里氏木霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的研究

顧斌濤 熊大維

摘要 [目的]探討利用稻草秸稈作為碳源固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的條件。[方法]以堿預(yù)處理的稻草秸稈作為碳源，確定里氏木霉固態(tài)發(fā)酵的優(yōu)化條件，使用發(fā)酵生產(chǎn)的酶制劑對(duì)稻草進(jìn)行酶解反應(yīng)。[結(jié)果]在采用酵母提取物作為氮源、固液比1.0∶2.0（g∶mL）、溫度28 ℃、初始pH 5.5、吐溫-80濃度為0.2%和發(fā)酵時(shí)間為96 h時(shí)，菌株固態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)酶條件最優(yōu)。在此發(fā)酵工藝條件下，β-葡萄糖苷酶活力為8.9 U/mL。利用試驗(yàn)所產(chǎn)酶制劑對(duì)稻草進(jìn)行水解，酶解得率為68.2%。[結(jié)論]該研究為里氏木霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶和酶解稻草的應(yīng)用提供了一定的依據(jù)。

關(guān)鍵詞 β-葡萄糖苷酶;固態(tài)發(fā)酵;里氏木霉;稻草酶解

Abstract [Objective]To study ?the conditions of βglucosidase production by solidstate fermentation using rice straw as carbon source.[Method]The alkalipretreated rice straw was used as the carbon source， the optimal conditions for solid state fermentation of Trichoderma reesei were determined， the enzyme preparation produced by fermentation was used for enzymatic hydrolysis of rice straw.[Result]The optimal conditions were as follows： yeast extract was used as the nitrogen source， solidliquid ratio was 1.0∶2.0（g∶mL）， temperature was 28 ℃， initial pH was 5.5， Tween 80 concentration was 0.2% and fermentation time was 96 h. Under those fermentation condition， βglucosidase activity was 8.9 U/mL. The enzyme produced by the experiment was used to hydrolyze the rice straw， and the enzymatic hydrolysis yield was 68.2%.[Conclusion]The study provided a certain basis of application of solid state fermentation for βglucosidase production by T. reesei and enzymatic hydrolysis of rice straw.

Key words βglucosidase;Solid state fermentation;Trichoderma reesei;Enzymatic hydrolysis of rice straw

β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）是能夠特異性地催化低聚糖、芳香基和烴基末端非還原性β-D-葡萄糖苷鍵的水解，從而釋放β-D-葡萄糖和相應(yīng)配基的糖苷水解酶類的總稱。β-葡萄糖苷酶最早從苦杏仁汁中被發(fā)現(xiàn)，并能催化水解龍膽二糖和纖維二糖，故別名苦杏仁苷酶、龍膽二糖酶和纖維二糖酶。β-葡萄糖苷酶廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物體內(nèi)，對(duì)維持生物的生理功能起重要作用[1-3]。在纖維素降解過程中，β-葡萄糖苷酶作為纖維素酶系中的重要組成成分，能夠水解纖維寡糖中末端非還原性的β-D-葡萄糖鍵，最終與內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶一起將纖維素水解為葡萄糖[4-6]。

纖維素是世界上最豐富的可再生有機(jī)資源，其年產(chǎn)量高達(dá)千億噸以上。將稻草、玉米秸稈、玉米芯、麥稈和棉花稈等含纖維素的各類農(nóng)林副產(chǎn)物進(jìn)行降解利用，進(jìn)而發(fā)酵生產(chǎn)各類生物化工品，這對(duì)于農(nóng)林資源的利用和環(huán)境保護(hù)具有重大的意義[7-8]。該研究以稻草秸稈為發(fā)酵碳源，用固態(tài)發(fā)酵法對(duì)里氏木霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行發(fā)酵條件的研究，并利用所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶對(duì)稻草秸稈進(jìn)行水解糖化，從而為稻草秸稈的高效轉(zhuǎn)化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：里氏木霉H7為實(shí)驗(yàn)室保存。

稻草采自浙江省嘉興市嘉善縣，烘干后密封冷藏保存?；瘜W(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

PDA培養(yǎng)基：稱取PDA干粉（英國(guó)Oxoid公司CM0139）39 g，加入 1 L去離子水，攪拌至樣品分散，高壓蒸汽滅菌后傾注平板。

固態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，稻草8 g，酵母提取物1.5 g，（NH4）2SO4 0.25 g，MgSO4 0.05 g，CaCl2 0.03 g，KH2PO4 0.25 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2 mg，MnSO4·H2O 0.1 mg，ZnSO4·7H2O 0.1 mg，CoCl2·6H2O 0.2 mg。其中稻草經(jīng)過堿預(yù)處理。

1.2 方法

1.2.1 稻草預(yù)處理。稻草秸稈剪至2 cm左右，與2%氫氧化鈉溶液混合，常壓37 ℃放置處理24 h，再高壓105 ℃條件下反應(yīng)50 min。反應(yīng)完后用自來水反復(fù)沖洗，再用蒸餾水沖洗3次，烘干后密封冷藏保存。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵。在PDA平板上培養(yǎng)里氏木霉120 h，用生理鹽水洗下孢子，離心去上清，用無(wú)菌水調(diào)節(jié)孢子濃度至108個(gè)/mL，取2 mL孢子液接入固態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基，每24 h翻動(dòng)一次，調(diào)整固態(tài)發(fā)酵的條件（氮源、固液比、溫度、初始pH、吐溫-80濃度和發(fā)酵時(shí)間）。

1.2.3 粗酶液的制備。將發(fā)酵得到的固態(tài)酶制劑2 g加入到100 mL無(wú)菌生理鹽水中，振蕩提取30 min，離心收集上清液即為粗酶液。

1.2.4 酶活測(cè)定。β-葡萄糖苷酶活（BGA）：用纖維二糖溶液與酶液在50 ℃水浴反應(yīng)30 min后，葡萄糖氧化酶法測(cè)葡萄糖。1 g固體酶（或1 mL酶液）1 h水解底物纖維二糖，產(chǎn)生出1.0 mg葡萄糖所需的酶量，為1個(gè)β-葡萄糖苷酶活力單位，用U/g（或U/mL）表示。

濾紙酶活力（FPA）：取1 cm×6 cm 濾紙（Whatman No.1）與酶液在50 ℃水浴反應(yīng)30 min后，DNS法測(cè)還原糖。1 h產(chǎn)1.0 mg還原糖所需的酶量為1個(gè)濾紙酶活單位，用U/g（或U/mL）表示。

1.2.5 稻草酶解試驗(yàn)。取1 g堿處理后的稻草殘?jiān)?，加入pH 4.8檸檬酸緩沖液配制的纖維素酶液，放入恒溫水浴振蕩器，在50 ℃、100 r/min的條件下反應(yīng)50 h，通過DNS法測(cè)定酶解反應(yīng)液中的還原糖。纖維素酶用酶量分別為100、200和300 U（FPA）的酶液。酶解得率=還原糖總量（g）×0.9×100%/0.658 g，其中 0.658 g為每克底物中纖維素和半纖維素的質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮源對(duì)里氏木霉產(chǎn)酶的影響

氮源的主要作用為合成菌體物質(zhì)和含氮代謝物。分別采用玉米漿粉、酵母提取物、蛋白胨、黃豆餅粉、硝酸鈉和硫酸銨作為氮源，試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌體對(duì)有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源都能夠利用，但利用有機(jī)氮源的效果好于無(wú)機(jī)氮源，其中以酵母提取物發(fā)酵酶活最高。因此，選擇酵母提取物作為氮源。

2.2 固液比對(duì)里氏木霉產(chǎn)酶的影響

改變培養(yǎng)基的固液比進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，其結(jié)果如圖2所示。固液比對(duì)木霉產(chǎn)酶的影響是顯著的，在一定范圍內(nèi)，隨固液比的增加，發(fā)酵酶活表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢(shì)。固液比過高時(shí)，由于菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶所需的水分太少，影響了酶的產(chǎn)生;固液比過低時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度降低和透氣性下降影響了菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。當(dāng)固液比為1.0∶2.0（g∶mL）時(shí)，里氏木霉所產(chǎn)酶活力最高，因此后續(xù)試驗(yàn)采用固液比為1.0∶2.0。

2.3 溫度對(duì)里氏木霉產(chǎn)酶的影響

最適溫度范圍內(nèi)，菌體生長(zhǎng)速率隨著溫度的上升而增加;當(dāng)超過最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，菌體生長(zhǎng)速率隨著溫度的上升而急劇下降。發(fā)酵溫度影響里氏木霉菌體的生長(zhǎng)和酶的合成。采用22、24、26、28、30和32 ℃ 進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示（圖3）當(dāng)發(fā)酵溫度為28 ℃時(shí)里氏木霉所產(chǎn)酶活力最高，因此后續(xù)試驗(yàn)采用發(fā)酵溫度為28 ℃。

2.4 初始pH對(duì)里氏木霉產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基的初始pH對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成有很大的影響，一方面通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的通透性和酶的活性影響菌體的新陳代謝，另一方面也影響培養(yǎng)基組分的解離，進(jìn)而影響菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收。采用不同的初始pH進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果顯示（圖4）當(dāng)初始pH為5.5 時(shí)里氏木霉所產(chǎn)酶活力最高，因此后續(xù)試驗(yàn)采用初始pH為5.5。

2.5 吐溫-80對(duì)里氏木霉產(chǎn)酶的影響

表面活性劑能夠提高微生物細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)酶的外分泌和細(xì)胞外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，添加適量的表面活性劑能夠提高酶活力。采用不同濃度的吐溫-80進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果顯示（圖5）當(dāng)吐溫-80濃度為0.2%時(shí)里氏木霉所產(chǎn)酶活力最高，高于0.2%的吐溫-80對(duì)木霉產(chǎn)酶有抑制作用，因此后續(xù)試驗(yàn)采用吐溫-80濃度為0.2%。

2.6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)里氏木霉產(chǎn)酶的影響

將里氏木霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶，每24 h取樣測(cè)酶活，結(jié)果如圖6所示。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)24 h后見少量白色菌絲，前24 h 酶活上升比較緩慢，48 h后酶活上升較快，到發(fā)酵96 h時(shí)β-葡萄糖苷酶活最高（8.9 U/mL），在96 h后能見到綠色孢子，說明培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)已經(jīng)基本耗盡，菌種進(jìn)入了產(chǎn)孢期，此后酶活則開始下降。

2.7 酶解試驗(yàn)

以稻草纖維殘?jiān)鼮樵?，采用里氏木霉H7的纖維素酶和商品纖維素酶進(jìn)行水解糖化，結(jié)果表明（表1）使用該試驗(yàn)固態(tài)發(fā)酵的酶制劑來水解稻草纖維殘?jiān)拿附獾寐士蛇_(dá)68.2%，水解稻草纖維殘?jiān)男Ч橛?種商品酶制劑之間，與商品酶對(duì)比，該酶有一定的競(jìng)爭(zhēng)力。

3 結(jié)論

里氏木霉是目前工業(yè)上重要的產(chǎn)酶菌種，能分泌組分較全的木質(zhì)纖維素酶系[9-12]。稻草秸稈資源在我國(guó)極其豐富，價(jià)格低廉，成分主要為纖維素和半纖維素，利用堿預(yù)處理后的稻草作為發(fā)酵碳源能夠降低原料成本[13-14]。該研究發(fā)現(xiàn)，以堿預(yù)處理的稻草作為碳源，利用里氏木霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的優(yōu)化條件是：適宜的氮源為酵母提取物，固液比為1.0∶2.0（g∶mL），發(fā)酵溫度為28 ℃，初始pH為5.5，吐溫-80 濃度為0.2%，適合的發(fā)酵時(shí)間是96 h。在此發(fā)酵工藝條件下，β-葡萄糖苷酶活力為8.9 U/mL。利用試驗(yàn)所產(chǎn)酶制劑對(duì)稻草進(jìn)行水解，酶解得率為68.2%。

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