小劑量環(huán)磷酰胺治療尖銳濕疣對角質(zhì)形成細(xì)胞的干細(xì)胞性及分化影響*

吳佳懌，諶素素，曹育春，張勇

(1.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科，北京 100142；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院皮膚科，武漢 430030；3.武漢友芝友生物制藥有限公司，武漢 430075)

尖銳濕疣(condyloma acuminata，CA)是由人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染引發(fā)的常見性傳播疾病，人類是其唯一的宿主。CA的復(fù)發(fā)仍然是目前臨床治療的難題，尋求有效防治CA復(fù)發(fā)的措施也是目前研究的熱點。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)小劑量環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)可選擇性地消減FoxP3+Treg細(xì)胞，而其他T細(xì)胞亞群不受影響[1-2]，表明小劑量CTX能夠降低抑制性免疫細(xì)胞。筆者建立的CTX治療CA “間歇、短程、小劑量”治療方案(CTX 1 mg·kg-1·d-1，連續(xù)服藥7 d，停3 d為一個療程，共3～6個療程)，經(jīng)研究也能夠改善CA局部細(xì)胞免疫功能，有效抑制CA疣體的生長[2]，并降低CA復(fù)發(fā)[3]。同時，該療法費用低、毒副作用不明顯。因此，小劑量CTX治療CA具有很好的潛在臨床轉(zhuǎn)化價值，然而其具體作用機制值得進一步研究。

CA組織病理表現(xiàn)以表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte，KCs)及棘層增厚呈乳頭瘤樣增生為主，其中的表皮KCs的增殖無疑起源于表皮中的干細(xì)胞或具有干細(xì)胞性的短暫擴增細(xì)胞。筆者前期也觀察到該療法治療后有較大比例的患者疣體縮小，甚至消退，針對其具體的分子機制，認(rèn)為疣體的產(chǎn)生與消退與KCs的增殖及分化密切相關(guān)?；讓又斜砥じ杉?xì)胞占基底層細(xì)胞總數(shù)1%～10%[4-5]，表皮干細(xì)胞能夠增殖分化為表皮組織中的各種細(xì)胞。因此，筆者進一步研究將小劑量CTX對CA疣體的作用機制，并聚焦于其是否影響CA疣體中KCs的干細(xì)胞性及細(xì)胞終末分化能力，報道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料與分組 以初發(fā)CA患者20例為對照組(CA組)，其中男10例，女10例，均為首次確診的CA患者；小劑量CTX治療CA患者8例為治療組(CTX組)，男5例，女3例，給予CTX 1 mg·kg-1·d-1，連續(xù)服藥7 d，停3 d為1個療程，共治療3個療程。兩組CA患者均不伴有其他性傳播疾病和病毒性感染疾病，且無其他嚴(yán)重的系統(tǒng)疾病，患者近4周未用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑?？瞻讓φ战M(NS組)10例，為泌尿外科包皮環(huán)切的男性患者，既往無不潔性交史，本人及配偶無CA等性傳播病病史，且無其他嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病，且近4周未接受糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療。所有CA患者均為2017年3—10月就診于華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院皮膚科患者，NS組為2017年5—10月就診于同院醫(yī)院泌尿外科患者，且所有患者均為成年人。

1.2儀器與試劑 兔抗人P63抗體(批號：12143-1-AP)，兔抗人整合素α6(integrin α6，ITGA6)抗體(批號：27189-1-AP)，兔抗人KRT10抗體(批號：16855-1-AP)，兔抗人Cytokeratin19抗體(批號：10712-1-AP)，均購于三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3實驗方法 取初發(fā)CA患者、CTX治療3個療程后，CA患者疣體及NS組患者包皮組織，經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、切片，采用標(biāo)準(zhǔn)免疫組化法進行染色，石蠟切片常規(guī)脫蠟，然后經(jīng)檸檬酸緩沖液浸泡進行抗原修復(fù)。用3% 過氧化氫(H2O2)阻斷內(nèi)源性過氧化物，接著用山羊血清封閉室溫孵育。然后順序加入一抗、二抗，DAB顯色，最后使用弱氨水進行返藍(lán)，進行切片脫水和封片以便后續(xù)觀察研究。

1.4結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) P63以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯的棕黃色染色顆?；蛏钭睾稚旧w粒為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)；ITGA6和K10以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯棕黃色染色顆?；蜃睾稚旧w粒為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。具體結(jié)果判定方法參照文獻(xiàn)[6]。將每張免疫組化染色切片統(tǒng)一在光學(xué)顯微鏡下放大至200倍，按照類似等距抽樣的方法原則，共取視野5個，計算每一個視野中免疫組化染色為陽性的細(xì)胞占所有細(xì)胞的百分比，取平均值。將陽性細(xì)胞百分比0%～5%標(biāo)記為“-”，>5%～25%標(biāo)記為“+”，>25%～50%的標(biāo)記為“++”，>50%標(biāo)記為“+++”。統(tǒng)計每個等級的切片數(shù)量。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，并采用秩和檢驗對等級資料進行差異性分析，Spearman等級相關(guān)處理用于兩組變量間的相關(guān)性研究，結(jié)果認(rèn)定：α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1P63的表達(dá) P63在正常組織中主要表達(dá)于表皮基底層； CA組表皮基底層、棘層以及顆粒層中均有表達(dá)； CTX組CA組織中主要表達(dá)于表皮基底層，在棘層中也可能出現(xiàn)少量的陽性表達(dá)。見圖1。3組P63免疫組化表達(dá)結(jié)果見表1。P63在CA組內(nèi)表達(dá)最多，表達(dá)量明顯高于NS組和CTX 組，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。但是P63在NS組和CTX組中表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2ITGA6的表達(dá) ITGA6在細(xì)胞內(nèi)主要定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核中，其表達(dá)結(jié)果與P63表達(dá)結(jié)果相近。見圖1。3組ITGA6免疫組化表達(dá)結(jié)果見表2。ITGA6在CA組內(nèi)表達(dá)最多，表達(dá)量明顯高于NS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與NS組比較， CTX組ITGA6表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與CA組比較， CTX組ITGA6表達(dá)量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3K10的表達(dá) NS組K10主要表達(dá)于除表皮基底層以外的結(jié)構(gòu)中，即棘層向外，表皮基底層表達(dá)為陰性；CA組表皮基底層K10表達(dá)為陰性，且基底層向上的結(jié)構(gòu)中表達(dá)量較NS組少；CTX組K10表皮基底層同樣表達(dá)為陰性，但是在棘層、顆粒層及向外的結(jié)構(gòu)中表達(dá)量較高。見圖1。3組K10免疫組化表達(dá)情況見表3。K10在NS組內(nèi)表達(dá)最多，表達(dá)量明顯高于CA組和CTX組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。與CA組比較，CTX組K10表達(dá)量增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 3組P63、ITGA6及K10免疫組化表達(dá)

表1 3組P63免疫組化表達(dá)情況

表2 3組ITGA6免疫組化表達(dá)情況

3 討論

CTX本身不具有藥理作用，經(jīng)過肝細(xì)胞微粒體酶系統(tǒng)的轉(zhuǎn)換作用，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似于氮芥的活性代謝物而發(fā)揮作用[7-8]。本研究是在基于小劑量CTX治療CA的療法能使一部分CA患者疣體縮小，甚至消退現(xiàn)象的基礎(chǔ)上，進一步探尋疣體中與KCs的增殖與分化相關(guān)的分子事件。CA的組織病理顯示出不同程度的棘層肥厚，且棘層細(xì)胞出現(xiàn)明顯的空泡變性(挖空細(xì)胞)，同時有基底樣細(xì)胞增生，并伴有乳頭瘤樣增生。疣體KCs按分化程度的序列可分為表皮干細(xì)胞、短暫擴增細(xì)胞、分化細(xì)胞及終末分化細(xì)胞。由于細(xì)胞分化是一個逐漸完成的過程，致使表皮干細(xì)胞與短暫擴增細(xì)胞之間的界限不清，無論從細(xì)胞形態(tài)上，還是從干細(xì)胞的分子表達(dá)程度上，都無法辨別這兩類細(xì)胞。正常位于基底層及其上方的短暫擴增細(xì)胞其實是由表皮干細(xì)胞及其不同代的子代細(xì)胞，隨著擴增代數(shù)的增加，其干細(xì)胞性是一個逐漸喪失的過程，因而干細(xì)胞的標(biāo)志物在KCs中的短暫擴增細(xì)胞群體中仍然存在，目前未明確絕對的表皮干細(xì)胞標(biāo)記物，但可以肯定表皮干細(xì)胞存在于具有干細(xì)胞性的一群KCs中。這是本研究使用“KCs的干細(xì)胞性”這一名詞的理由。

表3 3組K10免疫組化表達(dá)情況

表皮干細(xì)胞注定是從增殖走向終末分化，轉(zhuǎn)錄因子P63既是干細(xì)胞標(biāo)志物，也是增殖標(biāo)志物，二者是一體兩面性。目前對于表皮干細(xì)胞標(biāo)志物的研究，主要集中于整合素、轉(zhuǎn)錄因子P63以及角蛋白[9-12]。Mckeon及其團隊證實P63可以用于識別表皮中干細(xì)胞[9]，同時也有文獻(xiàn)證實ITGA6可以用作表皮干細(xì)胞標(biāo)志物[13]。表皮干細(xì)胞的生物學(xué)使命就是從增殖走向終末分化。而對于分化成熟的KCs，已有多篇文獻(xiàn)使用K10作為其標(biāo)志物[14-16]。因此，本文擬使用P63及ITGA6標(biāo)志物用作表征疣體KCs的干細(xì)胞性，使用K10標(biāo)志物用作表征KCs的終末分化程度。

就干細(xì)胞性而言，結(jié)果顯示在正常包皮組織KCs的P63及ITGA6主要表達(dá)于基底層，在未經(jīng)小劑量CTX治療的對照組中，P63及ITGA6表達(dá)量均較正常包皮組織增多，而且表達(dá)部位不僅局限于基底層，在靠近基底層的棘層中也存在較多陽性表達(dá)。此結(jié)果說明CA組織中KCs的干細(xì)胞性存在增強的現(xiàn)象。而CTX組KCs的干細(xì)胞性明顯下降，陽性表達(dá)位置主要在基底層，而靠近基底層的棘層中僅有少量表達(dá)。該結(jié)果顯示小劑量CTX治療CA后存在KCs的干細(xì)胞性明顯下降現(xiàn)象。就KCs終末分化能力的影響而言，結(jié)果顯示正常包皮組織KCs的K10表達(dá)于基底層以上的表皮結(jié)構(gòu)中，基底層表達(dá)為陰性；CA組K10表達(dá)量較NS組明顯減少，基底層不表達(dá)，在基底層上方的KCs中，仍可見較多陰性表達(dá)的細(xì)胞組織，該結(jié)果提示CA組織中KCs的終末分化受阻。CTX組KCs的K10表達(dá)量雖然沒達(dá)到正常組織水平，但有明顯增加現(xiàn)象，提示小劑量CTX療法可以促進疣體組織走向終末分化。

關(guān)于表皮干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物在尖銳濕疣組織內(nèi)的表達(dá)的研究不少，大部分結(jié)果顯示表皮干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物在CA組織內(nèi)表達(dá)增多[17-18]。依據(jù)上述結(jié)果，可以得知經(jīng)“小劑量CTX療法”治療的CA患者，疣體中KCs的干細(xì)胞性下降，終末分化的能力增強，預(yù)示該療法能減少疣體中KCs的增殖，促進分化。

雖然上述結(jié)果為表象，但提示今后對該療法的有效性分子機制研究的方向，既可以聚焦到對疣體中KCs的干細(xì)胞性產(chǎn)生影響的具體分子機制，也可以聚焦到對疣體內(nèi)KCs的終末分化的具體分子機制上。該療法有效機制的闡明為其臨床轉(zhuǎn)化提供理論基礎(chǔ)。

本研究的不足之處在于樣本數(shù)量偏小，需要進一步擴大樣本量進行研究，提供更充分的證據(jù)加以證實這一現(xiàn)象。