褐飛虱絲氨酸蛋白酶抑制劑基因Nlserpin4的克隆及表達模式分析

王正亮,朱杭鋒,潘海波,俞曉平

(中國計量大學生命科學學院,浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室,杭州 310018)

絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor,serpin) 是廣泛存在于昆蟲體內(nèi)一類結(jié)構(gòu)保守、功能多樣的蛋白酶抑制劑超家族，參與調(diào)控蟲體生長發(fā)育、激素分泌和免疫應答等諸多重要生理過程(趙麗芳等,2016;Meekinsetal.,2017)。Serpin分子量大小一般在40～50 kD，蛋白質(zhì)序列N末端存在serpin的特有結(jié)構(gòu)域，C末端存在由大約20個氨基酸殘基組成的反應中心環(huán)(reactive center loop,RCL)。Serpin的靶蛋白酶識別切割RCL的活性裂解位點并與之共價結(jié)合，以不可逆的自殺性機制失活，從而阻斷蛋白酶水解級聯(lián)過程，抑制免疫應答反應(Huntington,2011)。鑒于其重要的免疫調(diào)控功能，昆蟲serpin一直備受國內(nèi)外研究者關(guān)注(Ooietal.,2015;魏川川等,2017;朱笑婷等,2017;Shakeeletal.,2019)。

在昆蟲中，serpin最初從家蠶Bombyxmori血淋巴中分離獲得，之后又在煙草天蛾Manducasexta體內(nèi)被檢測到，主要通過抑制絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應，進而負調(diào)控Toll信號通路和酚氧化酶原激活通路，以防止過量的抗菌肽表達和過度的黑化反應對昆蟲自身造成的傷害(Zhaoetal.,2012;Li Betal.,2017;Li Metal.,2018)。目前相關(guān)研究主要集中在一些隸屬雙翅目和鱗翅目的模式昆蟲中。如黑腹果蠅Drosophilamelanogaster全基因組含有29個serpin基因，功能研究顯示其中Spn43Ac通過參與Toll信號通路而調(diào)節(jié)宿主的先天性免疫反應，Spn27A能有效抑制酚氧化酶原級聯(lián)反應而調(diào)控宿主應對外來入侵物的防御響應(Levashinaetal.,1999;Ligoxygakisetal.,2002)。在煙草天蛾中，serpin1J和serpin5分別通過抑制宿主血淋巴蛋白酶HP8和HP6而對Toll信號通路進行負調(diào)控，與果蠅Spn27A同源的serpin3則可通過抑制酚氧化酶原的激活而阻斷黑化反應的進程(Zhuetal.,2003;Anetal.,2011)。然而，針對其他科目的昆蟲，特別是一些重要農(nóng)業(yè)害蟲中serpin的免疫調(diào)控功能研究較少，相關(guān)研究有待加強。

褐飛虱Nilaparvatalugens隸屬半翅目(Hemiptera)飛虱科(Delphacidae)，是我國水稻上的主要害蟲，不僅直接吸食水稻汁液，造成枯干倒伏(即“虱燒”)，而且還能傳播水稻病毒病，對水稻生產(chǎn)造成毀滅性損失(呂進等,2013)。微生物防治是當前褐飛虱綜合防控中的優(yōu)選策略(陳列忠等,2006;Jinetal.,2011)。然而，其防效在很大程度上受到宿主昆蟲自身免疫防御系統(tǒng)的制約，極大限制了相關(guān)微生物農(nóng)藥的開發(fā)及規(guī)模化應用(Lu and St Leger,2016;Qu and Wang,2018)。因此，研究褐飛虱的免疫調(diào)控機制對于開發(fā)褐飛虱生物防治技術(shù)工作具有重要理論和現(xiàn)實意義。本研究以褐飛虱為研究對象，對其免疫調(diào)控因子Nlserpin4基因進行克隆鑒定和生物學信息分析，并利用qRT-PCR分析該基因的時空表達譜以及病原真菌誘導表達模式，以期為深入研究褐飛虱serpin的生物學功能奠定基礎，也為利用serpin基因進行褐飛虱蟲害治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲和病原真菌

供試褐飛虱種群為本實驗室保存建立，于人工氣候室內(nèi)(溫度24±1℃、相對濕度70%±5%、光周期16L∶8D)以TN1水稻苗飼養(yǎng)，維持種群。金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae菌株Ma456于PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)斜面上4℃保存，25℃培養(yǎng)傳代。

1.2 褐飛虱RNA提取及cDNA合成

取羽化24 h內(nèi)的褐飛虱成蟲30頭，首先使用75%的酒精表面消毒蟲體3次，每次3 min，再用無菌蒸餾水清洗5遍。蟲體后晾干置于研缽中用液氮研磨均勻。采用Trizol法提取褐飛虱總RNA，并用微量紫外分光光度計(NanoDrop ND-2000,美國)和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量和濃度。以檢測合格后的RNA為模板，使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa，日本)試劑盒參照說明書合成cDNA，并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Nlserpin4基因克隆及測序

根據(jù)本實驗室測得的褐飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)合GenBank中褐飛虱全基因組信息，篩選獲得一條注釋為褐飛虱絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin的cDNA序列，命名為Nlserpin4。使用Primer Premier 5設計Nlserpin4擴增引物cS4F(5′-ATGGTGGTCTTCAAA CAAATGGTTC-3′)和cS4R(5′-TCAATTTCCAGTATA TTTTCCACTG-3′)，以1.2節(jié)所得褐飛虱cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR擴增體系:cDNA模板 2 μL,dNTPs (10 mmol/L) 4 μL,正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，10×Buffer(含Mg2+) 5 μL,Taq酶0.5 μL,ddH2O補充至50 μL。擴增程序:94℃預變性5 min;94℃變性30 s,55℃復性30 s,72℃延伸1.5 min,35個循環(huán);72℃延伸7 min。PCR反應完成后，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產(chǎn)物數(shù)量及分子量大小。目標擴增產(chǎn)物經(jīng)割膠回收后與pMD18-T載體(TaKaRa,日本)連接，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞中。將菌液(100 μL)涂布于含氨芐的(100 μg/mL)并涂有IPTG及X-gal的LB瓊脂板上，37℃倒置培養(yǎng)24 h后進行藍白斑篩選，陽性轉(zhuǎn)化子送上海桑尼測序有限公司測序。

1.4 Nlserpin4基因及編碼蛋白質(zhì)序列分析

利用ORF Finder(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)預測Nlserpin4基因的開放閱讀框，并翻譯獲得氨基酸序列；運用BLASTP(http:∥ blast..ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)比對NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進一步確認目標基因，并獲得同源序列；用SMART Server(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)分析編碼蛋白序列中的保守結(jié)構(gòu)域；用NetNGlyc1.0 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)進行糖基化位點預測；用ProtParam(http:∥web.expasy.org/protparam/)對編碼蛋白質(zhì)的分子量和等電點進行分析；用SignalP-5.0 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信號肽序列；通用MEGA X軟件以鄰接(neighbor-joining,NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，經(jīng)1 000次重復抽樣檢測其置信度(Kumaretal.,2018)。

1.5 Nlserpin4基因時空表達特征分析

收集褐飛虱不同發(fā)育時期(卵、1-5齡若蟲以及羽化24 h的雌雄成蟲)樣品，其中卵300粒，1-2齡若蟲分別50頭，3-4齡若蟲分別40頭，5齡若蟲30頭，初羽化雌雄成蟲分別為20頭。褐飛虱不同組織(血淋巴、脂肪體、腸道和剩余蟲體)樣品取自5齡若蟲。隨機選取100頭褐飛虱5齡若蟲，首先用75%的酒精表面消毒蟲體3次，每次3 min，再用無菌蒸餾水清洗5遍，晾干蟲體。用解剖鑷在體視顯微鏡下解剖收集脂肪體、腸道和剩余蟲體。通過切胸足法收集血淋巴，收集的血淋巴置于冰浴的放有少量苯硫脲晶體的離心管中，并加入等體積的PBS(pH 7.4)，4℃下13 000 r/min離心10 min，棄上清(張藝馨,2014)。各樣品RNA提取和cDNA合成步驟同1.2節(jié)。根據(jù)Nlserpin4基因cDNA序列，設計一對定量PCR引物qS4F(5′-CGTAGAACAA CCACAACTG-3′)和qS4R(5′-ATCTCTTGTCCTGCG TTAT-3′)。qRT-PCR分析采用SYBR? Premix Ex TaqTMII試劑盒，反應體系(20 μL):2×SYBR? Premix Ex TaqTMII 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,適量稀釋的cDNA 2 μL和ddH2O 6 μL。擴增程序:95℃預變性30 s,進入40個擴增循環(huán)(95℃變性5 s,60℃退火34 s)；融解曲線：95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s。以褐飛虱RPS11基因作為內(nèi)參，正向引物RPS11-F:5′-ATGGCCGACATTCT TCCAGGTCC-3′；反向引物RPS11-R:5′-CCGATCGT GTGGCGTTGAAGGG-3′。其反應體系和程序同上。每個組織或齡期樣品設置3次生物學重復和3次技術(shù)重復。Nlserpin4基因在褐飛虱不同發(fā)育時期和不同組織中的相對表達量用2-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen,2001)計算,其中以不同發(fā)育時期和組織中的最低表達量為基數(shù)，數(shù)值設為1。

1.6 Nlserpin4基因的金龜子綠僵菌誘導表達模式分析

將病原真菌金龜子綠僵菌分生孢子以0.02% Tween-80水溶液制成1×107孢子/mL濃度的懸液，用顯微注射法接種5齡褐飛虱若蟲，接種體積為10 nL，接種3批次，每批次注射100頭，以注射相同體積的0.02% Tween-80水溶液為對照。分別于0 h(未接種),接種后6,12,24和48 h后收集蟲體，用75%的酒精表面消毒蟲體3次，每次3 min，再用無菌蒸餾水清洗5遍，晾干蟲體備用。樣品RNA提取和cDNA合成步驟同1.2節(jié)。qRT-PCR程序和基因相對表達量計算方法(2-ΔΔCt)同1.5節(jié)，以未注射組的表達量為基數(shù)，其值設為1。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用繪圖軟件 Graphpad Prism 7.0作圖。利用DPS軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析與處理，計算平均值和標準誤(Tang and Zhang,2013)。利用單因素方差分析(one-way ANOVA)及Tukey氏HSD (Tukey’s honestly significant difference)法對Nlserpin4基因在褐飛虱不同發(fā)育時期、不同組織以及病原真菌不同誘導時間下的表達量進行比較分析，差異顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 Nlserpin4基因的克隆鑒定及序列特征

以褐飛虱cDNA 為模板擴增得到的產(chǎn)物經(jīng)過測序和序列分析，結(jié)果顯示：褐飛虱Nlserpin4基因cDNA序列(GenBank登錄號:MN822802)全長1 227 bp，編碼408個氨基酸，分子量大小為45.91 kD，等電點6.23。SMART預測顯示Nlserpin4氨基酸序列在第39-408位氨基酸殘基之間含有一個serpin家族特有的保守性結(jié)構(gòu)域。NetNGlyc1.0預測表明Nlserpin4蛋白無糖基化位點。信號肽預測結(jié)果顯示Nlserpin4包含一個長度為23個氨基酸信號肽序列(圖1)。多序列比對顯示，與其他昆蟲serpin相似，Nlserpin4在C末端具有RCL區(qū)，其中第367位苯丙氨酸(Phe)和第368位丙氨酸(Ala)之間為預測的被靶蛋白酶特異性識別的活性裂解位點(圖2)。

圖1 褐飛虱Nlserpin4基因cDNA序列及其編碼氨基酸序列Fig.1 cDNA sequence and the coded amino acid sequence of Nlserpin4 of Nilaparvata lugens下劃線部分為信號肽序列;RCL區(qū)以陰影顯示，其中活性裂解位點以黑框表示;星號為終止密碼子。Signal peptide sequence is underlined.The RCL region is shaded and the active cleavage site is marked with box.Asterisk indicates the termination codon.

圖2 褐飛虱Nlserpin4與其他昆蟲同源蛋白質(zhì)序列RCL區(qū)多序列比對Fig.2 Multiple sequence alignment of the RCL region of Nlserpin4 from Nilaparvata lugens with those of homologous serpins from other insect speciesSeripn蛋白來源物種Origin species of serpins:Apserpin4:豌豆蚜Acyrthosiphon pisum;Sfserpin4:蔗黃偽毛蚜Sipha flava;Nlserpin4:褐飛虱Nilaparvata lugens;Clserpin4:溫帶臭蟲Cimex lectularius;Lhserpin4:阿根廷蟻Linepithema humile;Oaserpin4:寄生樹黃蜂Orussus abietinus;Btserpin4:煙粉虱Bemisia tabaci;Bmserpin4:家蠶Bombyx mori.RCL區(qū)預測活性裂解位點以陰影顯示;星號和冒號分別代表完全保守的和大部分相似的的氨基酸。The predicted active cleavage site in the RCL region is shaded.Asterisk and colon indicate completely conserved and partially similar amino acids,respectively.

2.2 Nlserpin4蛋白的序列比對及進化樹

利用Blast同源性搜索比對，發(fā)現(xiàn)Nlserpin4蛋白與褐飛虱全基因組中預測的serpin-4 (GenBank登錄號:AGK40928)氨基酸序列完全一致。Nlserpin4氨基酸序列與蔗黃偽毛蚜Siphaflavaserpin4(GenBank登錄號:XP_025406327)的一致性最高，為40.26%。其次為與溫帶臭蟲Cimexlectulariusserpin4(GenBank登錄號:XP_014251604)，兩者氨基酸序列一致性為39.95%。采用MEGA6.0軟件以鄰接法將Nlserpin4與其他17種昆蟲的serpin構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示：包括褐飛虱Nlserpin4在內(nèi)所有半翅目昆蟲serpin聚為一支，并與膜翅目昆蟲serpin互為姐妹群，與鱗翅目昆蟲家蠶Bombyxmoriserpin4親緣關(guān)系較遠(圖3)。

圖3 基于氨基酸序列采用鄰接法構(gòu)建的褐飛虱和其他昆蟲serpin蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復)Fig.3 Phylogenetic tree of serpin proteins from Nilaparvata lugens and other insects based on amino acid sequences by neighbor-joining method (1 000 replicates)

2.3 Nlserpin4基因時空表達特征

褐飛虱Nlserpin4基因在宿主不同發(fā)育時期和若蟲不同組織部位中的表達量如圖4所示。結(jié)果表明，Nlserpin4基因在褐飛虱的卵期、若蟲期和雌雄成蟲中均有表達，且在成蟲期表達量顯著高于卵期和若蟲期(P<0.05)。雄成蟲中Nlserpin4表達量最高，分別是雌成蟲、卵和若蟲期表達量(1-5齡若蟲期表達量的平均值)的1.5,5.0和6.8倍。Nlserpin4表達量在1-3齡若蟲中無顯著性差異(P>0.05)，此后隨齡期增加而顯著上升，如4齡和5齡若蟲中Nlserpin4表達量較低齡若蟲期表達量(1-3齡若蟲期表達量的平均值)分別增加了2.1和3.2倍(圖4:A)。Nlserpin4基因在5齡若蟲脂肪體、血淋巴、腸道和剩余蟲體中均有表達，且在剩余蟲體組織中表達量最高。此外，在血淋巴中Nlserpin4表達量顯著高于腸道和脂肪體(P<0.05),分別是腸道和脂肪體中表達量的2.5和2.9倍(圖4:B)，但Nlserpin4表達量在5齡若蟲腸道和脂肪體中差異不顯著(P>0.05)。

圖4 Nlserpin4在褐飛虱不同發(fā)育時期(A)和5齡若蟲不同組織(B)中的表達模式Fig.4 Expression profiles of Nlserpin4 during different developmental stages (A) and different tissues of the 5th instar nymphs (B) of Nilaparvata lugensE:卵Egg;N1- N5:分別為 1-5齡若蟲1st-5th instar nymph,respectively;FA:雌成蟲Female adult;MA:雄成蟲Male adult;F:脂肪體Fat body;G:腸道Gut;H:血淋巴Hemolymph;C:剩余蟲體Carcass.圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，柱上不同字母表示不同發(fā)育階段或不同組織間基因表達量差異顯著(P<0.05,one-way ANOVA檢驗)。Data in the figure are mean±SE,and different letters above bars indicate significant difference in the gene expression level among different developmental stages or tissues (P<0.05,one-way ANOVA test).

2.4 金龜子綠僵菌侵染后Nlserpin4的表達模式

用金龜子綠僵菌分生孢子懸液(1×107孢子/mL)顯微注射接種褐飛虱5齡若蟲，檢測誘導不同時間后褐飛虱Nlserpin4的表達量，結(jié)果如圖5所示。與對照組(注射0.02% Tween-80水溶液)相比，病原真菌誘導(處理組)48 h內(nèi)各時間點Nlserpin4表達量均呈顯著下調(diào)(P<0.05)；在金龜子綠僵菌刺激6 h后，Nlserpin4表達量最低，僅為對照的50%水平(P<0.05)；隨著誘導時間的增加，Nlserpin4表達量呈回升趨勢，如誘導24 h和48 h后其表達量顯著上升，分別是誘導6 h時的1.4和1.6倍，但與對照組相比依然是下調(diào)，且差異達到顯著水平(P<0.05)(圖5)。

圖5 金龜子綠僵菌(1×107孢子/mL孢子懸液)侵染褐飛虱5齡若蟲后Nlserpin4的誘導表達模式Fig.5 Expression pattern of Nlserpin4 in the 5th instar nymphs of Nilaparvata lugens after infection with Metarhizium anisopliae (1×107 conidia/mL spore suspension)CK:對照組(注射0.02% Tween-80) Control group (injected with 0.02% Tween-80);Treatment:處理組Treatment group.圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，柱上不同字母表示不同時間點間基因表達量差異顯著(P<0.05,one-way ANOVA檢驗)。Data in the figure are mean±SE and different letters above bars indicate significant difference in the gene expression level among different time post injection (P<0.05,one-way ANOVA test).

3 討論

Serpin是一類廣泛分布于動物、植物和微生物中的蛋白酶活性調(diào)節(jié)劑，參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)一系列重要的生理和病理過程(Lucasetal.,2018;Cohenetal.,2019)。近年來，serpin家族成員及其生物學功能已經(jīng)在許多昆蟲中被分離和鑒定，但相關(guān)研究主要集中于一些模式昆蟲，如果蠅、蚊和家蠶(Gulleyetal.,2013;Gaoetal.,2018;Katsukawaetal.,2018)，而對于飛虱科重要農(nóng)業(yè)害蟲的相關(guān)研究則相對貧乏。本研究成功從水稻重要害蟲褐飛虱中克隆了Nlserpin4基因的全長cDNA序列，利用生物信息學手段分析了其序列特征，并通過qRT-PCR技術(shù)檢測了其時空表達譜和病原真菌誘導表達模式。

氨基酸序列分析顯示，Nlserpin4與已鑒定的其他物種serpin一樣，具有保守的serpin結(jié)構(gòu)域(第39-408位氨基酸殘基)(圖1)，表明Nlserpin4屬于serpin 超家族成員。目前研究發(fā)現(xiàn)，很多昆蟲serpin在N端具有信號肽序列，如在25個小菜蛾P(guān)lutellaxylostellaserpin中，11個具有信號肽序列(Linetal.,2017)。SignalP預測顯示Nlserpin4在蛋白質(zhì)N端(第1-23位氨基酸殘基)亦存在信號肽，表明其可能是分泌型蛋白。此外，與柞蠶Antheraeapernyiserpin6和亞洲玉米螟Ostriniafurnacalisserpin2具有糖基化位點(曾軍等,2017;趙雅,2018)不同，NetNGlyc1.0預測Nlserpin4氨基酸序列中不存在糖基化位點，表明其可能是非糖基化蛋白。多序列比對顯示，Nlserpin4具有serpin蛋白家族典型的RCL區(qū)，且含有能被靶標蛋白酶識別的活性裂解位點(圖2)。RCL區(qū)作為捕獲靶蛋白酶的“誘餌”，決定了serpin 抑制活性的專一性(Huntington,2011)。一般認為，serpin通過其RCL區(qū)與靶蛋白酶以酯鍵共價結(jié)合后被靶蛋白酶裂解，進而引起自身構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變。Serpin構(gòu)象改變繼而導致靶標蛋白酶的構(gòu)象變化，從而發(fā)揮蛋白酶活性抑制功能(Gettins,2002)。由系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果可知，Nlserpin4與同屬半翅目昆蟲的serpin4聚為一支，其中與蔗黃偽毛蚜和溫帶臭蟲serpin4的親源關(guān)系最近，而與鱗翅目昆蟲家蠶serpin4親緣關(guān)系較遠(圖3)，該結(jié)果與Blastp比對結(jié)果一致，表明serpin4在半翅目昆蟲中具有相對保守的進化特性，其聚類關(guān)系在一定程度上反映其親緣關(guān)系。

Nlserpin4在褐飛虱各發(fā)育階段均有表達，成蟲期表達量顯著高于其他齡期，1-3齡若蟲期表達量顯著低于卵期和高齡若蟲期(圖4:A)，表明Nlserpin4在褐飛虱具有齡期表達特異性。Serpin的齡期特異性表達模式同樣見于其他昆蟲中，如煙粉虱serpin在卵期和成蟲期表達量最高，其他齡期表達量則較低(馮佳穎,2016)。家蠅Muscadomesticaserpin基因SP2和SP16在2齡和3齡幼蟲中呈普遍的高表達，而在卵期和成蟲期表達量相對較低(魏川川等,2017)。Nlserpin4在褐飛虱各組織部位亦均有轉(zhuǎn)錄，但在不同組織部位的表達水平差異顯著。定量PCR結(jié)果顯示Nlserpin4在褐飛虱5齡若蟲血淋巴中表達量最高，在腸道中次之，在脂肪體中的表達量較低(圖4:B)。類似的表達模式同樣見于其他昆蟲serpin的研究，如家蠶serpin6的表達量在不同組織部位從高到低排列為血淋巴>腸道>脂肪體(Lietal.,2017)。然而，此表達模式與煙草天蛾serpin4基因不同，煙草天蛾serpin4在脂肪體中的表達水平明顯高于其在血淋巴中的表達水平(Tong and Kanost,2005)。可見，褐飛虱Nlserpin4的表達特征具有明顯時空特異性，這表明其在褐飛虱生長發(fā)育過程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。

諸多研究表明，昆蟲serpin主要通過抑制絲氨酸蛋白酶的活性來負調(diào)控酚氧化酶原激活系統(tǒng)和其他有關(guān)防御通路(如Toll通路)的蛋白酶水解級聯(lián)反應，從而抑制病原微生物誘導下過度的免疫防御反應對昆蟲自身造成傷害(Yuanetal.,2017;Wangetal.,2019)。目前關(guān)于serpin在昆蟲-病原微生物互作過程中的表達調(diào)控研究主要以“昆蟲-病原細菌”為研究模型。如煙草天蛾受大腸桿菌Escherichiacoli刺激后，幼蟲血淋巴中serpin4的表達量顯著上升，其表達產(chǎn)物可抑制絲氨酸蛋白酶的級聯(lián)反應，從而阻斷黑色素的合成(Tong and Kanost,2005)。昆蟲病原真菌以其體壁接觸侵染致死模式在防治刺吸式口器害蟲方面具有獨特的優(yōu)勢(Laceyetal.,2015)。解析刺吸式口器害蟲與病原真菌之間免疫防御與免疫逃避的“攻防”關(guān)系對于開發(fā)基于病原真菌的褐飛虱生物防治新技術(shù)具有重要的理論和現(xiàn)實意義。本研究檢測了Nlserpin4在褐飛虱注射接種病原真菌后的誘導表達模式(圖5)，結(jié)果顯示金龜子綠僵菌處理褐飛虱初期(6 h)Nlserpin4基因表達量顯著下調(diào)，表明褐飛虱免疫防御反應可能被注射進入宿主血淋巴的病原真菌顯著激活；隨接種時間的延長Nlserpin4基因表達量呈現(xiàn)回升趨勢，這可能是為了緩解由病原真菌誘導的免疫防御反應的持續(xù)激活。由此可見，Nlserpin4在褐飛虱免疫防御病原真菌過程中扮演重要調(diào)控分子的角色，但其是如何調(diào)控宿主信號轉(zhuǎn)導途徑以及免疫應答反應的，暫不清楚，還有待于進一步研究。