中藥紅背桂總黃酮的提取工藝研究

韓倩 魏江存 陳勇 陸景榮 李金洲 陳子雋

摘要：采用回流提取法提取紅背桂（Excoecaria cochinchinensis Lour.）總黃酮，通過單因素試驗，考察提取方法、提取溶劑體積分數、提取體積、提取時間對其藥材總黃酮提取率的影響，采用正交試驗優(yōu)化提取工藝條件，篩選出紅背桂總黃酮的最佳提取工藝。結果表明，紅背桂總黃酮的最佳提取工藝為70%乙醇、料液比1∶40（g∶mL）、回流提取時間1.0 h。該方法能有效測定紅背桂藥材總黃酮含量，重復性較好、方法穩(wěn)定、可行。

關鍵詞：紅背桂（Excoecaria cochinchinensis Lour.）;總黃酮;提取工藝

中圖分類號：R282? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）14-0145-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.14.029 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract：The total flavonoids of Excoecaria cochinchinensis Lour. were extracted by reflux extraction method. The effects of extraction method， extraction solvent volume fraction， extraction volume and extraction time on the total flavonoid extraction rate of the medicinal materials were investigated by single factor experiment. The orthogonal test was used to optimize the extraction conditions. The best extraction process for a total flavonoid of Excoecaria cochinchinensis Lour. was screened out. The result showed that the optimal extraction process of a total flavonoid of Excoecaria cochinchinensis Lour. was 70% methanol， the ratio of material to liquid was 1∶40（g∶mL）， and the reflux extraction time was 1.0 h. This method can effectively determine the content of total flavonoids in Excoecaria cochinchinensis Lour. The repeatability was good， the method was stable and feasible.

Key words： Excoecaria cochinchinensis Lour.; total flavonoids; extraction process

中藥紅背桂的藥材基源來自大戟科海漆屬植物紅背桂花（Excoecaria cochinchinensis Lour.）的全株，該植物首載于《云南藥用植物名錄》[1]，其別名有天青地紅、葉背紅、金鎖玉等。紅背桂花是常綠灌木，株高可達1～2 m，光滑無毛，腹面綠色，背面為紫紅色或血紅色[2]，因其花似普通桂花，故有其名[3]。該藥有祛風濕、通經絡、活血止痛的功能，用于治療腮腺炎、扁挑體炎、心絞痛等病癥[4]，越南民間用來治療尿路痛[5]。紅背桂作為藥用和觀賞植物在廣西、廣東、云南和臺灣等地均有栽培，廣西龍州有野生種。李子燕等[6]研究了紅背桂花的化學成分，分離得到6個黃酮苷類化合物，黃酮苷可以起到止痛作用。紅背桂還含有沒食子酸、熊果酸、山柰酚以及二萜類等成分[7-10]。

黃酮類化合物是一類存在于多種植物中的酚類化合物[11]，大部分黃酮類化合物的母核均為2-苯基色原酮，具有抗炎、抗菌作用。總黃酮類化學成分可以抑制血清白細胞介素（IL-1β）和腫瘤壞死因子（TNF-α）等炎癥因子的分泌[12]。目前，對中藥紅背桂的總黃酮提取鮮見報道，本研究對紅背桂總黃酮進行提取工藝研究，為后續(xù)對紅背桂總黃酮的藥理活性和作用機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

島津UV1780型紫外-可見分光光度計;十萬分之一天平（XS105D，梅特勒-托利多稱重設備系統有限公司）;KQ5200B超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）;SQP電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司];優(yōu)普ULUPURE實驗室超純水儀（上海優(yōu)普實業(yè)有限公司）;HWS-26電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司）。

1.2 試驗藥劑

蘆?。ㄅ枺?95128），純度>98%，購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司;其余試劑均為分析純。藥材采摘于廣西賀州市，經廣西中醫(yī)藥大學教授陳勇鑒定為大戟科植物紅背桂的全株，經55 ℃烘干，備用。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥恒重的蘆丁對照品適量，加70%甲醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，搖勻，制成濃度為0.46 mg/mL的對照品溶液。

1.3.2 檢測波長的選擇 精密量取上述對照品溶液3 mL置于25 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液? ? 1 mL，搖勻，靜置6 min加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，再加4%氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置10 min，以相應試劑作空白，采用分光光度法在400～800 nm測定吸收度，其最大吸收波長為512 nm（圖1）。

1.3.3 供試品溶液制備 取紅背桂藥材粉末精密稱定1.0 g，置于錐形瓶中，加入體積分數為70%的乙醇25 mL稱定重量，回流提取1.0 h，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取過濾液2.0 mL置于50 mL量瓶中，采用分光光度法在波長512 nm處測定其吸光度，用回歸方程求出供試品溶液中總黃酮的含量。

1.3.4 線性方程的制定 分別取“1.3.1”的對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL置于25 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉0.4 mL，放置6 min后，加10%硝酸鋁0.4 mL，放置6 min，再加4%的氫氧化鈉4 mL，加水至刻度，搖勻，放置10 min，然后在512 nm處測定吸光度，并得到線性方程，方程為y= 13.048x-0.040 2，R2=0.999 3，在0.009 2～0.073 6 mg/mL的范圍內，樣品濃度與吸光度有良好的線性關系。

1.4 方法學考察

1.4.1 精密度試驗 精密稱取紅背桂藥材粉末? ?1.0 g，按“1.3.3”的方法步驟制備供試品，于512 nm波長處連續(xù)6次測定其吸光度，結果RSD為0.58%，小于3.00%，該方法精密度良好。

1.4.2 穩(wěn)定性試驗 精密稱取紅背桂藥材粉末? ?1.0 g，按“1.3.3”的方法步驟制備供試品，于512 nm波長處測定同一供試液在不同時間下的吸光度，分別在0、10、20、30、40、50、60 min時測定，計算藥材的RSD為2.16%，小于3.00%，結果表明，供試樣品在60 min內基本穩(wěn)定。

1.4.3 重復性試驗 精密稱取紅背桂藥材粉末樣品6份，每份藥材粉末1.0 g，按“1.3.3”的操作步驟制備供試品。于512 nm波長處平行測定其吸光度，計算紅背桂藥材的平均含量為21.64 mg/g;RSD為2.57%，小于3.00%，表明該方法重復性良好。

1.4.4 加樣回收率試驗 精密稱取同一批次已知總黃酮含量的紅背桂藥材粉末（含量為21.64 mg/g）0.5 g，共9份，分成3組，即低、中、高加樣組（0.5 g藥材，總黃酮含量分別為80%、100%和120%加樣，精密加入蘆丁對照品，加樣量分別為8.656、10.820、12.984 mg），按“1.3.3”的方法制備供試品，于512 nm波長處平行測定其吸光度，計算總黃酮含量。由表1可知，紅背桂低、中、高加樣組的總黃酮平均回收率分別為99.67%、99.28%、99.76%，RSD分別為2.84%、1.99%、2.29%（n=3），表明該方法準確性良好。

1.5 正交試驗設計

從中藥紅背桂中提取藥材總黃酮的方法主要有有機溶劑提取法。根據查閱的相關文獻[12-16]，采取不同體積分數乙醇為溶劑的提取方法，根據單因素考察結果分析，設置乙醇體積分數（50%、70%、85%）、料液比（1∶30、1∶40、1∶50，g∶mL，下同）、提取時間（1.0、1.5、2.0 h）3個條件，選用L9（34）正交試驗設計（表2）。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取方法 取紅背桂藥材粉末1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，提取時間60 min，以30 mL、70%乙醇為提取條件，分別采用浸漬法、超聲提取法和回流提取法對樣品進行總黃酮提取，按“1.3.3”的方法制備供試樣品，在512 nm處顯色測定，結果（圖2）顯示，采用回流提取法的總黃酮提取率最高，故而選擇回流提取法。

2.1.2 乙醇溶劑體積分數 取紅背桂藥材粉末1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，采用回流提取法，以30 mL不同體積分數乙醇溶劑為提取條件，設置乙醇體積分數為30%、50%、60%、70%、80%和100%，提取時間60 min，考察不同體積分數乙醇溶劑對紅背桂總黃酮提取率的影響，結果（圖3）顯示，70%乙醇回流提取紅背桂藥材葉片總黃酮，提取率最高。

2.1.3 提取時間 取紅背桂藥材粉末1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，以30 mL 70%乙醇為提取條件，采用回流提取法，分析不同提取時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h對紅背桂藥材總黃酮提取率的影響，結果（圖4）顯示，提取時間為1.5 h時，總黃酮提取率最高。

2.1.4 提取體積 取紅背桂藥材粉末1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，以提取時間1.0 h、70%乙醇為提取條件，采用回流提取法分析不同體積70%乙醇對紅背桂藥材總黃酮提取率的影響，設置提取體積分別為20、30、40、50、60、70 mL，結果（圖5）顯示，提取體積為50 mL的提取率最高。

2.2 正交試驗結果

2.2.1 正交試驗 正交試驗結果（表3）表明，乙醇體積分數和料液比對紅背桂總黃酮的提取工藝有較大影響，而提取時間對紅背桂總黃酮含量影響較小;方差分析結果（表4）表明，乙醇體積分數和料液比2個因素對紅背桂總黃酮含量具有顯著影響，而提取時間無顯著影響，且影響的大小順序為料液比（B）>乙醇體積分數（A）>提取時間（C），所以對紅背桂總黃酮提取效果有統計學意義的因素是乙醇體積分數和料液比，而提取時間沒有顯著性意義，考慮試驗的效率、時間以及成本，故而選擇提取時間為1.0 h，紅背桂總黃酮的最適宜提取方案是A2B2C1，即乙醇體積分數是70%，料液比是1∶40，回流提取時間是1.0 h，此時提取效果最佳。

2.2.2 樣品含量測定 精密稱取紅背桂藥材粉末3份，每份1.0 g，置于錐形瓶中，測定其總黃酮含量，結果表明，3份藥材總黃酮含量分別為22.15、21.82、22.27 mg/g，平均含量為22.08 mg/g，RSD為1.06%。

3 小結

以紅背桂藥材為研究對象，采用回流提取法，考察了乙醇體積分數、提取體積和提取時間3個影響因素對紅背桂總黃酮提取率的影響，利用正交試驗的方法來優(yōu)選紅背桂總黃酮的最佳提取工藝。確定影響紅背桂總黃酮提取工藝的主要因素是溶劑體積分數、提取體積和提取時間，采用L9（34）正交試驗進行分析，試驗結果表明，紅背桂的最佳提取工藝為回流提取，乙醇體積分數70%，料液比1∶40，提取時間1.0 h，在此提取條件下效果最佳。

在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗建立了紅背桂總黃酮提取率的工藝優(yōu)化。方差分析具有顯著性，各因素對總黃酮提取率影響大小依次為料液比（B）>乙醇體積分數（A）>提取時間（C）。

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