高效液相色譜梯度洗脫法同時測定靈龍感冒膠囊中9種成分含量

譚東明，魏杰，尹紅英

(1.江蘇護理職業(yè)學(xué)院藥學(xué)與中藥學(xué)院，淮安 223001；2.江蘇省淮安市淮陰區(qū)新渡鄉(xiāng)衛(wèi)生院，淮安 223300；3.江蘇省淮安市淮陰醫(yī)院，淮安 223300)

靈龍感冒膠囊收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第十二冊》[1]，全方由龍膽、秦艽、防己、羌活、關(guān)木通、威靈仙和甘草7味中藥加工而成，具有解表清熱、祛濕止痛的功效，臨床上主要用于嚴重感冒、惡寒發(fā)熱、頭痛、身痛、四肢酸軟、小便發(fā)黃等病癥的治療。現(xiàn)行質(zhì)量標準未對方中任何成分進行定量檢測，付成國等[2]僅對方中龍膽所含成分龍膽苦苷進行含量測定，中成藥復(fù)方制劑所含成分復(fù)雜，其臨床效果均為多種藥材共同協(xié)同的作用，單一成分的定量研究難以有效地評價中成藥復(fù)方制劑的質(zhì)量。筆者參考中藥質(zhì)量標志物[3-5]優(yōu)選原則，以“君”藥首選原則，兼顧“臣”“佐”“使”代表性物質(zhì)，選取靈龍感冒膠囊方中君藥羌活所含主要活性成分紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素，君藥龍膽、臣藥秦艽所含主要活性成分龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷[6]，佐藥防己[6]所含主要成分粉防己堿、防己諾林堿為定量測定研究對象，運用高效液相色譜(HPLC)梯度洗脫技術(shù)，對靈龍感冒膠囊中9種成分進行同步測定，報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；METTLER TOLEDO電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，感量：0.01 mg)；KQ-250E型超聲波清洗器(上海量壹科學(xué)儀器有限公司)。

1.2試劑與藥品 龍膽苦苷(批號：110770-201716，含量：97.6%)、馬錢苷酸(批號：111865-201704，含量：97.4%)、獐牙菜苦苷(批號：110785-201404，含量：98.3%)、粉防己堿(批號：110711-201810，含量：99.6%)、防己諾林堿(批號：110793-201807，含量：98.3%)、紫花前胡苷(批號：111821-201604，含量：99.6%)、羌活醇(批號：111820-201705，含量：99.9%)、異歐前胡素(批號：110827-201812，含量：99.6%)對照品均來源于中國食品藥品檢定研究院；獐牙菜苷對照品(批號：14215-86-2，含量：98.0%)來源于南京森貝伽生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑為分析純；靈龍感冒膠囊(批號：180216，180504，180811)來源于湖北虎泉藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A：乙腈-甲醇(1：1)，流動相B：0.3%醋酸溶液，梯度洗脫(0～14.5 min，16.0%A；14.5～32.0 min，16.0%→35.0%A；32.0～47.5 min，35.0%→72.0%A；47.5～64.0 min，72.0%→81.0%A；64.0～75.0 min，81.0%→16.0%A)；0～32.0 min在240 nm波長下檢測龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷[7-9]，32.0～47.5 min在280 nm波長下檢測粉防己堿和防己諾林堿[6，10-11]，47.5～75.0 min在315 nm波長下檢測紫花前胡苷、羌活醇和異歐前胡素[12]；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2.2混合對照品溶液的制備 分別精密稱取龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素對照品適量，用甲醇分別制成9種單一對照品母液(龍膽苦苷7.312 mg·mL-1、馬錢苷酸0.598 mg·mL-1、獐牙菜苦苷0.934 mg·mL-1、獐牙菜苷0.316 mg·mL-1、粉防己堿1.988 mg·mL-1、防己諾林堿0.852 mg·mL-1、紫花前胡苷2.116 mg·mL-1、羌活醇0.492 mg·mL-1、異歐前胡素4.174 mg·mL-1)；精密吸取9種單一對照品母液各2.5 mL，用甲醇制成混合對照品溶液(含龍膽苦苷0.3656 mg·mL-1、馬錢苷酸0.0299 mg·mL-1、獐牙菜苦苷0.0467 mg·mL-1、獐牙菜苷0.0158 mg·mL-1、粉防己堿0.0994 mg·mL-1、防己諾林堿0.0426 mg·mL-1、紫花前胡苷0.1058 mg·mL-1、羌活醇0.0246 mg·mL-1、異歐前胡素0.2087 mg·mL-1)。

2.3靈龍感冒膠囊供試品溶液的制備 取靈龍感冒膠囊適量，傾出內(nèi)容物，混勻，取0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，用甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，經(jīng)孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為靈龍感冒膠囊供試品溶液。

2.4陰性對照溶液的制備 按照靈龍感冒膠囊質(zhì)量標準項下的處方和制備方法，分別制備缺羌活陰性樣品、缺龍膽、秦艽陰性樣品、缺防己陰性樣品，再按照“2.3”項下靈龍感冒膠囊供試品溶液的制備方法制備3種陰性樣品溶液。

2.5系統(tǒng)適應(yīng)性實驗 分別精密吸取混合對照品溶液、靈龍感冒膠囊供試品溶液、羌活陰性樣品溶液、龍膽秦艽陰性樣品溶液、防己陰性樣品溶液各適量，依法進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果所測定各成分龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素色譜峰達到了較為理想的分離效果，分離度均>1.5，理論板數(shù)按所測各成分色譜峰計均>3500，陰性樣品對測定無干擾，混合對照品、供試品及陰性樣品色譜圖見圖1。

A.混合對照品；B.靈龍感冒膠囊供試品；C.龍膽秦艽陰性樣品；D.防己陰性樣品；E.羌活陰性樣品；1.龍膽苦苷；2.馬錢苷酸；3.獐牙菜苦苷；4.獐牙菜苷；5.粉防己堿；6.防己諾林堿；7.紫花前胡苷；8.羌活醇；9.異歐前胡素。

2.6含量測定方法學(xué)驗證

2.6.1線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項下制備的9種單一對照品母液各2 mL，置于20 mL量瓶，用甲醇定容至刻度，制成線性關(guān)系混合對照品溶液Ⅰ；精密吸取線性關(guān)系混合對照品溶液Ⅰ各適量，用甲醇依次稀釋2，5，10，15，20倍，制成線性關(guān)系混合對照品溶液Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ和Ⅵ，按“2.1”項色譜條件進樣測定，以進樣濃度(C，μg)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸，得到9種成分線性回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 靈龍感冒膠囊中9種成分線性關(guān)系實驗結(jié)果

2.6.2精密度實驗 取“2.2”項下制備的混合對照品溶液，在上述色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄各成分色譜峰。結(jié)果龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素峰面積的RSD分別為0.51%，0.95%，0.82%，1.01%，0.64%，0.79%，1.68%，0.85%和0.66%。

2.6.3靈龍感冒膠囊供試品溶液穩(wěn)定性實驗 取同一份供試品溶液，在室溫下避光放置，分別在0，5，10，15，20，24 h進行測定，記錄各成分色譜峰。結(jié)果靈龍感冒膠囊供試品溶液室溫避光放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素峰面積的RSD分別為0.52%，0.97%，0.84%，1.07%，0.43%，1.76%，0.69%，0.83%和0.61%。

2.6.4重復(fù)性實驗 取同一批靈龍感冒膠囊，按照“2.3”項下靈龍感冒膠囊供試品溶液的制備方法平行制備供試品溶液6份，再按照“2.1”項色譜條件進行測定，記錄所測各成分的峰面積，計算各成分的含量。結(jié)果樣品中龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素含量的RSD分別為1.56%，1.79%，1.68%，0.88%，1.18%，1.42%，0.21%，1.71%和1.24%。

2.6.5加樣回收率實驗 取已知含量的靈龍感冒膠囊9份，每份0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入另行配制的混合對照品溶液(含龍膽苦苷5.308 mg·mL-1、馬錢苷酸0.422 mg·mL-1、獐牙菜苦苷0.664 mg·mL-1、獐牙菜苷0.196 mg·mL-1、粉防己堿1.282 mg·mL-1、防己諾林堿0.538 mg·mL-1、紫花前胡苷1.366 mg·mL-1、羌活醇0.342 mg·mL-1、異歐前胡素2.728 mg·mL-1)0.5 mL3份、1.0 mL3份、1.5 mL3份，按照“2.3”項下靈龍感冒膠囊供試品溶液的制備方法制備加樣回收樣品溶液。在“2.1”項的色譜條件下進樣檢測，記錄所測成分的峰面積，計算回收率、平均回收率和RSD值，結(jié)果見表2。

2.7樣品測定 取靈龍感冒膠囊3批，分別按“2.3”項下靈龍感冒膠囊供試品溶液制備方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下依法進樣檢測，記錄龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇和異歐前胡素的峰面積，以外標法計算所測9種成分的含量，檢測結(jié)果見表3。

3 討論

3.1待測定成分的選擇 靈龍感冒膠囊由龍膽、秦艽、防己、羌活、關(guān)木通、威靈仙和甘草7味中藥加工而成，方中龍膽清熱燥濕，羌活解表散寒、除濕止痛，共為君藥；秦艽清濕熱、止痹痛、退虛熱，威靈仙祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)，合為臣藥；防己祛風(fēng)止痛、利水消腫，關(guān)木通清心火、利小便，合為佐藥，甘草調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥共奏，共達解表清熱、祛濕止痛的功效。方中羌活為傘形科植物羌活或?qū)捜~羌活的干燥根莖和根，主要含有香豆素類、有機酸類及揮發(fā)油類化合物，其中紫花前胡苷有鎮(zhèn)痛、抗炎、改善學(xué)習(xí)記憶等作用，羌活醇和異歐前胡素具有鎮(zhèn)痛、舒張血管、抗病毒活性作用[12]；龍膽為龍膽科植物條葉龍膽、龍膽、三花龍膽或滇龍膽的干燥根和根莖，秦艽為龍膽科植物秦艽、麻花秦艽、粗莖秦艽或秦艽的干燥根，龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷等環(huán)烯醚萜類化合物為其主要活性成分，具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、保肝利膽、解痙鎮(zhèn)痛、增強免疫等多種活性[13]；防己為防己科植物粉防己的干燥根，粉防己堿、防己諾林堿、氧化防己堿、粉防己堿D鹽酸鹽等雙芐基異喹啉類生物堿，為粉防己的主要活性成分[14]。筆者在本研究參考中藥質(zhì)量標志物優(yōu)選原則，選取君藥羌活主要活性成分紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素，君藥龍膽、臣藥秦艽主要活性成分龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷，佐藥防己主要成分粉防己堿、防己諾林堿為質(zhì)控指標，為靈龍感冒膠囊多組分評價模式提供數(shù)據(jù)支持。

表2 靈龍感冒膠囊中9種成分加樣回收率實驗結(jié)果

表3 3批靈龍感冒膠囊含量測定結(jié)果

3.2色譜條件的選擇 本實驗為考察不同的流動相對測定成分龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇和異歐前胡素分離效果、峰形和出峰時間的影響，對比考察了甲醇-水[6-7]、乙腈-水[6]、乙腈-0.1%磷酸溶液[6，8，10，15]、乙腈-0.3%冰醋酸溶液[6，12]、乙腈-甲醇(1：1)與0.3%冰醋酸溶液[6]等流動相，對比結(jié)果顯示乙腈-甲醇(1：1)與0.3%醋酸溶液為流動相時，所測各成分分離效果和峰形綜合效果最佳，出峰時間也較為理想。在此流動相基礎(chǔ)上，筆者對流動相的比例進行逐步摸索，最終確定采用乙腈-甲醇(1：1)與0.3%冰醋酸溶液為流動相，按照文中“2.1”色譜條件項下流動相比例進行梯度洗脫，實現(xiàn)對靈龍感冒膠囊中9種成分龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素的定量測定。

3.3提取條件的選擇 制備供試品時作者為考察不同提取溶劑對所測成分龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇和異歐前胡素提取率的影響，對比考察了甲醇[6-12，16-18]、50%甲醇、無水乙醇、50%乙醇等提取溶劑，結(jié)果表明，在同一提取方式相同提取時間條件下，以甲醇為提取溶劑時龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素的提取效果最佳，故以甲醇為提取溶劑；在此實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，筆者分別考察超聲和加熱回流兩種提取方式對所測成分龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇和異歐前胡素提取率的影響，結(jié)果表明，超聲提取和加熱回流提取所測各成分綜合提取率差異不大，可能與靈龍感冒膠囊的制備工藝有關(guān)，考慮實驗操作的便捷和實驗結(jié)果的準確度，選用超聲提取方式作為靈龍感冒膠囊供試品溶液制備方式；同時又對不同提取時間進行考察研究，最終確定采用甲醇超聲提取30 min作為靈龍感冒膠囊供試品溶液的制備方法。

3.4待測成分暫定含量的確定根據(jù) 3個批次靈龍感冒膠囊中龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素平均含量的80%，暫定本品每克含龍膽、秦艽以龍膽苦苷計不得低于42.0 mg、以馬錢苷酸計不得低于3.4 mg、以獐牙菜苦苷計不得低于5.4 mg、以獐牙菜苷計不得低于1.5 mg；含防己以粉防己堿計不得低于10.1 mg、以防己諾林堿計不得低于4.3 mg；含羌活以紫花前胡苷計不得低于10.8 mg、以羌活醇計不得低于2.7 mg、以異歐前胡素計不得低于21.4 mg。

本實驗建立一種HPLC梯度洗脫法同時測定靈龍感冒膠囊中龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素的含量，所建立的方法簡便，準確，重復(fù)性好，可作為靈龍感冒膠囊的有效質(zhì)量控制方法。