻循環(huán)機（DLK-2007，寧波新芝生物科技股份有限公司）;全自動多功能酶標(biāo)儀（POLARstarOmega，中國香港伯齊科技有限公司）;數(shù)控超聲波清洗器[JP2]（KH-300DE型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）;高速手提多功能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）;數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）;智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上?，槴\實驗設(shè)備有限公司）;恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA-N1100，上海愛明儀器有限公司）;電子分析天平（ FA1204T，廈門雄發(fā)儀器儀表有限公司）。

1.2 試劑 黃嘌呤氧化酶（LOT：X05N6Y5557，上海源葉生物科技有限公司），黃嘌呤（LOT：N1903190023，上海源葉生物科技有限公司），別嘌醇（LOT：L18A6Y3，上海源葉生物科技有限公司），石油醚，乙醇，乙酸乙酯，正丁醇均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材 木藤蓼樣品[7-8]于 2018年10月采自青海省西寧市，由中國科學(xué)院西北高原生物研究所盧學(xué)峰研究員鑒定為木藤蓼正品，原植物圖如圖1所示。

2 實驗方法

2.1 溶液的配置 磷酸緩沖溶液：精密稱取14.1mg乙二胺四乙酸、3.47g磷酸氫二鉀，0.48g磷酸二氫鉀。加入200mL超純水超聲促溶20min至溶液呈澄清透明，測定該溶液pH=7.4，將其轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶，定容至刻度線備用。

[JP+2]黃嘌呤溶液：精密稱取黃嘌呤3.83mg，放入25mL的容量瓶中。加入300μL 1mol/L的氫氧化鈉溶液超聲至完全溶解，使用磷酸緩沖液定容至刻度線，繼續(xù)超聲20min，得黃嘌呤溶液儲備液。[JP]黃嘌呤氧化酶（XOD）溶液：取1mL90U·mL-1黃嘌呤氧化酶溶液備用。臨用前需用磷酸緩沖液稀釋至濃度為0.08U·mL-1。

別嘌呤醇儲備液：準(zhǔn)確稱取別嘌呤醇68.055mg，加入5mL二甲基亞砜溶液，即可得到的別嘌醇儲備液[9]。

氫氧化鈉溶液：稱取氫氧化鈉2g，加入適量超純水溶解，轉(zhuǎn)移至50mL 容量瓶，定容至刻度線備用。

2.2 木藤蓼提取物不同部位樣品的制備 木藤蓼乙醇提取物的制備：稱量25g木藤蓼藥材粉末，加入95%乙醇400mL，回流提取3次，每次提取60min。合并3次醇提液，轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋干至無醇味，收集浸膏并稱重。

木藤蓼石油醚提取物的制備：將上述得到的浸膏用熱水溶解，加入適量石油醚進行萃取，多次萃取直至石油醚萃取液變?yōu)闊o色，合并萃取液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸，旋干至無石油醚味，收集浸膏并稱重。

木藤蓼乙酸乙酯提取物的制備：在上述石油醚萃取后的水溶液中加入適量乙酸乙酯進行萃取，多次萃取直至乙酸乙酯萃取液變?yōu)闊o色，合并乙酸乙酯萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸，旋至無乙酸乙酯味，收集浸膏并稱重。

木藤蓼正丁醇提取物的制備：在上述乙酸乙酯萃取后的水溶液中加入適量正丁醇進行萃取，多次萃取直至正丁醇萃取液變?yōu)闊o色，合并正丁醇提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸，旋至無正丁醇味，收集浸膏并稱重。

木藤蓼水提取物的制備：將上述正丁醇萃取后的水溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，收集浸膏并稱重[10]。

2.3 XOD抑制活性篩選體系的優(yōu)化 在96孔板中依次加入100μL磷酸鹽緩沖液和50μL 0.08U·mL-1的黃嘌呤氧化酶溶液，37℃條件下孵育3min，再加入50μL不同濃度的黃嘌呤溶液[JP3]（濃度依次為500μmol/L、400μmol/L、300μmol/L、200μmol/L、100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L）[JP]啟動反應(yīng)，每個濃度平行設(shè)置三個孔，設(shè)置波長為295nm，在此波長處每隔 19s 讀數(shù)一次，記錄吸光度，直到各濃度達到平臺期，篩選出最佳濃度條件。

2.4 木藤蓼提取物XOD抑制活性篩選取 [JP3]100μL樣品試液，放入96孔板中，加入50μL 0.08U·mL-1[JP][JP+2]黃嘌呤氧化酶，37℃條件下孵育3min，再加入50μL濃度為100μmol/L的黃嘌呤溶液啟動反應(yīng)，于295nm處每隔19s讀數(shù)一次，記錄吸光度值A(chǔ)。每組樣品平行設(shè)置 3個復(fù)孔，取平均值。再測定樣品試液自身的吸光度和無樣品試液時酶與底物反應(yīng)后的吸光度，按照下列公式[11]計算抑制率。

抑制率=1-A樣-A樣空白A陰性×100%

式中：A樣空白：體系中提取物樣品溶液的吸光度值，A陰性：體系中無樣品溶液時酶與底物反應(yīng)后的吸光度值，A樣：樣品溶液酶促反應(yīng)后的吸光度值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 通過篩選后的結(jié)果，對木藤蓼提取物不同部位的體系濃度進行考察，使用Graphpad Prism5軟件來計算IC50。

3 實驗結(jié)果

3.1 黃嘌呤氧化酶抑制活性篩選體系優(yōu)化 酶的底物濃度會對酶抑制劑的活性造成影響，所以必須對底物濃度進行考察，篩選出最佳濃度條件。如圖2所示，當(dāng)酶濃度保持不變時，加入不同濃度的黃嘌呤溶液，反應(yīng)值與黃嘌呤溶液的濃度成正比，但是當(dāng)所有酶與底物完全反應(yīng)后，即使底物濃度繼續(xù)增加，其中間產(chǎn)物濃度依然保持不變。酶反應(yīng)速率達到平臺期。與酶動力學(xué)相符合。當(dāng)?shù)孜锏淖罱K濃度是100μmol/L時，OD值的信號檢測窗為0.6～1.2，并且在5min時達到平臺期，此時系統(tǒng)誤差最低，并能夠確保有充足的操作時間，因而選擇在此條件下做下一步的研究。并且得到線性回歸方程：y=0.005x+0.6155（R=0.9995）如圖3所示。

3.2 木藤蓼XOD抑制活性篩選 木藤蓼95%乙醇提取物、正丁醇提取物、石油醚提取物、水提取物以及乙酸乙酯提取物對XOD的抑制活性見表1。濃度為0.5mg·mL-1的木藤蓼提取液中，95%乙醇提取液以及正丁醇提取液表現(xiàn)出了較強的XOD抑制活性，乙酸乙酯提取液、水提取液抑制作用次之，石油醚提取液對黃嘌呤氧化酶抑制活性最弱。

3.3 木藤蓼不同部位提取物的活性量效關(guān)系 根據(jù)篩選出來的結(jié)果，將木藤蓼各個部位提取物進行活性篩選，篩選結(jié)果見表2。不同部位提取物中，正丁醇部位提取物活性最強[12]。

4 討論

本次的實驗采用體外抑制XOD活性篩選法，對木藤蓼不同部位提取物進行了活性篩選。由于本次實驗是一個酶促實驗，需要先進行XOD抑制活性篩選體系進行優(yōu)化，選擇合適的底物濃度。酶與底物濃度是否合適，會直接影響到篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。在此實驗中，樣品加入后可與酶及底物發(fā)生酶促反應(yīng)，而每次讀數(shù)均會有微小差異，因此需要設(shè)置空白，扣除空白以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。實驗證實當(dāng)黃嘌呤濃度達到100μmol/L，反應(yīng)時間為5min時，OD數(shù)值將處于0.6～1.2之間，系統(tǒng)誤差最低。

通過篩選后發(fā)現(xiàn)，濃度為0.5mg/mL的木藤蓼95%乙醇部位提取物對XOD有明顯的抑制作用，正丁醇部位提取物及水和乙酸乙酯部位的提取物抑制作用次之，石油醚提取物抑制作用最低。IC50越低，表明其對黃嘌呤氧化酶的抑制率越高，活性越強。通過對IC50的數(shù)據(jù)進行分析，正丁醇部位提取物相對于其他部位提取物顯示出了更強的XOD抑制作用。

據(jù)國內(nèi)外藥理活性研究報道，蘆丁、金絲桃苷具有抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[13-16]的藥理作用，多數(shù)黃酮類具有抑制黃嘌呤氧化酶的作用[17]，文獻顯示木藤蓼中具有此類化合物[18]，也有文獻顯示，木藤蓼的醇提物對于疼痛反應(yīng)有明顯的抑制作用，可以提高小鼠疼痛反應(yīng)的閾值，并且可以將緩解由于二甲苯導(dǎo)致的小鼠耳廓腫脹[19]，而乙醇和正丁醇部位提取出的物質(zhì)多為黃酮類，木藤蓼對黃嘌呤氧化酶的抑制作用可能與此有關(guān)，但需進行更深層次的研究，其對黃嘌呤氧化酶發(fā)揮抑制作用的具體機制也需進一步深入探究。從實驗室資金消耗以及木藤蓼資源消耗方面考慮，95%乙醇部位的提取物和正丁醇部位的提取物對XOD的抑制作用相差不大，IC50數(shù)值也較接近，若需大量應(yīng)用時可以同時利用兩個部位的提取物，一些情況下也可以選擇優(yōu)先使用水提物，避免資源的浪費。

5 結(jié)論

本次實驗以紫外分光光度法為基礎(chǔ)，測定時間短，數(shù)據(jù)處理方法簡便，證明了木藤蓼不同部位提取物均對黃嘌呤氧化酶有抑制作用，可以同時測定多種藥材不同部位提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用，不僅為進一步開發(fā)和合理利用木藤蓼提供依據(jù)，也為其他研究提供新的思路。

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（收稿日期：2020-03-30 編輯：劉斌）