上海市門診寵物貓和動物園流浪貓的貓皰疹病毒1型中和抗體檢測

（上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

貓皰疹病毒1型（feline herpesvirus type 1，F(xiàn)HV-1）能引起貓急性上呼吸道感染，是貓傳染性鼻氣管炎的病原[1]。從臨床表現(xiàn)看，這種皰疹病毒所引起的疾病，與貓鼻結(jié)膜炎（杯狀病毒引起）、貓傳染性泛白細(xì)胞減少癥（細(xì)小病毒引起）和貓肺炎（衣原體引起）很難區(qū)分，只有靠特異的血清學(xué)反應(yīng)、病原分子生物學(xué)檢測或病原分離鑒定才能做出準(zhǔn)確診斷[2]。貓傳染性鼻氣管炎是一種高度接觸性傳染病，發(fā)病率很高，可達(dá)100%。雖然成年貓感染FHV-1后大多痊愈，病死率很低，但幼仔貓感染后癥狀嚴(yán)重，病死率可達(dá)50%，甚至終生帶毒排毒，并可垂直傳播，危害很大[3]。近年來，廣東、江蘇和上海等地華南虎和東北虎相繼發(fā)生以流鼻涕、咳嗽、支氣管充血出血為主要癥狀的傳染性疾病，經(jīng)病毒分離和基因測序鑒定為虎源性FHV-1感染[4]。

本研究采集已免疫三聯(lián)疫苗（貓瘟病毒、FHV-1和貓杯狀病毒）的家養(yǎng)貓血清20份和未免疫的動物園流浪貓血清10份，采用中和試驗方法檢測FHV-1抗體滴度，從而了解疫苗的免疫效果和未免疫流浪貓的感染狀況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細(xì)胞和陽性血清 FHV-1/cat/Shanghai/01/2014/株，由本實驗室2014年分離鑒定；F81細(xì)胞，由本實驗室保存；FHV-1標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，由FHV-1/cat/Shanghai/01/2014/株滅活后免疫貓制備獲得，中和效價為1:512。

1.1.2 試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（批號2126865），胰酶消化液（0.25%，批號2042303），均購自GIBCO公司；胎牛血清（FBS，批號2418），購自SIGMA公司。

1.1.3 耗材 25 m2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、24孔細(xì)胞板、吸管、10 mL一次性移液管、5 mL采血器。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 2020年3月，集中采集家養(yǎng)貓（已免三聯(lián)苗1個月至2年）血清20份，采集非免疫動物園流浪貓血清10份。于貓前臂頭靜脈采血4 mL，37 ℃放置1 h，凝固后1 000 r/min離心10 min，取上清血清備用。

1.2.2 病毒增殖 將貼壁生長的F81細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液，然后稀釋為1×106個/mL；采用同步培養(yǎng)方式，將1 mL FHV-1/cat/Shanghai/01/2014/株病毒原液加入到10 mL細(xì)胞懸液中，輕微搖動混勻后于37 ℃、5% CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12 h觀察細(xì)胞病變；當(dāng)70%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）、圓縮和脫落時，將培養(yǎng)液凍融3次，2 000 r/min離心5 min，收獲病毒上清，分裝備用。

1.2.3 TCID50測定 將收獲的FHV-1病毒液進(jìn)行10倍倍比稀釋，共稀釋12個梯度；將消化好的F81細(xì)胞稀釋為1×106個/mL，然后加入到24孔板中，每孔500 μL；同時將稀釋好的病毒液也加入到24孔板中，每孔100 μL，每個稀釋度重復(fù)8個孔；輕微搖動混勻后于37 ℃、5% CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d后顯微鏡下觀察結(jié)果。出現(xiàn)CPE的孔記為+，未出現(xiàn)的記為-。按照Reed-Muench法，計算該病毒懸液的TCID50[5]。

1.2.4 病毒中和試驗 根據(jù)測定的TCID50值，將FHV-1懸液稀釋成100個TCID50/100 μL；將標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性血清以及待測血清樣品56 ℃滅活30 min，然后用細(xì)胞培養(yǎng)基2倍倍比稀釋至1:212；吸取各稀釋度血清500 μL加入到1.5 mL離心管中，同時加入500 μL已稀釋好的FHV-1病毒液，輕輕搖晃混合后于37 ℃孵育1 h；將消化好的F81細(xì)胞稀釋為1×106個/mL，然后加入到24孔板中，每孔500 μL；同時將血清病毒混合液也加入到24孔板中，每孔100 μL，每個稀釋度重復(fù)4個孔，同時設(shè)置血清、病毒和正常細(xì)胞對照；于37 ℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變。一半以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE的孔視為陽性，該血清稀釋倍數(shù)即為血清效價[6]。待檢血清的中和指數(shù)大于50，即可判為陽性，10～49為可疑，小于10為陰性[7]。

2 結(jié)果

2.1 病毒增殖

FHV-1/cat/Shanghai/01/2014/株病毒液同步接種到F81細(xì)胞中，2 h時30%的細(xì)胞完成了貼壁生長，6 h時70%完成了貼壁生長；12 h時細(xì)胞出現(xiàn)輕微病變，細(xì)胞邊緣變得模糊；24 h時細(xì)胞出現(xiàn)典型CPE，細(xì)胞圓縮、聚集；36 h時細(xì)胞基本脫落，呈現(xiàn)折光率增強、成團(tuán)塊等現(xiàn)象（圖1）。

2.2 TCID50測定

對本試驗培養(yǎng)的FHV-1/cat/Shanghai/01/2014/株病毒液進(jìn)行TCID50測定，每個病毒稀釋度出現(xiàn)CPE的孔數(shù)見表1。按照Reed-Muench法，計算出該病毒懸液的TCID50為10-5.33/0.1 mL。

圖1 FHV-1接種F81細(xì)胞后的病變觀察結(jié)果

表1 FHV-1 TCID50的測定結(jié)果

2.3 中和抗體檢測

20份家養(yǎng)貓血清中，檢出陽性12份，檢出率為60%（12/20）；10份流浪貓血清中，檢出陽性6份，檢出率為60%（6/10），詳見圖2和表2。

3 討論

圖2 部分血清中和病毒后接種F81細(xì)胞觀察結(jié)果

表2 FHV-1血清中和抗體檢測結(jié)果

貓傳染性鼻氣管炎是目前已知的重要貓呼吸道疾病之一，可導(dǎo)致幼貓出現(xiàn)較高的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重危害貓的健康[8]。雖然有很多關(guān)于FHV-1新型疫苗的報道，市場上也有商品化疫苗，主要為“貓三聯(lián)”和“貓四聯(lián)”，但其免疫效果不穩(wěn)定，免疫期內(nèi)仍有該病反復(fù)發(fā)生[9]。張曉明等[10]原核表達(dá)了FHV-1 gD蛋白基因，建立了ELISA檢測方法，為FHV-1抗體快速檢測奠定了基礎(chǔ)。雖然ELISA具有快速、便捷，對人員技術(shù)要求不高等特點，但其特異性和敏感性與中和抗體法有較大差距。

本研究利用臨床分離病毒建立了FHV-1中和抗體檢測方法，這是中和抗體檢測的經(jīng)典方法。檢測結(jié)果顯示，臨床寵物貓的FHV-1免疫中和抗體合格率只有60%，雖然部分貓的抗體效價達(dá)到1:210，但也存在15%的貓抗體為0，25%的貓免疫抗體不合格，抗體滴度達(dá)不到抵抗病毒感染的效價。因此，建議寵物貓免疫FHV-1疫苗后需進(jìn)行中和抗體效價測定，中和抗體效價不合格的需要補免，以確保免疫抗體滴度達(dá)到要求。

本研究對動物園流浪貓血清進(jìn)行了FHV-1中和抗體檢測，發(fā)現(xiàn)抗體陽性率為60%，感染率高達(dá)80%，表明該動物園流浪貓感染FHV-1較普遍。建議對動物園流浪貓進(jìn)行定期捕捉、免疫和收容，加強動物園貓科動物的FHV-1免疫和監(jiān)測。

FHV-1不僅感染貓，對貓科的其他動物如虎、豹等，也有較高的致病性。2012年，廣東省某地的2只成年東北虎出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降、結(jié)膜發(fā)炎，眼鼻出現(xiàn)漿液性分泌物，經(jīng)抗生素治療無效，5 d后死亡；毗鄰的華南虎也出現(xiàn)結(jié)膜發(fā)炎和眼鼻出現(xiàn)漿液性分泌物等癥狀，采取阿昔洛韋等抗病毒藥物治療7 d后康復(fù)[4]。從病料中分離到病毒粒子，經(jīng)基因序列分析鑒定為虎源性FHV-1，但注射FHV-1滅活疫苗或弱毒疫苗對虎的免疫保護(hù)效果較差[11]。建議研發(fā)適用于大型貓科動物使用的FHV-1疫苗[12]，同時應(yīng)當(dāng)加強動物園流浪貓和貓科動物的FHV-1病原學(xué)檢測[13-15]。

4 結(jié)論

本研究采用FHV-1中和抗體檢測方法，對免疫和未免疫貓血清進(jìn)行抗體檢測，發(fā)現(xiàn)免疫貓的FHV-1免疫效果不佳，未免疫流浪貓的FHV-1感染較嚴(yán)重。建議加強寵物貓的FHV-1疫苗免疫抗體監(jiān)測，不合格時及時補免；對流浪貓定期捕捉、收容、免疫和監(jiān)測。