Tim-3/Galectin-9通路、Foxp3在口腔扁平苔蘚患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及意義

王冬平　羅亮　劉莉　王珣　蔡揚(yáng)

[摘要] 目的 探討Foxp3與T細(xì)胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白-3（Tim-3）、半乳糖凝集素-9（Gal-9）的相關(guān)性及Tim-3/Gal-9通路在口腔扁平苔蘚（OLP）發(fā)病機(jī)制中的意義。 方法 選擇2015年9月—2016年9月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔黏膜病?？崎T診收治的OLP患者58例為OLP組（非糜爛型36例，充血糜爛型22例），選擇貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院同期收治的17名健康人為正常組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)兩組Tim-3、Gal-9、Foxp3 mRNA在外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)水平，并分析三種因子相關(guān)性。 結(jié)果 Tim-3 mRNA和Foxp3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在非糜爛型及充血糜爛型OLP患者中均比正常組高（P < 0.05）;Gal-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在各型OLP中與正常組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;Foxp3與Tim-3、Gal-9均呈正相關(guān)（r = 0.738，P = 0.000;r = 0.443，P = 0.010）;Tim-3與Gal-9呈正相關(guān)（r = 0.453，P = 0.018）。 結(jié)論 Tim-3/Gal-9信號(hào)通路介導(dǎo)的Th1細(xì)胞凋亡可能是OLP誘導(dǎo)Th2免疫偏移的機(jī)制之一，可能參與了OLP細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)。

[關(guān)鍵詞] 口腔扁平苔蘚;T細(xì)胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白-3;半乳糖凝集素-9;Foxp3;實(shí)時(shí)熒光定量PCR

[中圖分類號(hào)] R781.5 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2020）08（c）-0004-04

The expression and significance of Tim-3/Galectin-9 pathway and Foxp3 in the peripheral blood mononuclear cells of oral lichen planus patients

WANG Dongping1 ? LUO Liang2 ? LIU Li3 ? WANG Xun2 ? CAI Yang2

1.Department of Stomatology， Dalian Friendship Hospital， Liaoning Province， Dalian ? 116011， China; 2.Department of Periodontal Mucosa， Stomatological Hospital of Guizhou Medical University， Guizhou Province， Guiyang ? 550004， China; 3.Department of Oral Medicine， Guizhou Provincial People′s Hospital， Guizhou Province， Guiyang ? 550002， China

[Abstract] Objective To study the correlation between Foxp3 and T cell immunoglobulin domain mucin domain protein-3 （Tim-3） and Galactosin -9 （Gal-9） in order to discover the role of Tim-3/Gal-9 pathway in the pathogenesis of oral lichen planus （OLP）. Methods From September 2015 to September 2016， 58 OLP patients admitted to the specialized Outpatient Department of Oral Mucosal Disease of the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University were selected as the OLP group （36 cases of non-erosive type and 22 cases of hyperemia type）. And 17 healthy subjects admitted to the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University during the same period were selected as the normal group. The expression levels of Tim-3， Gal-9 and Foxp3 mRNA in peripheral blood mononuclear cells of the two groups were measured by real-time quantitative polymerase chain reaction， and the correlation of the three factors was analyzed. Results The relative expression levels of Tim-3 mRNA and Foxp3 mRNA in non-erosive OLP and hyperemic OLP were higher than those in the normal group （P < 0.05）. The relative expression levels of Gal-9 mRNA in all OLP types were not significantly different from those in the normal group （P > 0.05）. Foxp3 was positively correlated with Tim-3 and Gal-9 （r = 0.738， P = 0.000; r = 0.443， P = 0.010）; there was a positive correlation between Tim-3 and Gal-9 （r = 0.453， P = 0.018）. Conclusion Tim-3/Gal-9 signaling mediated Th1 cell apoptosis may be one of the mechanisms by which OLP induces Th2 immune migration， and may be involved in the immune regulation of OLP cells.

[Key words] Oral lichen planus; T cell immunoglobulin domain mucin domain protein-3; Galectin-9; Foxp3; Real time polymerase chain reaction

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是口腔黏膜病中常見的慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前，研究認(rèn)為OLP是T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病[1]，其中CD4+T淋巴細(xì)胞中的輔助性T細(xì)胞（T helper cell，Th）1和Th2兩個(gè)亞群之間的失衡可能參與了OLP的發(fā)病[2]。也有研究[3]表明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能通過導(dǎo)致扁平苔蘚患者免疫功能紊亂參與了扁平苔蘚的發(fā)生。T細(xì)胞免疫球蛋白與黏蛋白域基因（T cell immunoglobin domain and mucin domain protein，Tim）家族因其特殊的結(jié)構(gòu)和表達(dá)特性，成為Th1/Th2細(xì)胞特異性的表面標(biāo)志之一，參與了T細(xì)胞分化和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。本研究通過檢測(cè)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的58例OLP患者Tim-3、半乳糖凝集素-9（galectin-9，Gal-9）、Foxp3 mRNA在外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中的表達(dá)水平，分析Foxp3與Tim-3、Gal-9表達(dá)的相關(guān)性，探討Tim-3/Gal-9通路在OLP免疫發(fā)病機(jī)制中的作用及意義，為臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

Gene Quant100核酸蛋白分析儀;美國Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀;淋巴細(xì)胞分離液、Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（047A）、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司。上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成引物。

1.2 研究對(duì)象

選擇2015年9月—2016年9月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔黏膜病專科門診收治的OLP患者58例作為研究對(duì)象，設(shè)為OLP組，其中非糜爛型36例，男15例，女21例;年齡29～72歲，平均（46.0±14.9）歲。充血糜爛型22例，男11例，女11例;年齡12～76歲，平均（48.0±18.1）歲。同時(shí)選擇于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院同期體檢中心體檢的17名健康人員作為正常組，男8名，女9名;年齡18～78歲，平均（46.5±17.8）歲。兩組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①局部或全身均未使用過調(diào)節(jié)免疫、抗生素等相關(guān)制劑;②經(jīng)病理確診;③知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)期或孕期婦女;②口腔檢查有炎癥及患有其他口腔黏膜病或腫瘤等;③伴皮膚損傷;④合并系統(tǒng)性疾病。本研究已通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)。

1.4 方法

抽取兩組空腹靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。采用淋巴細(xì)胞分離液經(jīng)Ficoll密度梯度離心法分離PMBCs，Trizol試劑提取總RNA，通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)分離的總RNA的吸光度值（OD）為1.8～2.0，分別測(cè)量各標(biāo)本的總RNA濃度并計(jì)算所需RNA體積。采用Rt-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA，采用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，按操作說明檢測(cè)Foxp3、Tim-3、Gal-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，30 s;變性95℃，5 s;退火及延伸6℃，30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用2-△Ct法分析各目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)定量，△Ct = Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），OLP組較正常組增高或降低的倍數(shù)=2-△Ct（OLP組25%～75%均值）/2-△Ct（正常組25%～75%均值）。引物序列見表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料為非正態(tài)分布資料用中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，各組間比較采用Kruskal-Wallace檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。相關(guān)性用Spearman分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Tim-3、Gal-9、Foxp3 mRNA的表達(dá)水平

OLP組患者Tim-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z = 3.303，P = 0.001），上調(diào)倍數(shù)約為2024倍。OLP組患者中，非糜爛型OLP患者Tim-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較正常組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z = 3.201，P = 0.001），上調(diào)倍數(shù)約為2594倍;OLP組中，充血糜爛型患者中Tim-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較正常組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z = 2.634，P = 0.008），上調(diào)倍數(shù)約為1090倍。OLP患者外周血中Gal-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較正常組增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。OLP組Foxp3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z = 3.252，P = 0.001），上調(diào)倍數(shù)約為34倍。OLP組患者中，非糜爛型Foxp3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較正常組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z = 3.301，P = 0.001），上調(diào)倍數(shù)約為46倍;充血糜爛型OLP患者Foxp3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z = 2.455，P = 0.014），上調(diào)倍數(shù)約為20倍。見表2。

2.2 OLP患者外周血中Tim-3、Gal-9、Foxp3相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示：OLP患者外周血中Foxp3的表達(dá)與Tim-3、Gal-9均呈正相關(guān)（r = 0.738，P = 0.000;r = 0.443，P = 0.010）;Tim-3與Gal-9呈正相關(guān)（r = 0.453，P = 0.018）。

3 討論

OLP是口腔黏膜病中一種常見的慢性炎癥性疾病，目前關(guān)于其病因和發(fā)病機(jī)制尚無定論，但其病理表現(xiàn)具有典型的慢性炎癥特征，并且可引起相關(guān)免疫學(xué)分子標(biāo)志物的改變[4]。Th1/Th2的失衡表達(dá)與OLP發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。本課題組前期研究結(jié)果提示：OLP患者外周血中Th1型細(xì)胞因子的表達(dá)水平無明顯改變，Th2型細(xì)胞因子顯著升高，呈現(xiàn)Th2占優(yōu)勢(shì)的免疫應(yīng)答。由此可以推測(cè)，Th1/Th2平衡向Th2漂移可能抑制了宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致OLP的慢性炎癥[5]。

Tim-3作為一種負(fù)性免疫調(diào)節(jié)分子，是免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域家族細(xì)胞的表面分子，其廣泛參與過敏、哮喘、自身免疫性疾病及腫瘤等疾病的免疫調(diào)節(jié)過程[6]。Khademi等[7]研究發(fā)現(xiàn)，Tim蛋白可能涉及Thl和Th2細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。

Tim-3基因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)參與T細(xì)胞免疫應(yīng)答的Tim基因家族成員，是Tim家族激活誘導(dǎo)的抑制性受體，主要表達(dá)在分化成熟的Th1細(xì)胞中[8]，在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮抑制性調(diào)節(jié)作用，從而有效調(diào)節(jié)T細(xì)胞凋亡以及免疫耐受過程[9-11]。Gal-9是Tim-3的天然配體，是半乳凝集素家族成員之一，主要表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞以及Treg。Gal-9與Th1細(xì)胞上的Tim-3分子特異性結(jié)合后，對(duì)機(jī)體的免疫細(xì)胞尤其是Th1細(xì)胞的定位、分化趨勢(shì)及分泌功能等產(chǎn)生影響，從而改變機(jī)體的正常免疫功能，從而延緩和/或促進(jìn)疾病的發(fā)生、發(fā)展[12]。何澤現(xiàn)等[13]研究表明，外周血單核細(xì)胞上Tim-3可能通過調(diào)節(jié)IL-12產(chǎn)生間接調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡。亦有研究表明[14]，在骨肉瘤患者的T細(xì)胞和單核細(xì)胞中Tim-3與Gal-9相互作用于免疫抑制反饋回路，從而抑制Th1反應(yīng)。

在本研究中，OLP患者Tim-3 mRNA的表達(dá)高于正常組，Gal-9 mRNA的表達(dá)也有增高的趨勢(shì)，兩者表達(dá)量的增加使得二者結(jié)合力增強(qiáng)，Tim-3/Gal-9通路激活可以引起CD4+T細(xì)胞的失能[15]，降低細(xì)胞免疫，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。目前，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Tim-3/Gal-9通路可以選擇性地下調(diào)γ干擾素（IFN-γ）表達(dá)水平，明顯抑制Thl型細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[16]。由此推測(cè)，Tim-3及其配體Gal-9可能與IFN-γ相互作用，共同參與了OLP免疫病理變化。就本研究而言，可能是OLP患者外周血中大量分泌的T-bet[17]上調(diào)了Tim-3的表達(dá)，經(jīng)Tim-3/Gal-9通路反饋性地抑制CD4+及CD8+T細(xì)胞，促進(jìn)該類細(xì)胞死亡，CD8+T細(xì)胞缺乏抑制性T細(xì)胞，不能有效抑制細(xì)胞免疫與體液免疫的功能，免疫監(jiān)視和負(fù)反饋的能力下降，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫功能出現(xiàn)紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。這與本課題組前期觀察到的OLP患者外周血CD4+及CD8+T細(xì)胞數(shù)目與健康人相比減少是一致的[18]。還有研究表明：Gal-9/Tim-3信號(hào)的強(qiáng)弱對(duì)自然殺傷細(xì)胞活化和功能的發(fā)揮產(chǎn)生不同的影響，信號(hào)較弱時(shí)，自然殺傷細(xì)胞的殺傷功能增強(qiáng);信號(hào)較強(qiáng)時(shí)，自然殺傷細(xì)胞的殺傷功能減弱[19]。本研究中，Tim-3的大量表達(dá)，使得這一通路信號(hào)過強(qiáng)，對(duì)自然殺傷細(xì)胞的功能發(fā)揮抑制作用或誘導(dǎo)其凋亡，從而減少自然殺傷分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，進(jìn)而導(dǎo)致Th1細(xì)胞數(shù)量降低，而Th2細(xì)胞數(shù)量占優(yōu)勢(shì)。

Treg是一種特定細(xì)胞亞群，具有免疫調(diào)節(jié)功能。研究證實(shí)，Treg通過抑制其他T細(xì)胞活化發(fā)揮其主要功能，降低機(jī)體免疫應(yīng)答的程度，縮小免疫應(yīng)答范圍并縮短作用時(shí)間，從而有效阻止了自身抗原的炎癥反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)抑制機(jī)體自身免疫病發(fā)展，因而在抑制發(fā)生自身免疫性疾病及維持機(jī)體免疫平衡方面?zhèn)涫荜P(guān)注。本課題組前期研究結(jié)果已顯示Treg細(xì)胞與OLP病損形成有關(guān)[20]。Foxp3屬于Foxhead家族分叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，這一里程碑的發(fā)現(xiàn)為Treg細(xì)胞研究打開了一扇新的“門”，是免疫生物學(xué)重要的進(jìn)步。研究證實(shí)，F(xiàn)oxp3能夠調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的發(fā)育及功能[21]。Tim-3可通過調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞而參與炎癥性疾病、過敏、哮喘、自身免疫性疾病等的免疫調(diào)節(jié)，并在凋亡細(xì)胞的清除及免疫自穩(wěn)功能中具有重要作用[22]。本研究中OLP患者外周血中Foxp3表達(dá)增高，并與Gal-9、Tim-3的表達(dá)呈正相關(guān)。提示Treg水平的改變與機(jī)體免疫平衡紊亂有關(guān)，高表達(dá)的Foxp3是Treg發(fā)揮免疫抑制功能所必需的，既然Gal-9表達(dá)于Treg表面，因此，推測(cè)Treg可能通過Tim-3/Gal-9通路抑制T細(xì)胞增殖。在本研究中，Tim-3、Gal-9表達(dá)呈正相關(guān)（P < 0.05），Gal-9 mRNA的表達(dá)雖有增高的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。這可能與OLP的樣本量有關(guān)，尤其是充血糜爛型OLP，在以后的研究過程中，課題組將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)Gal-9表達(dá)情況。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，OLP偏離為Th2細(xì)胞介導(dǎo)的優(yōu)勢(shì)應(yīng)答，其機(jī)制可能與Tim-3/Gal-9信號(hào)通路介導(dǎo)的促Th1細(xì)胞凋亡有關(guān)，從而使得Th1型細(xì)胞因子的分泌減少，Th1型免疫應(yīng)答受到抑制。Tim-3 /Gal-9信號(hào)通路介導(dǎo)的Th1細(xì)胞凋亡可能是OLP誘導(dǎo)Th2免疫偏移的機(jī)制之一，深入研究Tim-3/Gal-9通路對(duì)免疫細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡的調(diào)節(jié)作用，探索OLP復(fù)雜的免疫病理變化，將為OLP和其他自身免疫性疾病的診斷與治療提供新的思路。

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（收稿日期：2019-04-01）