基于UPLC-Q-TOF-MSE的百合化學(xué)成分分析

林美妤 袁志鷹 曾琪 何瑤 肖碧霞 李怡杰 杜琪 陳乃宏

〔摘要〕 目的 利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MSE）技術(shù)對(duì)百合的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。方法 液相采用Acquity超高效液相色譜，Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，流速0.4 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL;質(zhì)譜采用Xevo G2-XS型四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，電噴霧離子源正、負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)。通過分析一級(jí)質(zhì)譜精確相對(duì)分子質(zhì)量和二級(jí)質(zhì)譜裂解信息，結(jié)合對(duì)照品與文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行鑒定和推測(cè)。結(jié)果 從百合中初步鑒定了33個(gè)化合物，23個(gè)酚酸類化合物，8個(gè)甾體皂苷類化合物，2個(gè)生物堿類化合物。其中（25R）-呋甾烷-5-烯-1β，3α，22α，26-四醇-3，26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、（25R）-26-O-β-D-吡喃葡萄糖-5α-呋甾烷-3β，20α，26-三醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、（25R）-螺甾烷-5-烯-3β，17α-二醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖（1→2）-β-D-葡萄糖苷均首次在該植物中發(fā)現(xiàn)。結(jié)論 UPLC-Q-TOF/MSE技術(shù)能全面、快速地對(duì)百合化學(xué)成分進(jìn)行分析，為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制的進(jìn)一步闡明奠定了良好的基礎(chǔ)。

〔關(guān)鍵詞〕 百合;化學(xué)成分;UPLC-Q-TOF-MSE;酚酸;甾體皂苷;生物堿

〔中圖分類號(hào)〕R284.1? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.08.011

〔Abstract〕 Objective To perform qualitative analysis of the chemical constituents of Lilium broumii by UPLC-Q-TOF-MSE. Methods Acquity ultra-high performance liquid chromatography was used. Waters Acquity UPLC BEH C18 （2.1 mm × 100 mm， 1.7 μm） was used in the liquid phase. The mobile phase consisting of acetonitrile-0.1% formic acid was used for gradient elution. The volume flow rate was 0.4 mL/min， column temperature was 35 ℃， and the sample volume was 10 μL. The Xevo G2-XS quadrupole time-of-flight mass spectrometer was used to collect data by positive and negative ionization modes with electro-spray ionization source. By analyzing the accurate relative molecular mass of the first-level mass spectrometer and the information of the second-level mass spectrometry cleavage， identification and speculation were performed combined with the reference substance and literature reports. Results Totally 33 compounds including 23 phenolic acids， 8 steroidal saponins and 2 alkaloids were initially identified from Lilium broumii. Among them， （25R）-furost-5-en-1β， 3α， 22α， 26-tetrol-3， 26-di-O-β-D-Gls， （25R）-26-O-β-D-Glc-5α-furost-3β， 22α， 26-triol-3-O-α-L-Rha-（1→2）-β-D-Gls and （25R）-spirost-5-ene-3β， 17α-diol-3-O-α-L-Rha-（1→2）-β-D-Gls were firstly discovered in Lilium broumii. Conclusion UPLC-Q-TOF/MSE can analyze the chemical components of Lilium broumii comprehensively and quickly. This study lays a good foundation for the further elucidation of the pharmacodynamic material basis and quality control of Lilium broumii.

〔Keywords〕 Lilium broumii; chemical constituents; UPLC-Q-TOF/MSE

百合（Lilii Bulbus）來源于百合科多年生草本植物卷丹（Lilium lancifolium Thunb.）、百合（Lilium broumii F.E. Brown var. viridulum Baker）、細(xì)葉百合（Lilium pumilum DC.）3種的干燥肉質(zhì)鱗莖[1]，是湖南省道地大宗藥材品種之一?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明百合及其有效成分具有多種藥理活性，包括止咳祛痰、鎮(zhèn)靜催眠、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗缺氧性應(yīng)激損傷、抗抑郁、降血糖及抑菌作用等[2]。百合主要以甾體皂苷和酚酸甘油酯類化合物居多，此外還含有一些多糖類、生物堿、黃酮、氨基酸及其他烷烴等成分[3]。百合藥理作用廣泛，但具體藥效成分仍不明確，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)未闡明。另外2015版《中華人民共和國(guó)藥典》未列出含量測(cè)定的控制指標(biāo)，不能綜合全面評(píng)價(jià)其質(zhì)量，一定程度上制約了百合的市場(chǎng)化發(fā)展，因此，研究百合化學(xué)成分對(duì)闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制具有重要意義。本研究采用UPLC-Q-TOF-MSE對(duì)百合化學(xué)成分進(jìn)行全面和快速的分析，根據(jù)化學(xué)成分的質(zhì)譜信息及與對(duì)照品、相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)，鑒定其結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步研究百合化學(xué)成分及資源開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1? 主要儀器

Acquity超高效液相色譜儀、Xevo G2-XS型四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、數(shù)據(jù)采集與處理采用Mass lynx 4.1及UNIFI軟件（美國(guó)Waters公司）;Mini-Q Intergral型純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）;2K15型低溫超速離心機(jī)（德國(guó)sigma公司）;AL104型電子天平（瑞士Mettler公司）。

1.2? 試藥

色譜甲醇和乙腈購(gòu)自美國(guó)Merck公司，甲酸購(gòu)自德國(guó)CNW公司，以上均為質(zhì)譜純。對(duì)照品對(duì)羥基苯甲醛（批號(hào)：HA060208198）、對(duì)香豆酸（批號(hào)：HA062209198）購(gòu)自寶雞市盛世科技公司;綠原酸（批號(hào)：102414）、咖啡酸（批號(hào)：200335）、阿魏酸（批號(hào)：101053）購(gòu)自江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司;王百合苷A（批號(hào)：0252-DT01）購(gòu)自上海standard科技公司;王百合苷B（批號(hào)：18081001）、王百合苷C（批號(hào)：18082203）、王百合苷E（批號(hào)：18081303）均購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度均大于98%，亮氨酸-腦啡肽（批號(hào)：W07101402）購(gòu)自Waters中國(guó)有限公司。百合（批號(hào)：20170901）購(gòu)于湖南千金藥材有限公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室周小江教授鑒定為百合科植物百合（Lilium broumii F.E. Brown var. viridulum Baker）的鱗莖。

2 方法

2.1? 色譜條件

色譜條件：色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫：0～2 min，3% A;2～6 min，3%～10% A;6～9 min，10%～15% A;9～12 min，15% A;12～16 min，15%～25% A;16～18 min，25%～30% A;18～22 min，30%～40% A;22～25 min，40%～80% A;25～27 min，80%～95% A;27～30 min，95% A;30～36 min，3% A;柱溫35 ℃;流速0.4 mL/min;進(jìn)樣量10 μL。

2.2? 質(zhì)譜條件

電噴霧離子化源（ESI），正、負(fù)離子檢測(cè)模式。質(zhì)譜數(shù)據(jù)格式為Continuum，脫溶劑氣溫度為600 ℃，霧化氣流速為800 L/h，毛細(xì)管電壓2.5 kV，離子源溫度120 ℃，錐孔電壓40 V，氣簾氣流速為50 L/h，掃描范圍為m/z 100～1 200。低能量掃描時(shí)，碰撞能量transfer和trap電壓分別為4 eV和6 eV。高能量掃描時(shí)，負(fù)離子模式下transfer和trap電壓分別為10 eV和60～75 eV。用亮氨酸-腦啡肽為內(nèi)標(biāo)（Lock SprayTM）對(duì)質(zhì)量軸實(shí)時(shí)校正，流速為5 μL/min。

2.3? 樣品配制

2.3.1? 供試品溶液的配制? 百合粉碎后過80目篩（4號(hào)），取粉末0.5 g，置于50 mL錐形瓶中，精密稱定，加入50%甲醇20 mL，稱重，記錄重量，室溫下靜置1 h，超聲提取40 min，50%甲醇補(bǔ)足失重，12 000 r/min，離心10 min，過0.22 μm微孔濾膜，置于進(jìn)樣小瓶中，待測(cè)。

2.3.2? 對(duì)照品溶液的配制? 分別精密稱量各對(duì)照品，均配制成終濃度為0.5 mg/mL的對(duì)照品溶液，根據(jù)質(zhì)譜響應(yīng)稀釋到合適的濃度。

2.4? 數(shù)據(jù)處理

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[4-6]，總結(jié)了百合屬植物的化學(xué)成分，建立包括化合物名稱、分子式、精確相對(duì)分子質(zhì)量的百合化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。通過分析一級(jí)質(zhì)譜精確相對(duì)分子質(zhì)量和二級(jí)質(zhì)譜裂解信息，結(jié)合對(duì)照品與文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行鑒定和推測(cè)。

3 結(jié)果

百合樣品在正、負(fù)離子模式下的離子流圖見圖1。根據(jù)數(shù)據(jù)分析方法，共推測(cè)了33個(gè)化合物，其中包括23個(gè)酚酸類化合物，8個(gè)甾體皂苷類化合物，2個(gè)生物堿類化合物，鑒定結(jié)果見表1。

3.1? 酚酸類

酚酸類成分在ESI負(fù)離子檢測(cè)模式下均有很好的響應(yīng)。共檢測(cè)到5個(gè)單聚酚酸類化合物，分別為化合物1、2、4、7、12，通過與對(duì)照品以及文獻(xiàn)[7-8]比對(duì)，分別鑒定為對(duì)羥基苯甲醛、綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸。其中咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸在質(zhì)譜負(fù)離子檢測(cè)模式下分別給出準(zhǔn)分子離子m/z 179.034 6、m/z 163.040 2、m/z 193.050 1，結(jié)構(gòu)上均有羧基，且容易發(fā)生斷裂失去CO2，分別形成m/z 135.044 5，119.049 9，149.059 1的碎片離子。

共檢測(cè)到18個(gè)酚酸甘油酯類化合物，其中8個(gè)為酚酸甘油酯苷類。化合物5、8、14、15通過與對(duì)照品比對(duì)分別鑒定為王百合苷C、王百合苷A、王百合苷E、王百合苷B。酚酸甘油酯類的一級(jí)質(zhì)譜有較高豐度的準(zhǔn)分子離子峰，在二級(jí)質(zhì)譜圖中，易得到咖啡酸、對(duì)香豆酸和阿魏酸結(jié)構(gòu)的離子片段，所以通過分析這些離子片段能快速鑒別其他酚酸甘油酯類成分的結(jié)構(gòu)。

化合物3負(fù)譜下的m/z 179.034 6和161.022 4是咖啡酸離子峰及其掉水峰，通過與文獻(xiàn)[9]比對(duì)初步鑒定為王百合苷K?；衔?和9的m/z 163.040 2是對(duì)香豆酸離子峰，m/z 145.028 4、119.049 9分別為m/z 163.040 2掉一分子水和CO2的離子碎片峰，通過與文獻(xiàn)[9]及保留時(shí)間比對(duì)分別初步鑒定為王百合苷H和王百合苷D?；衔?6的m/z 399.128 6和381.116 1為掉乙?；霸僖环肿铀蟮乃槠澹琺/z 163.040 2是對(duì)香豆酸離子峰，通過與文獻(xiàn)[10]初步鑒定為4-乙酰王百合苷D?；衔?1的m/z 193.050 1是阿魏酸離子峰，通過與文獻(xiàn)[11]比對(duì)初步鑒定為王百合苷F。

化合物17和18的m/z 337.089 9為m/z 499.147 0碎片掉一分子葡萄糖或果糖后的碎片峰，m/z 193.050 1是阿魏酸離子峰，糖的連接位置未能確定，通過與文獻(xiàn)[12]比對(duì)初步鑒定為3，6'-O-二阿魏酰基蔗糖及其異構(gòu)體?；衔?7和28的m/z 193.050 1碎片峰是阿魏酸離子峰，m/z 163.037 6是對(duì)香豆酸離子峰，對(duì)香豆酸連接位置未能確定，通過與文獻(xiàn)[13-14]比對(duì)分別初步鑒定為1-O-阿魏酰-2-O-對(duì)香豆酰甘油酯或1-O-阿魏酰-3-O-對(duì)香豆酰甘油酯?；衔?9和30，有明顯高的m/z 193.050 1阿魏酸離子峰，推測(cè)含兩分子阿魏酸，而兩分子阿魏酸連接位置未能確定，通過與文獻(xiàn)[13，15]及保留時(shí)間比對(duì)初步鑒定分別為1，2-O-二阿魏酰甘油酯和1，3-O-二阿魏酰甘油酯。

3.2? 甾體皂苷類

甾體皂苷類化合物在ESI負(fù)離子檢測(cè)模式下，一般出現(xiàn)[M+HCOO]+、[M-H]+和部分糖基丟失的碎片信息，提供的結(jié)構(gòu)信息不夠充分。ESI正離子檢測(cè)模式下，一般可獲得[M+Na]+、[M+H]+和糖鏈連續(xù)斷裂糖基的碎片以及苷元的裂解信息，因此將二者相互結(jié)合能很好的對(duì)甾體皂苷類化合物進(jìn)行鑒定。m/z 271和253是判斷甾體皂苷骨架的特征離子，另外苷元結(jié)構(gòu)易產(chǎn)生特征性的144 Da中性碎片，結(jié)構(gòu)類型不同特征離子及碎片稍有差異[16-17]，這些信息將有助于不同甾體結(jié)構(gòu)類型的解析。從百合中共鑒定了8個(gè)甾體皂苷類化合物，包括3個(gè)呋甾烷型和5個(gè)螺甾烷型。

化合物19在負(fù)譜出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子峰817.424 1[M+HCOO]+，離子峰771.409 6[M-H]+，正譜準(zhǔn)分子離子峰795.409 6[M+Na]+，正譜一級(jí)譜圖中未見[M+H]+峰，可見強(qiáng)的[M-H2O+H]+峰。呋甾烷醇型皂苷因C-22位羥基性質(zhì)活潑易丟失，在正離子檢測(cè)模式下多出現(xiàn)[M+Na]+和[M-H2O+H]+的信號(hào)，而不出現(xiàn)[M+H]+峰，螺甾烷醇型皂苷上有其它羥基取代時(shí)在正離子檢測(cè)模式下會(huì)同時(shí)出現(xiàn)[M+H]+和[M-H2O+H]+峰，在季碳上有羥基時(shí)脫水峰會(huì)更為明顯[18-19]。因未見[M+H]+峰將其推測(cè)為C-22位連有羥基的呋甾烷醇型皂苷。m/z 755.416 8、593.366 4分別為化合物19脫一分子水及一分子葡萄糖的碎片峰，m/z 449.254 8、431.314 5分別為m/z 593.37中性丟失144 Da和一分子葡萄糖的碎片峰，再分別繼續(xù)斷裂一分子葡萄糖和中性丟失144 Da后得到m/z 287.201 9片段，推測(cè)苷元部分有羥基取代，m/z 269.192 4、251.178 6為繼續(xù)脫水的碎片峰。通過參照文獻(xiàn)[20]初步鑒定為（25R）-呋甾烷-5-烯-1β，3α，22α，26-四醇-3，26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷或其同分異構(gòu)體，裂解途徑見圖2。

另兩個(gè)呋喃型甾體化合物為24和25。化合物24在負(fù)譜出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子峰947.492 7[M+HCOO]+，離子峰901.482 8[M-H]+，正譜準(zhǔn)分子離子峰m/z 925.475 5[M+Na]+，正譜一級(jí)譜圖中未見[M+H]+峰，可見強(qiáng)的[M-H2O+H]+峰，二級(jí)質(zhì)譜中m/z 723.427 7為化合物掉一分子水及一分子葡萄糖后的碎片峰，m/z 579.316 0為m/z 723.427 7中性丟失C8H16O2后的碎片峰，m/z 415.318 5為m/z 723.427 7掉一分子葡萄糖和一分子鼠李糖的碎片峰，m/z 271.203 6是接著中性丟失C8H16O2后的碎片峰，通過參照文獻(xiàn)[21]初步鑒定為（25R）-26-O-β-D-吡喃葡萄糖-呋甾烷-5-烯-3β，20α，26-三醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷?；衔?5在負(fù)譜出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子峰949.498 7[M+HCOO]+，離子峰903.494 8[M-H]+，正譜一級(jí)譜圖中未見[M+H]+峰，可見強(qiáng)的[M-H2O+H]+峰，二級(jí)質(zhì)譜圖中所有碎片離子峰均比化合物24多2 Da，推測(cè)為母核上5，6位沒有雙鍵，通過參考文獻(xiàn)[22]初步鑒定為（25R）-26-O-β-D-吡喃葡萄糖-5α-呋甾烷-3β，20α，26-三醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物22在負(fù)譜出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子峰945.482 7[M+HCOO]+，離子峰899.460 8[M-H]+，正譜準(zhǔn)分子離子峰m/z 923.459 9[M+Na]+，正譜一級(jí)譜圖中有[M-H2O+H]+峰及較弱的[M+H]+，二級(jí)譜中有m/z 287.201 9，269.192 4，251.181 9碎片信息，推測(cè)苷元部分有羥基取代[23]。通過參照文獻(xiàn)[18，24]初步鑒定為（25R）-螺甾烷-5-烯-3β，12α-二醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-（1→2）-[β-D-吡喃葡萄糖-（1→4）]-β-D-吡喃葡萄糖苷或重樓皂苷D?；衔?3在負(fù)譜出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子峰947.492 7[M+HCOO]+，離子峰901.476 6[M-H]+，正譜準(zhǔn)分子離子峰m/z 925.477 3[M+Na]+，正譜一級(jí)譜圖中有[M-H2O+H]+峰及較弱的[M+H]+，二級(jí)質(zhì)譜圖中所有碎片峰均比化合物22多2 Da，推測(cè)為母核上5，6位沒有雙鍵，通過參照文獻(xiàn)[24]初步鑒定為（25R）-5α-螺甾烷-3β，12α-二醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-（1→2）-[β-D-吡喃葡萄糖-（1→4）]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物31在負(fù)譜出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子峰929.473 3[M+HCOO]+，離子峰883.470 0[M-H]+，正譜出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z 907.466 7[M+Na]+，正譜一級(jí)譜圖中未見[M-H2O+H]+峰?；衔?3在負(fù)譜出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子峰959.483 4[M+HCOO]+，離子峰913.482 9[M-H]+，正譜準(zhǔn)分子離子峰m/z 937.477 3[M+Na]+，正譜一級(jí)譜圖中有[M-OCH3+H]+及[M+H]+峰，化合物33比31多一個(gè)OCH3，二級(jí)譜圖顯示兩者碎片峰裂解規(guī)律相似，通過與自建數(shù)據(jù)庫比對(duì)分別初步鑒定為（25R）-螺甾烷-5-烯-3-β-O-α-L-吡喃鼠李糖-（1→2）-[β-D-吡喃葡萄糖-（1→6）]-β-D-吡喃葡萄糖苷和（25R， 26R）-26-甲氧基螺甾烷-5-烯-3-β-O-α-L-吡喃鼠李糖-（1→2）-[β-D-吡喃葡萄糖-（1→6）]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

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（本文編輯? 蘇? 維）