長鏈非編碼RNA通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化對射頻消融術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)的影響

廖云忠，彭小萍，方恒，江廣斌

肝癌發(fā)病率在全球范圍內(nèi)位居第6位，死亡率位居第3位[1]；在我國年齡<60歲的男性癌癥患者中肝癌發(fā)病率位居首位[2]。因肝癌發(fā)病過程中癥狀不明顯，以至于很多患者會錯過最佳的治療時間[3]。射頻消融術(shù)現(xiàn)已逐漸在臨床上得到應(yīng)用，為改善該類患者預(yù)后帶來新的希望。但據(jù)統(tǒng)計(jì)，接受射頻消融術(shù)的肝癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率很高[4]。這可能與不完全射頻消融的殘余病灶中肝癌細(xì)胞產(chǎn)生的上皮-間質(zhì)有關(guān)[5]。在肝癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的過程中長鏈非編碼RNA(LncRNA)可能具有重要作用[6]，同時他還可以在轉(zhuǎn)錄過程、轉(zhuǎn)錄后、表觀遺傳學(xué)等多層面來進(jìn)行基因表達(dá)水平的控制[7]。但LncRNA對于射頻消融不完全的肝癌細(xì)胞的影響未見相關(guān)報(bào)道。本研究采用模擬狀態(tài)下研究Huh-7h細(xì)胞上皮-間質(zhì)的生物及轉(zhuǎn)化等特質(zhì)，并使用LncPathTM芯片篩選Huh-7與Huh-7h細(xì)胞差異表達(dá)的EMT相關(guān)LncRNA，為深入探討LncRNA調(diào)控不完全射頻消融肝癌細(xì)胞的侵襲分子機(jī)制、癌細(xì)胞遷移提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 收集湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院暨隨州市中心醫(yī)院2019年1月至11月20例肝癌患者的癌旁正常組織標(biāo)本、手術(shù)切除肝癌組織標(biāo)本以及20例肝癌患者射頻消融術(shù)后穿刺活檢的殘余肝癌組織標(biāo)本。Huh-7人肝癌細(xì)胞由上海聯(lián)邁生物工程有限公司提供；胎牛血清、CCK-8、DMEM培養(yǎng)基試劑盒由美國GIBCO公司提供；Transwell小室、基底膠購于北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；波形及E-鈣黏蛋白購于德國Chromo Tek公司；基因芯片檢測和分析由天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司完成。本研究經(jīng)過本院倫理委員會的審核，并得到批準(zhǔn)，家屬或患者簽署了知情同意書。

1.2 不完全射頻消融肝細(xì)胞模型Huh-7h建立 參考Yoshida等[8]報(bào)道的方法，采用47 ℃水浴熱誘導(dǎo)Huh-7細(xì)胞，得到體外模擬不完全射頻消融肝癌細(xì)胞。具體方法：Huh-7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至覆蓋培養(yǎng)皿80%～90%后，47 ℃水浴5 min，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿80%，再次47 ℃水浴5 min，按上述程序依次水浴15 min、20 min、25 min；收集存活的細(xì)胞為Huh-7h。

1.3 Western blot檢測EMT分子標(biāo)記 將RIPA蛋白提取劑添加到Huh-7細(xì)胞、Huh-7h細(xì)胞中，采用12 000 r/min離心10 min，取上清，采用BCA法對蛋白進(jìn)行定量，對各點(diǎn)樣孔加入相同質(zhì)量的蛋白樣品，使用SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF，封閉1 h，溫度保持4 ℃，將兔抗人β-actin多克隆抗體(1∶500)、兔抗人波形蛋白單克隆抗體(1∶200)、鼠抗人E鈣黏蛋白單克隆抗體(1∶500)添加其中,靜置12 h，而后滴加兔抗人IgG(1∶1 000)或鼠抗人IgG，孵育1 h，當(dāng)ECL暗室顯影、顯色時研究條帶的灰度值。

1.4 細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測 Transwell細(xì)胞侵襲：采用不含有DMEM的培養(yǎng)基，按照15∶1比例融合，抽選100 μl加入上室，成膠后用磷酸緩沖洗，而后加入1×105個細(xì)胞，加入5% CO2，溫度保持37 ℃，孵育48 h；4%多聚甲醛將其固定30 min，而再用磷酸緩沖洗，在光學(xué)顯微鏡下選取視野，計(jì)算細(xì)胞平均值。Transwell細(xì)胞遷移：Huh-7、Huh-7h細(xì)胞計(jì)數(shù)后，上室加入1×105個細(xì)胞，下室加入10%胎牛血清DMEM的培養(yǎng)基，800 μl，剩余步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞增殖能力檢測 準(zhǔn)備Huh-7h、Huh-7細(xì)胞懸液，密度為1×105/ml；加入96孔板，100 μl/孔，在37 ℃培養(yǎng)箱中加入5%CO2，孵育24 h、48 h、72 h；丟掉細(xì)胞培養(yǎng)液，加入100 μl/孔，CCK-8檢測液，37 ℃培養(yǎng)箱中加入5%CO2，孵育4 h，使用酶標(biāo)儀檢測吸光值。設(shè)5個平行對照。

1.6 LncRNA差異表達(dá)分析 Trizol法提取Huh-7和Huh-7h細(xì)胞總RNA，使用德國晶芯cRNA擴(kuò)增標(biāo)記試劑盒對總RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。使用人類LncPathTM芯片技術(shù)對熒光標(biāo)記的cRNA進(jìn)行雜交；使用Agilent 2100生物芯片分析系統(tǒng)和掃描儀處理。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：表達(dá)改變≥1.5倍，P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞EMT分子標(biāo)記物表達(dá)水平比較 Huh-7h細(xì)胞上皮表型標(biāo)志物E-鈣黏蛋白相對表達(dá)量(2.37±0.35)低于Huh-7細(xì)胞相對表達(dá)量(5.04±0.82)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.696，P<0.001)；Huh-7h細(xì)胞間質(zhì)表型標(biāo)志物N-鈣黏蛋白相對表達(dá)量(6.92±0.68)高于Huh-7細(xì)胞相對表達(dá)量(3.11±0.47)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.306，P<0.001)；波形蛋白相對表達(dá)量(5.70±0.35)高于Huh-7細(xì)胞相對表達(dá)量(2.04±0.21)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.051，P<0.001)，見圖1。

注：1、2為Huh-7細(xì)胞；3、4為Huh-7h細(xì)胞圖1 Western blot檢測細(xì)胞EMT分子標(biāo)記物表達(dá)水平

2.2 細(xì)胞遷移和侵襲能力比較 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，Huh-7h穿膜細(xì)胞數(shù)(341.50±42.90)高于Huh-7穿膜細(xì)胞數(shù)(189.00±30.35)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.489，P<0.001)；細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，Huh-7h穿膜細(xì)胞數(shù)(283.73±50.90)高于Huh-7穿膜細(xì)胞數(shù)(102.68±35.22)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.541，P<0.001)，見圖2。

2A:Huh-7細(xì)胞侵襲能力檢測；2B:Huh-7h細(xì)胞侵襲能力檢測；2C:Huh-7細(xì)胞遷移能力檢測；2D:Huh-7h細(xì)胞遷移能力檢測圖2 Transwell檢測Huh-7和Huh-7h細(xì)胞遷移和侵襲能力(結(jié)晶紫染色 ×400)

2.3 細(xì)胞增殖能力比較 CCK-8細(xì)胞增殖能力檢測顯示，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時Huh-7h細(xì)胞吸光度值高于Huh-7細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 sHuh-7h、Huh-7細(xì)胞培養(yǎng)不同時間后的吸光度值比較

2.4 細(xì)胞差異表達(dá)LncRNA分析 采用LncPathTM芯片收集Huh-7h、Huh-7基因表達(dá)數(shù)據(jù)，聚類分析LncRNA。發(fā)現(xiàn)Rpl27p7(ENST00000552432)與Fundc2p4(ENST00000552318)是與差異表達(dá)有所關(guān)聯(lián)的下調(diào)LncRNA，Mtnd4lp14(ENST00000538558)是與差異表達(dá)有所關(guān)聯(lián)的上調(diào)LncRNA。經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證，Huh-7h細(xì)胞中Fundc2p4相對表達(dá)量低于Huh-7細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 RT-PCR檢測Huh-7h、Huh-7細(xì)胞中差異表達(dá)基因相對表達(dá)量

2.5 射頻消融術(shù)后殘余肝癌組織中Fundc2p4表達(dá)分析 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，LncRNA Fundc2p4在癌旁組織中相對表達(dá)量(3.48±0.51)高于手術(shù)切除的肝癌組織中相對表達(dá)量(1.15±0.42)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.772，P<0.001)；LncRNA Fundc2p4在手術(shù)切除的肝癌組織中相對表達(dá)量(1.54±0.26)高于射頻消融術(shù)后殘余肝癌組織相對表達(dá)量(0.21±0.06)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=22.291，P<0.001)。

3 討論

射頻消融術(shù)是目前無法行根治術(shù)的中晚期肝癌患者可選擇的治療方案之一，屬于局部治療，但從臨床治療效果來看，因受肝癌病灶解剖位置(如與神經(jīng)、器官、血管等相鄰)、熱沉降效應(yīng)、疊加消融時低溫區(qū)等影響，癌灶完全消融率偏低[9]。射頻消融時若刺激到未完全消融的殘余癌組織，可能促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。通過熱誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞在體外模擬不完全射頻消融，結(jié)果顯示，不完全射頻消融可誘發(fā)肝癌細(xì)胞的EMT形態(tài)學(xué)改變，侵襲、遷移能力明顯增強(qiáng)，鈣黏蛋白、波形蛋白、細(xì)胞角蛋白等上皮表型標(biāo)志物表達(dá)水平升高[11]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞EMT過程中，LncRNA具有重要作用[12]。LncRNA通過靶向作用于ZEB1來調(diào)控EMT，導(dǎo)致肝癌預(yù)后不良[13]。lncRNA Aoc4p作為肝癌細(xì)胞的抑制基因，可以通過與波形蛋白結(jié)合，加速溶解，使肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力下降，同時還可抑制EMT[14]。PI3K/Akt信號通路可由白細(xì)胞介素6激活，活化Lnc TCF7啟動子，從而介導(dǎo)EMT，促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲[15]。上述研究均表明LncRNA異常表達(dá)與肝癌細(xì)胞EMT和遷移、侵襲明顯相關(guān)。本研究通過熱誘導(dǎo)Huh-7人肝癌細(xì)胞，建立體外不完全射頻消融模型Huh-7h細(xì)胞；對EMT分子標(biāo)記物檢測顯示，Huh-7h細(xì)胞的波形蛋白、N-鈣黏蛋白相對表達(dá)量升高，E-鈣黏蛋白相對表達(dá)量下降，這表明，在Huh-7h細(xì)胞當(dāng)中確實(shí)存在EMT。Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，Huh-7h穿膜細(xì)胞數(shù)高于Huh-7，提示不完全射頻消融肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力較原生的肝癌細(xì)胞增強(qiáng)，不完全射頻消融的肝癌患者轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)可能更高。

在CCK-8與Transwell結(jié)果中得出，與LncRNA常規(guī)芯片檢測LncRNA表達(dá)水平相比，LncPathTM芯片檢測目的性更強(qiáng)，篩選出差異表達(dá)的LncRNA能力更強(qiáng)[16]。采用RT-PCR對篩選出的3個差異表達(dá)基因進(jìn)行檢測，得到LncRNA Fundc2p4進(jìn)行進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在癌旁正常組織、手術(shù)切除肝癌組織與射頻消融術(shù)后殘余肝癌組織相比，后者的LncRNA Fundc2p4表達(dá)水平最低，提示射頻消融不完全的肝癌細(xì)胞通過低表達(dá)EMT相關(guān)的LncRNA Fundc2p4基因來促進(jìn)EMT，增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力；LncRNA Fundc2p4可能作為抑癌基因參與EMT的調(diào)控。

綜上，射頻消融不完全的肝癌細(xì)胞通過低表達(dá)EMT相關(guān)的LncRNA Fundc2p4基因來促進(jìn)EMT，增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，增加肝癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。靶向控制以上通路，有可能降低射頻消融術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而改善肝癌患者的預(yù)后。