轉(zhuǎn)飛蝗羧酸酯酶基因果蠅品系的構(gòu)建及其在有機(jī)磷農(nóng)藥代謝解毒中的作用

尹 菲,楊 洋,張徐波,張建珍,張建琴,*

(1.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,太原 030006;2.山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所,太原030006)

飛蝗Locustamigratoria屬于植食性昆蟲(chóng)，主要以禾本科植物為生，危害的農(nóng)作物涉及玉米、小麥、谷子和高粱，在極端環(huán)境下也可危害大豆和白菜等(尤其儆等,1958)。羽化后的成蟲(chóng)在環(huán)境溫度達(dá)到 31～34℃時(shí)，開(kāi)始聚集遷飛，所到之處農(nóng)作物大面積破壞，造成農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失(尤其儆等,2003;吳瑞芬等,2006)?；瘜W(xué)防治法是防治蝗災(zāi)的一種有效方法，殺蟲(chóng)劑的長(zhǎng)期施用導(dǎo)致飛蝗對(duì)馬拉硫磷等殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了抗性(Maetal.,2004)。羧酸酯酶是昆蟲(chóng)體內(nèi)主要的一類代謝解毒酶系，其功能主要是參與包含酯鍵的殺蟲(chóng)劑等外源性化合物的解毒，信息素的分解和神經(jīng)發(fā)育及調(diào)控(Heikinheimoetal.,1999)。一般情況下當(dāng)羧酸酯酶與有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑相互反應(yīng)時(shí)，去磷酸化反應(yīng)的速率較慢，昆蟲(chóng)體內(nèi)羧酸酯酶基因無(wú)法與底物快速分離，此時(shí)酶活性被抑制。但是在一些具有有機(jī)磷農(nóng)藥抗性的昆蟲(chóng)體內(nèi)，存在著一種特殊的酶類，這種酶可以快速將馬拉硫磷分解為無(wú)毒的產(chǎn)物，從而使得昆蟲(chóng)對(duì)馬拉硫磷的耐受性增強(qiáng)，進(jìn)而使得昆蟲(chóng)對(duì)該農(nóng)藥具有抗性(Heidarietal.,2004;Cuietal.,2007)。Yang等(2008)的研究表明野生型飛蝗馬拉硫磷抗性品系的羧酸酯酶活性提高。由此得知，羧酸酯酶在飛蝗對(duì)有機(jī)磷的抗性中發(fā)揮重要作用。

本課題組前期采用RNA干擾(RNA interference,RNAi)結(jié)合殺蟲(chóng)劑生物學(xué)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示處于A簇的直翅目昆蟲(chóng)α酯酶基因LmCesA1和LmCesA2與有機(jī)磷農(nóng)藥的代謝解毒相關(guān)(Zhangetal.,2013)，但這兩個(gè)基因在飛蝗體內(nèi)的超表達(dá)是否會(huì)導(dǎo)致飛蝗對(duì)馬拉硫磷的抗性還不清楚。目前已有研究利用果蠅模型超表達(dá)非模式昆蟲(chóng)的基因，借助轉(zhuǎn)基因果蠅技術(shù)優(yōu)勢(shì)研究非模式生物基因的功能(Riveronetal.,2013,2014)。因此，本研究利用果蠅模型，分析飛蝗羧酸酯酶基因LmCesA1和LmCesA2的超表達(dá)及其與對(duì)馬拉硫磷的抗性的關(guān)系，以期為飛蝗抗性的監(jiān)測(cè)和治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

果蠅品系：RB0006親本黑腹果蠅Drosophilamelanogaster品系，基因型為{y v;attP40,y+}，購(gòu)買于北京清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院果蠅實(shí)驗(yàn)中心。tub-Gal4品系可啟動(dòng)靶標(biāo)基因的全身表達(dá)，該品系由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所姚愛(ài)玉老師友情提供；act-Gal4品系可啟動(dòng)靶標(biāo)基因的全身表達(dá)；c601-Gal4品系是腸道組織特異表達(dá)的果蠅品系，act-Gal4與c601-Gal4由山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所友情提供。

果蠅飼養(yǎng)條件：溫度25±2℃，相對(duì)濕度60%～70%，光周期14L∶10D。

1.2 供試試劑

DEPC水購(gòu)自Sangon公司；Trizol,DNA Marker,6×Loading Buffer,Olige(dT)12-18 Primer,5×M-MLV Buffer,dNTP Mixture,RNase Inhibitor,Ex Taq和RTase M-MLV均購(gòu)自TaKaRa公司；2×Taq PCR Master購(gòu)自Tiangen公司；SYBR Green Realtime PCR Master Mix購(gòu)自Toyobo公司；馬拉硫磷購(gòu)自Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑。

1.3 轉(zhuǎn)基因果蠅的構(gòu)建

本研究轉(zhuǎn)飛蝗羧酸酯酶基因果蠅構(gòu)建委托清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院果蠅模式中心完成，具體的研究方法如下：根據(jù)飛蝗羧酸酯酶基因LmCesA1和LmCesA2的核苷酸序列，采用在線軟件NEBcutter V2.0 (http:∥tools.neb.com/NEBcutter2/)分析這兩個(gè)基因的酶切位點(diǎn)，結(jié)合載體pVALIUM20多克隆位點(diǎn)內(nèi)切酶類型，設(shè)計(jì)構(gòu)建載體引物(表1)。后經(jīng)PCR擴(kuò)增，克隆測(cè)序確定將目的基因克隆到pVALIUM20載體中。將一定濃度的重組載體注射到親本果蠅受精卵中，篩選到的轉(zhuǎn)基因果蠅再與balancer果蠅雜交，得到純合的、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因果蠅品系UAS-LmCesA1和UAS-LmCesA2，該轉(zhuǎn)基因技術(shù)采用了定點(diǎn)轉(zhuǎn)座技術(shù)，目的基因以單拷貝的方式插入到果蠅2號(hào)染色體上。

表1 用于本研究的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 轉(zhuǎn)基因果蠅與3品系Gal4果蠅雜交試驗(yàn)

分別挑取不同Gal4果蠅中的處女蠅，與轉(zhuǎn)基因果蠅品系UAS-LmCesA1和UAS-LmCesA2的父本果蠅以雌雄2∶1的比例進(jìn)行雜交，按照標(biāo)準(zhǔn)挑取所需要的子一代果蠅，RB0006品系作為對(duì)照果蠅，具體步驟如下：

(1)act-Gal4品系的處女蠅與UAS-LmCesA1品系的雄蠅雜交，子一代基因型為act>LmCesA1；act-Gal4品系的處女蠅與UAS-LmCesA2品系的雄蠅雜交，子一代基因型為act>LmCesA2；act-Gal4品系的處女蠅與RB0006品系的雄蠅雜交，子一代基因型為act>attP40。act-Gal4果蠅帶有卷翅平衡子，因此，挑取子一代的直翅果蠅進(jìn)行后續(xù)研究。

(2)tub-Gal4品系的處女蠅與UAS-LmCesA1品系的雄蠅雜交，子一代基因型為tub>LmCesA1；tub-Gal4品系的處女蠅與UAS-LmCesA2品系的雄蠅雜交，子一代基因型為tub>LmCesA2；tub-Gal4品系的處女蠅與RB0006品系的雄蠅雜交，子一代基因型為tub>attP40。tub-Gal4果蠅帶有TM6B平衡子，因此，挑取子一代帶有兩根簇剛毛的果蠅進(jìn)行后續(xù)研究。

(3)c601-Gal4品系的處女蠅與UAS-LmCesA1品系的雄蠅雜交，子一代基因型為c601>LmCesA1；c601-Gal4品系的處女蠅與UAS-LmCesA2品系的雄蠅雜交，子一代基因型為c601>LmCesA2；c601-Gal4品系的處女蠅與RB0006品系的雄蠅雜交，子一代基因型為c601>attP40，c601-Gal4品系是腸道組織特異表達(dá)的果蠅品系，子一代全部為靶標(biāo)基因超表達(dá)果蠅。

1.5 轉(zhuǎn)基因果蠅的分子鑒定

1.5.1轉(zhuǎn)基因果蠅品系DNA水平的鑒定：轉(zhuǎn)基因果蠅品系與tub-Gal4果蠅品系雜交，分別選擇4-6 d雜交子一代tub>LmCesA1，tub>LmCesA2和tub>attP40的雌性果蠅進(jìn)行DNA提取，采用轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL PCR反應(yīng)體系:DNA(10×) 2 μL,TaKaRa Ex Taq (5 U/μL) 0.1 μL,10×Ex Taq Buffer 2.5 μL,dNTPs(2.5 mmol/L) 2 μL,上下游引物各 0.5 μL,ddH2O 17.4 μL。反應(yīng)條件:95℃ 1 min；95℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 2 min,35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min,4℃保存，用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，采用天根公司的膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收，T-A克隆測(cè)序。

1.5.2轉(zhuǎn)基因果蠅品系RNA水平的鑒定：分別選擇各組羽化后第4-6天的子一代雌蠅提取總RNA，體外反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，以cDNA為模板，以表1設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),rp49作為內(nèi)參基因。RT-PCR 反應(yīng)體系：cDNA(10×)4 μL,上下游引物各0.8 μL,2×Taq Master Mix 12.5 μL,ddH2O 6.9 μL。反應(yīng)條件：94℃ 3 min;94℃ 30 s，60℃ 30 s,72℃ 1 min (LmCesA1和LmCesA2基因28個(gè)循環(huán)，內(nèi)參rp49基因25個(gè)循環(huán));72℃ 5 min。RT-PCR實(shí)驗(yàn)分組按照1.4節(jié)雜交分組，每個(gè)組別共設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，5頭果蠅為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

采用RT-qPCR法分別檢測(cè)靶標(biāo)基因在c601-Gal4果蠅品系與UAS-LmCesA1品系和UAS-LmCesA2品系雜交子一代成蟲(chóng)不同組織腦、腸和表皮等中的mRNA表達(dá)情況，rp49作為內(nèi)參基因。引物如表1。RT-qPCR反應(yīng)體系:SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各 0.8 μL,cDNA (10×) 4.0 μL,滅菌水4.4 μL。反應(yīng)條件:95℃ 1 min;95℃ 5 s,55℃ 10 s,72℃ 15 s,40個(gè)循環(huán);95℃ 1 min,55℃ 1 min,97℃ 1 min,37℃ 30 s。至少50頭果蠅為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.6 轉(zhuǎn)基因果蠅對(duì)馬拉硫磷的耐受性測(cè)定

生物學(xué)測(cè)定采用的果蠅為c601>LmCesA1,c601>LmCesA2和c601>attP40。用純丙酮將馬拉硫磷配制成一系列濃度梯度。挑取羽化后4-6 d的子一代果蠅，并用CO2麻痹，將0.25 μL的農(nóng)藥點(diǎn)滴于果蠅的腹部，每組選用15頭雌性果蠅進(jìn)行處理，每個(gè)組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。將果蠅置于培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)置為25±1℃，相對(duì)濕度為60%，24 h后記錄果蠅的死亡率，當(dāng)果蠅輕觸不動(dòng)則視為死亡。

1.7 數(shù)據(jù)分析

RT-qPCR數(shù)據(jù)利用ABI Prism 7500 SDS 1.1軟件進(jìn)行分析，基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan氏多樣本間差異比較目標(biāo)基因在各品系中的表達(dá)量的差異。生物測(cè)定數(shù)據(jù)用SPSS軟件的Probit方法計(jì)算LC50。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因果蠅品系DNA水平的鑒定結(jié)果

以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，LmCesA1和LmCesA2的PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度分別為1 648 bp和1 525 bp，由圖1可知，轉(zhuǎn)基因果蠅tub>LmCesA1和tub>LmCesA2中均能擴(kuò)增到目的基因，而對(duì)照組果蠅tub>attP40中未擴(kuò)增到目的基因。測(cè)序結(jié)果顯示插入的目的基因序列正確無(wú)誤。

圖1 轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅DNA水平的鑒定結(jié)果Fig.1 Identification results of transgenic Drosophila melanogaster at the DNA levelM:DL5000 DNA Marker;tub>attP40:對(duì)照組果蠅Control Drosophila;tub>LmCesA1:過(guò)表達(dá)LmCesA1的轉(zhuǎn)基因果蠅Transgenic Drosophila overexpressing LmCesA1;tub>LmCesA2:過(guò)表達(dá)LmCesA2的轉(zhuǎn)基因果蠅Transgenic Drosophila overexpressing LmCesA2.

2.2 轉(zhuǎn)基因果蠅品系RNA水平的鑒定結(jié)果

將轉(zhuǎn)基因果蠅UAS-LmCesA1,UAS-LmCesA2和親本果蠅RB0006分別與3品系Gal4果蠅雜交。選擇其第4-6天的子一代提取總RNA，并體外反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA用于RNA水平的基因鑒定，結(jié)果顯示：靶標(biāo)基因LmCesA1和LmCesA2在對(duì)照組(act>attP40;tub>attP40;c601>attP40)中均沒(méi)有表達(dá)；LmCesA1在不同Gal4品系與UAS-LmCesA1果蠅的雜交子一代act>LmCesA1(圖2:A)、tub>LmCesA1(圖2:B)和c601>LmCesA1(圖2:C)中均有表達(dá)；LmCesA2在不同Gal4品系與UAS-LmCesA2果蠅的雜交子一代act>LmCesA2(圖2:A)、tub>LmCesA2(圖2:B)和c601>LmCesA2(圖2:C)中均有表達(dá)。

圖2 轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅RNA水平的鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of transgenic Drosophila melanogaster at the RNA levelact>attP40:act-Gal4品系與對(duì)照組果蠅RB0006品系的雜交子一代Hybrid offspring of act-Gal4 strain and the control RB0006 strain;act>LmCesA1:act-Gal4品系與UAS-LmCesA1品系的雜交子一代Hybrid offspring of act-Gal4 strain and UAS-LmCesA1 strain;act>LmCesA2:act-Gal4品系與UAS-LmCesA2品系的雜交子一代Hybrid offspring of act-Gal4 strain and UAS-LmCesA2 strain.tub>attP40:tub-Gal4品系與對(duì)照組果蠅RB0006品系的雜交子一代Hybrid offspring of tub-Gal4 strain and the control RB0006 strain;tub>LmCesA1:tub-Gal4品系與UAS-LmCesA1品系的雜交子一代Hybrid offspring of tub-Gal4 strain and UAS-LmCesA1 strain;tub>LmCesA2:tub-Gal4品系與UAS-LmCesA2品系的雜交子一代Hybrid offspring of tub-Gal4 strain and UAS-LmCesA2 strain;c601>attP40:c601-Gal4品系與對(duì)照組果蠅RB0006品系的雜交子一代Hybrid offspring of c601-Gal4 strain and the control RB0006 strain;c601>LmCesA1:c601-Gal4品系與UAS-LmCesA1品系的雜交子一代Hybrid offspring of c601-Gal4 strain and UAS-LmCesA1 strain;c601>LmCesA2:c601-Gal4品系與UAS-LmCesA2品系的雜交子一代Hybrid offspring of c601-Gal4 strain and UAS-LmCesA2 strain.

c601-Gal4在果蠅中腸上皮細(xì)胞中高表達(dá)，本研究采用RT-qPCR方法鑒定了目的基因LmCesA1和LmCesA2分別在轉(zhuǎn)基因果蠅c601>LmCesA1和c601>LmCesA2成蟲(chóng)不同組織部位(腦、表皮和腸道)中的表達(dá)情況。由圖3可知，兩個(gè)目的基因LmCesA1和LmCesA2均在轉(zhuǎn)基因果蠅的腸道中高表達(dá)。LmCesA1在c601>LmCesA1果蠅腸道中的表達(dá)量分別是腦和表皮中的7.6和16.7倍。LmCesA2在c601>LmCesA2果蠅腸道中的表達(dá)量分別是腦和表皮中的5.4和10.9倍。

圖3 LmCesA1(A)與LmCesA2(B)基因在轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)譜Fig.3 Expression profiles of LmCesA1 (A) and LmCesA2 (B) in different adult tissues of transgenic strains of Drosophila melanogaster選擇腦、表皮和腸道3個(gè)組織部位進(jìn)行分析；每組織設(shè)4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)采用3個(gè)技術(shù)重復(fù)；rp49 為內(nèi)參基因。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同字母代表不同組織之間基因表達(dá)量有顯著性差異(P<0.05,Duncan氏多重比較檢驗(yàn))。The analyses were conducted in three different tissues,including the brain,cuticle and gut,and rp49 was used as a reference gene.Data are mean±standard errors (SE) of four biological replications (n=4),each with three technical replications.Different letters above bars indicate significant differences in the gene expression level among tissues by Duncan’s multiple comparison test (P<0.05).

2.3 轉(zhuǎn)基因果蠅對(duì)馬拉硫磷的耐受性

轉(zhuǎn)基因果蠅對(duì)馬拉硫磷的耐受性研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組果蠅(c601>attP40)相比，超表達(dá)LmCesA1的轉(zhuǎn)基因果蠅(c601>LmCesA1)和超表達(dá)LmCesA2的轉(zhuǎn)基因果蠅(c601>LmCesA2)抗藥性均提高，抗性倍數(shù)分別為1.06和1.67(表2)。

表2 分別超表達(dá)LmCesA1和LmCesA2的黑腹果蠅品系對(duì)馬拉硫磷的耐受性Table 2 Tolerance of Drosophila melanogaster strains overexpressing LmCesA1 or LmCesA2 to malathion

3 討論

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)基因果蠅技術(shù)闡明飛蝗羧酸酯酶基因(LmCesA1和LmCesA2)與有機(jī)磷農(nóng)藥代謝解毒的關(guān)系。當(dāng)前，研究者可采用多種方法鑒定與農(nóng)藥解毒或抗性相關(guān)的昆蟲(chóng)羧酸酯酶。例如，Wei等(2016)通過(guò)RT-qPCR技術(shù)對(duì)朱砂葉螨Tetranychuscinnabarinus羧酸酯酶基因(CarE)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，相比于敏感品系，有8個(gè)羧酸酯酶基因(CarE3,CarE6,CarE7,CarE9,CarE10,CarE13,CarE15和CarE18)參與了甲氰菊酯的解毒過(guò)程，有4個(gè)羧酸酯酶基因(CarE4,CarE5,CarE14和CarE19)參與了氟甲氰菊酯的解毒過(guò)程；Wang等(2017)采用RNAi以及異源表達(dá)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，證明了桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis的羧酸酯酶基因BdB1參與了對(duì)馬拉硫磷的解毒過(guò)程；Feng等(2018)基于家蠅Muscadomestica轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比黑腹果蠅D.melanogaster和岡比亞按蚊Anophelesgambiae，構(gòu)建羧酸酯酶的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，最終在家蠅中共鑒定出39個(gè)不同功能分支的羧酸酯酶基因。上述研究技術(shù)可初步篩選到與抗藥性相關(guān)的基因，但無(wú)法進(jìn)一步深入探究和驗(yàn)證哪些候選基因具體參與了哪種殺蟲(chóng)劑的代謝。果蠅因其獨(dú)特的生理特征，如易于室內(nèi)培養(yǎng)、染色體數(shù)目少、表型易于觀察以及發(fā)育繁殖快且繁殖量大等，被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、醫(yī)學(xué)病理學(xué)等研究。果蠅用于經(jīng)典遺傳學(xué)領(lǐng)域以揭示真核生物染色體結(jié)構(gòu)，染色體遺傳連鎖等(Nüsslein-Volhard and Wieschaus,1980)。近年來(lái)，許多學(xué)者嘗試將其他昆蟲(chóng)外源基因轉(zhuǎn)到果蠅基因組上，以研究這些基因的功能(常海靜,2011;朱昱璇,2016;Stinchfieletal.,2019;張徐波等,2019)。Zhu等(2010)首次在國(guó)際上報(bào)道了將轉(zhuǎn)基因果蠅成功應(yīng)用于赤擬谷盜Triboliumcastaneum抗性基因 P450與溴氰菊酯代謝解毒關(guān)系的研究中。黑腹果蠅因其體內(nèi)具備完善的Gal4/UAS體系，可以實(shí)現(xiàn)外源基因在其體內(nèi)的超表達(dá)，進(jìn)而對(duì)靶標(biāo)基因進(jìn)行生物測(cè)定、生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究，可更深入地闡明該基因的功能?；蛉笔怨δ苎芯亢突颢@得性功能研究是研究基因功能的兩種重要的方法。但就目前的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在飛蝗體內(nèi)難以實(shí)現(xiàn)基因的獲得性功能研究。因此，本研究采用Gal4/UAS系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了飛蝗羧酸酯酶基因(LmCesA1和LmCesA2)在黑腹果蠅體內(nèi)的超表達(dá)，以期在果蠅體內(nèi)完成基因獲得性功能研究。

轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅RNA水平的鑒定結(jié)果顯示，3品系Gal4(act-Gal4,tub-Gal4和c601-Gal4)果蠅與轉(zhuǎn)基因果蠅雜交的子一代均可檢測(cè)出目的基因的表達(dá)(圖2)，表明3品系Gal4果蠅均可啟動(dòng)兩個(gè)靶標(biāo)基因的表達(dá)，且針對(duì)單一基因的mRNA的表達(dá)量無(wú)顯著差異。c601-Gal4在果蠅中腸上皮細(xì)胞中高表達(dá)，為驗(yàn)證c601-Gal4果蠅與轉(zhuǎn)基因果蠅雜交后代中靶標(biāo)基因表達(dá)部位，本研究采用RT-qPCR方法，進(jìn)一步驗(yàn)證了靶標(biāo)基因在轉(zhuǎn)基因果蠅成蟲(chóng)腦、表皮和腸道等不同組織部位的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，LmCesA1和LmCesA2在果蠅腸道中高表達(dá)，且在果蠅腸道中的表達(dá)量分別是表皮中表達(dá)量的16.7和10.9倍(圖3)。因本課題前期研究顯示這兩個(gè)羧酸酯酶基因(LmCesA1和LmCesA2)主要在飛蝗的中腸和胃盲嚢表達(dá)。為盡可能模擬目的基因在飛蝗體內(nèi)環(huán)境，在后續(xù)研究中我們采用c601-Gal4果蠅與轉(zhuǎn)基因果蠅雜交后代。

本課題組前期研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組飛蝗相比，LmCesA1基因沉默的飛蝗對(duì)馬拉硫磷的敏感性提高30.9%。而在本研究中，與對(duì)照組果蠅(c601>attP40)相比，轉(zhuǎn)入飛蝗羧酸酯酶基因LmCesA1果蠅對(duì)馬拉硫磷的抗性沒(méi)有顯著變化(表2)。這個(gè)結(jié)果與前期研究結(jié)果存在差異，可能有兩個(gè)原因：(1)LmCesA1在轉(zhuǎn)基因果蠅中的蛋白水平較低；(2)LmCesA1對(duì)馬拉硫磷的解毒作用較弱。與對(duì)照組果蠅(c601>attP40)相比，轉(zhuǎn)入飛羧酸酯酶基因LmCesA2 果蠅對(duì)馬拉硫磷的抗性顯著升高。這可能是插入了外源羧酸酯酶基因增加了果蠅體內(nèi)目的基因拷貝數(shù)，使得羧酸酯酶活性升高，而產(chǎn)生了抗藥性。本課題組通過(guò)RNAi結(jié)合殺蟲(chóng)劑生物測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明LmCesA2 可能參與飛蝗對(duì)馬拉硫磷的代謝解毒過(guò)程(Zhangetal.,2011)。本研究轉(zhuǎn)基因果蠅對(duì)馬拉硫磷代謝解毒的研究結(jié)論與通過(guò)RNAi方法研究LmCesA2 與對(duì)馬拉硫磷的解毒關(guān)系的結(jié)論一致。據(jù)此我們推測(cè)飛蝗LmCesA2極有可能參與飛蝗對(duì)馬拉硫磷的代謝解毒。

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)飛蝗羧酸酯酶基因果蠅生物學(xué)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明飛蝗LmCesA2極有可能參與飛蝗對(duì)馬拉硫磷的代謝解毒。但該實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅具有參考意義，并不能完全認(rèn)定LmCesA1和LmCesA2基因參與飛蝗生物體內(nèi)殺蟲(chóng)劑代謝解毒過(guò)程，其原因有：(1)基因在體內(nèi)的表達(dá)水平和空間分布在黑腹果蠅和飛蝗之間存在差異；(2)在果蠅中，對(duì)照品系和抗性品系之間只有一個(gè)遺傳差異，而在飛蝗體內(nèi)可能有其他抗性基因影響靶標(biāo)基因的表達(dá)(Dabornetal.,2012)。因此，為進(jìn)一步確定該基因與農(nóng)藥代謝關(guān)系，我們可以在今后的研究中建立飛蝗超表達(dá)體系或采用靶標(biāo)基因的體外表達(dá)系統(tǒng)從多維角度全面解析基因與殺蟲(chóng)劑代謝解毒的關(guān)系。