產(chǎn)IAA菌株的UV和DES誘變篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

李雅華 張啟航 王 姣 安 東 劉 新

(青島農(nóng)業(yè)大學生命科學學院/山東省高校植物生物技術重點實驗室/山東省重點應用真菌學實驗室，山東青島 266109)

吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑被廣泛使用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上[1-2]。研究表明，許多微生物能夠產(chǎn)生IAA[3-5]，這些菌株及其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對植物具有促生性[6-8]。將IAA 菌株制成菌劑施用在不同作物上，表現(xiàn)出多種促生性狀，如增加根系總長度、根表面積、根體積和根尖數(shù)[9-11]、提高種子發(fā)芽率[12-14]和緩解鹽或低氮脅迫[15-16]等。使用菌株的含IAA 代謝產(chǎn)物，也具有促生作用，如葛春輝等[17]用1%產(chǎn)IAA 菌株發(fā)酵液處理黃瓜種子，根長顯著增加。因此，產(chǎn)IAA 菌株及代謝產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有潛在的應用前景。

土壤中存在諸多產(chǎn)IAA 的菌株，但這些野生菌株的產(chǎn)量不高[18-19]，僅通過分離篩選難以得到高產(chǎn)IAA菌株，如連翠飛等[20]通過分離篩選得到1 株產(chǎn)IAA 的菌株，發(fā)酵120 h 時產(chǎn)量僅為1.19 mg·L-1。這些菌株直接應用經(jīng)濟效益不佳，需對菌株進行定向選育，以獲得高產(chǎn)IAA 的菌株。而誘變是一種有效的微生物菌種選育方法[21-23]，也是選育高產(chǎn)IAA 菌株的有效技術手段。如李劍峰等[24]對產(chǎn)IAA 菌株進行微波誘變，獲得突變株RSW-96，培養(yǎng)4 d 和24 d 后產(chǎn)IAA 量分別為8.38 mg·L-1和50.75 mg·L-1，較原始菌株分別提高了66.93%和50.15%。紫外(ultraviolet，UV) 誘變和硫酸二乙酯(diethyl sulfate，DES)誘變是比較常見的誘變方法，可有效提高突變株目標代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[25-27]。其中，UV 輻射能引起堿基轉(zhuǎn)換、顛換、移碼突變或缺失，DES 處理可以進行烷基置換，從而達到誘變目的。但目前將其應用到提高菌株IAA 產(chǎn)量的研究鮮見報道。本研究擬從煙草根際土壤分離得到的一株產(chǎn)IAA 并具有溶有機磷性狀的根際促生菌PGPR菌株為出發(fā)菌株，采用不同劑量的UV 和DES 進行誘變選育，探索這2 種方法的誘變效果，選育遺傳穩(wěn)定、高產(chǎn)IAA，并保持溶有機磷功能的菌株。菌株分泌代謝產(chǎn)物除受內(nèi)部遺傳因子的影響外，還受外界環(huán)境因素的影響，適宜的培養(yǎng)條件可以顯著提高目標產(chǎn)物產(chǎn)量[28-30]。因此，本研究對選育出的高產(chǎn)IAA 菌株進行了發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化，旨在進一步提高突變菌株的IAA 產(chǎn)量，了解菌株特性，為今后的研究應用提供基礎材料及試驗方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

編號F23 的產(chǎn)IAA 菌株，由青島農(nóng)業(yè)大學微生物實驗室保藏。

發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉5 g、胰蛋白胨10 g、水解酪蛋白1 g、L-色氨酸100 mg、水1 000 mL。

有機磷篩選培養(yǎng)基，購自海博生物技術有限公司；IAA 標準品(97%)，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵液中IAA 含量檢測 標準曲線的制作:參照張東艷等[9]的方法，以反應體系中標準品IAA 濃度為橫坐標，以OD530為縱坐標制作標準曲線。

IAA 產(chǎn)量檢測:將待測菌株按2%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)(150 r·min-1)24 h 后，測定發(fā)酵液的OD600值，并將發(fā)酵液于10 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液加入等體積Salkowski 比色液，避光靜置30 min，測定其OD530值。根據(jù)標準曲線計算發(fā)酵液中IAA 含量，并根據(jù)OD600值，按照公式計算單位IAA 產(chǎn)量[9]:

單位IAA 產(chǎn)量＝發(fā)酵液中IAA 含量/發(fā)酵液OD600值。

1.2.2 溶有機磷性能檢測 將待測菌株點接在有機磷篩選培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)24 h 后開始觀察，培養(yǎng)48 h 待溶P 圈清晰，能夠準確測量時結束觀察并進行測量，計算D/d 值(溶P 圈直徑與菌落直徑比值，D 為溶P 圈直徑，d 為菌落直徑)[31]。

1.2.3 菌株的誘變選育 出發(fā)菌株F23 在28℃下發(fā)酵培養(yǎng)15 h 左右，10 000 r·min-1離心5 min 收集菌株，用生理鹽水沖洗3 次后制備菌懸液(OD600＝1.0)，然后進行以下誘變處理。UV 誘變:紫外燈(15 W)預熱20 min，取2 mL 菌懸液放在無菌的培養(yǎng)皿中(內(nèi)有無菌磁子)，置于距紫外燈30 cm 處的磁力攪拌器上，誘變時間分別為0、1、3、5、7、9、11 min。DES 誘變[26]:不同時間的誘變處理(A):取5 mL 菌懸液加入5 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS，pH 值7.0)，然后加入10%DES(終濃度為2 mg·mL-1)，28℃恒溫振蕩分別處理0、30、60、90、120 min，再加入2.5倍DES 體積的25%硫代硫酸鈉終止反應；不同濃度的處理(B):DES 濃度分別為1、2、3、4 mg·mL-1，處理時間為30 min，其他操作同處理A。

各處理用生理鹽水進行系列稀釋，取0.1 mL 涂布于Luria-Bertani(LB)平板，于28℃避光培養(yǎng)，每個稀釋度3 次重復，對照為0 min 的處理。36 h 后觀察菌落生長情況并計數(shù)，計算致死率。選取致死率在85%～95%的處理，挑出單菌落，發(fā)酵24 h 后檢測單位產(chǎn)IAA 能力。致死率和正突變率計算公式如下:

致死率＝(對照菌落數(shù)-處理菌落數(shù))/對照菌落數(shù)×100%

正突變率＝性狀提高的菌落數(shù)/挑取菌落數(shù)×100%。

復合誘變試驗:將化學誘變篩選出的1 株菌進行紫外誘變(最佳誘變條件)。其他操作與檢測方法同上。

1.2.4 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性 出發(fā)菌株具有產(chǎn)IAA 和溶有機磷兩種促生性狀，為了提高IAA 產(chǎn)量且不失去溶有機磷性狀，制定了高產(chǎn)IAA 且溶有機磷性不低于出發(fā)菌株的選育目標。將誘變后所有高產(chǎn)IAA 菌株點接在有機磷平板上，檢測溶磷性D/d值。將不低于出發(fā)菌株D/d 值的誘變菌株，繼代培養(yǎng)3 代，每代分別發(fā)酵24 h 后10 000 r·min-1離心5 min，上清液進行產(chǎn)IAA 性檢測，篩選高產(chǎn)IAA 和溶有機磷性能均遺傳穩(wěn)定的目標菌株；將得到的目標菌株從第4 代繼代培養(yǎng)至第10 代，每代發(fā)酵72 h 后檢測單位IAA 產(chǎn)量；將繼代培養(yǎng)的第1 代和第10 代菌體點接于有機磷平板上，檢測溶有機磷性能的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.5 誘變菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化 以IAA 產(chǎn)量為篩選指標，對不同裝瓶量(10%、15%、20%、25%、30%和35%)、初始pH 值(4、5、6、7、8 和9)、培養(yǎng)溫度(15、20、25、30 和35℃)、接種量(1%、2%、3%、5%、10%、15%和20%)、培養(yǎng)時間(每隔12 h 取樣一次)、色氨酸含量(0、100、200、300、400、500、600 mg·L-1) 5個因素的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。單因素優(yōu)化試驗基礎培養(yǎng)條件:接種量2%、培養(yǎng)溫度28℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)72 h。每處理3 次重復，檢測發(fā)酵液中IAA 含量，前一步優(yōu)化的結果用于后續(xù)試驗，并對產(chǎn)量影響較大的4 個因子進行四因素三水平正交試驗，以發(fā)酵液中IAA 產(chǎn)量指標OD530值為考察指標，最終確定誘變菌株的最佳發(fā)酵工藝。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 6.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 誘變選育

經(jīng)檢測IAA 含量標準曲線回歸方程為:y＝0.032 5x＋0.013 1，相關系數(shù)R2＝0.997 5。

2.1.1 UV 誘變選育 UV 處理1 min 后菌株的致死率為95.3%，表明1 min 為菌株UV 誘變的最佳處理時間。挑取所有單菌落，共74 株，其中8 株產(chǎn)IAA 能力高于出發(fā)菌株F23(CK)，正突變率為10.8%；表現(xiàn)優(yōu)良的菌株有3 株，編號分別為UV5、UV70 和UV19，其中，UV5 的IAA 產(chǎn)量最高，單位產(chǎn)量高達26.71 mg·L-1，較出發(fā)菌株F23 提高了345.91%(表1)。

表1 UV 誘變選育的菌株產(chǎn)IAA 性能Table1 IAA-producing performance of strains selected by UV mutagenesis

2.1.2 DES 誘變選育 處理組A(10%DES 誘變處理不同時間)結果顯示，10%DES 最適誘變處理時間為30 min，此時菌株致死率為85.6%。挑取該處理單菌落共42 株，發(fā)酵檢測產(chǎn)IAA 能力，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)IAA 能力均未超過出發(fā)菌株F23(CK)，正突變率為0。

處理組B(不同濃度DES 誘變處理30 min)結果顯示，菌株的DES 最適誘變濃度為2 mg·mL-1，此時菌株致死率為94.1%。挑取該處理單菌落共54 株，其中3 株產(chǎn)IAA 能力高于出發(fā)菌株F23(CK)。正突變率為5.56%，表現(xiàn)優(yōu)良的菌株有2 株，編號分別為H15和H42，其中，H42 的單位IAA 產(chǎn)量最高，達11.59 mg·L-1，較出發(fā)菌株提高了86.63%(表2)。

表2 DES 誘變選育的菌株產(chǎn)IAA 性能Table2 IAA-producing performance of strains selected by chemical mutagenesis

2.1.3 復合誘變選育 將DES 誘變得到的菌株H42進行UV 處理1 min，涂布分離得到96 株，發(fā)酵檢測菌株產(chǎn)IAA 的能力，均未超過出發(fā)菌株F23，正突變率為0。復合誘變往往能得到更好的突變株，如薛應鈺等[32]對一株溶磷菌進行復合誘變得到了溶磷性更強的突變株，而本研究沒有得到溶磷性更強的突變體，其原因可能與菌株遺傳背景和誘變條件有關。

2.2 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性

將UV 誘變得到的8 個菌株和DES 誘變得到的3個菌株接種到有機磷平板上，培養(yǎng)48 h 后D/d 值≥出發(fā)菌株D/d 值的有3 株，編號分別是H42、UV19 和UV70。將此3 株菌繼代培養(yǎng)2 次(培養(yǎng)48 h)，檢測結果表明，H42 和UV70 產(chǎn)IAA 性能逐代下降，且UV70的溶磷性能也逐代降低，而UV19 的產(chǎn)IAA 性能和溶磷性能均比較穩(wěn)定(表3)。因此，篩選UV19 為目標菌株繼續(xù)進行遺傳穩(wěn)定性檢測。

表3 誘變菌株不同代數(shù)的功能性狀表現(xiàn)Table3 Functional traits of genetic algebra of mutagenized strains

UV19 經(jīng)10 代繼代培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)72 h 后，將每代進行IAA 產(chǎn)量檢測，結果顯示，UV19 從第4 代到第10 代IAA 產(chǎn)量在32.34 ～33.77 mg·L-1之間。方差分析表明，各繼代之間無顯著性差異(圖1)。將第1 代和第10 代分別點接到有機磷平板上，其D/d 值分別為1.42 和1.32，無顯著性差異。綜上表明，UV19 遺傳性狀穩(wěn)定。

2.3 菌株UV19 的培養(yǎng)優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗結果

2.3.1.1 裝瓶量對菌株UV19 IAA 產(chǎn)量的影響 由圖2-A 可知，不同裝瓶量對菌株UV19 IAA 產(chǎn)量有極顯著影響，隨著裝瓶量的增加，菌株單位IAA 產(chǎn)量逐漸減少。當裝瓶量為10%時，單位IAA 產(chǎn)量最高，為34.1 mg·L-1，故后續(xù)試驗采用10%的裝瓶量。在轉(zhuǎn)速一定的條件下，裝瓶量是影響發(fā)酵體系供氧的重要因素，各處理每降低5%的裝瓶量，菌株UV19 的生物量及單位IAA 產(chǎn)量顯著提高，說明該菌株對氧需求較高。

圖1 菌株UV19 不同繼代的IAA 產(chǎn)量分析Fig.1 IAA production analysis of different generations of strain UV19

2.3.1.2 培養(yǎng)基初始pH 值對菌株UV19 IAA 產(chǎn)量的影響 由圖2-B 可知，培養(yǎng)基不同初始pH 值對菌株UV19 IAA 產(chǎn)量有不同影響，培養(yǎng)基初始pH 值為4、5的酸性條件下菌株幾乎不生長，單位IAA 產(chǎn)量極低；初始pH 值為8 時，菌株單位IAA 產(chǎn)量最高，為37.15 mg·L-1，高于初始pH 值為6、7 和9 時的IAA 產(chǎn)量，但與初始pH 值為7 和9 時無顯著差異?？梢姡嵝?、強堿條件不利于菌株UV19 生產(chǎn)IAA，而弱堿性條件有利于菌株生產(chǎn)IAA。因此，后續(xù)試驗培養(yǎng)基的初始pH值為8。

2.3.1.3 培養(yǎng)溫度對菌株UV19 IAA 產(chǎn)量的影響由圖2-C 可知，不同培養(yǎng)溫度對菌株UV19 IAA 產(chǎn)量影響不同，高溫不利于生產(chǎn)IAA。培養(yǎng)溫度為20 ～30℃時，各溫度下菌株IAA 產(chǎn)量無極顯著差異；培養(yǎng)溫度大于30℃，IAA 產(chǎn)量顯著下降，培養(yǎng)溫度為35 和40℃時菌株的生長及IAA 產(chǎn)量均極顯著低于其他處理；培養(yǎng)溫度為20℃時，菌株UV19 的IAA 產(chǎn)量最高，為43.63 mg·L-1，說明菌株在溫度較低時可以高效分泌IAA，這將有利于菌劑在生產(chǎn)上的應用。但因其與培養(yǎng)溫度為25、28℃時無顯著差異，因此，綜合考慮，后續(xù)試驗采用25℃作為菌株的培養(yǎng)溫度。

2.3.1.4 接種量對菌株UV19 IAA 產(chǎn)量的影響 由圖2-D 可知，接種量為1%～10%時，菌株單位IAA 產(chǎn)量無顯著差異；接種量為15%時，菌株單位IAA 產(chǎn)量顯著減少；接種量為3%時，菌株單位IAA 產(chǎn)量最高，為44.57 mg·L-1。因此，后續(xù)試驗采用的菌株接種量為3%。

圖2 各單因素對菌株UV19 IAA 產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of single factor on IAA production of strain UV19

2.3.1.5 培養(yǎng)時間對菌株UV19 IAA 產(chǎn)量的影響由2-E 可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株UV19 的IAA產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)再下降的趨勢。培養(yǎng)時間小于108 h 時，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株UV19 IAA 產(chǎn)量逐步增加，但培養(yǎng)時間為84、96、108 h 時菌株IAA 產(chǎn)量無顯著差異，分別為44.61、45.99 和46.42 mg·L-1；繼續(xù)延長培養(yǎng)時間，菌株的IAA 產(chǎn)量顯著下降。因此，后續(xù)試驗采用84 h 作為菌株UV19 的培養(yǎng)時間。

2.3.1.6 色氨酸添加量對菌株UV19 IAA 產(chǎn)量的影響 由圖2-F 可知，隨著色氨酸添加量的增加，菌株IAA 產(chǎn)量逐漸增加。方差分析表明，色氨酸添加量分別為0、100、200、300 與400 mg·L-1處理組IAA 產(chǎn)量有極顯著差異；色氨酸添加量為500 mg·L-1時，IAA 產(chǎn)量與色氨酸添加量為400 mg·L-1有顯著差異，與色氨酸添加量為600 mg·L-1無顯著差異，分別為70.46、75.48和79.13 mg·L-1；未添加色氨酸時，菌株UV19 也能夠產(chǎn)生一定量的IAA，但顯著低于添加200 mg·L-1以上色氨酸的處理組。因此，適量添加發(fā)酵底物色氨酸可以提高菌株IAA 產(chǎn)量。

2.3.2 正交試驗結果 根據(jù)單因素試驗結果，選出4個對菌株UV19 IAA 產(chǎn)量影響較大的因素，即培養(yǎng)基初始pH 值、色氨酸添加量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。按10%裝瓶量、3%接種量設計四因素三水平L9(34)正交試驗(表4)。正交試驗的設計及結果見表5，正交試驗極差分析見圖3。

正交試驗結果表明，4 個因素對IAA 產(chǎn)量的影響大小依次為色氨酸添加量>培養(yǎng)時間>初始pH 值>培養(yǎng)溫度。極差分析表明，最佳組合為A2B3C2D2，即初始pH 值8、培養(yǎng)溫度25℃、培養(yǎng)時間96 h、含600 mg·L-1色氨酸的LB 培養(yǎng)基。而單因素試驗表明，培養(yǎng)基中色氨酸添加量為500～600 mg·L-1時，菌株單位IAA 產(chǎn)量無顯著差異，因正交試驗組合中沒有A2B2C2D2組合，因此，將最佳A2B3C2D2、A2B2C2D2及A1B1C1D1組合進行驗證，結果顯示，組合A2B3C2D2和A2B2C2D2的OD530值分別為0.561 和0.489，差異不顯著，說明色氨酸添加量為500 或600 mg·L-1對菌株的IAA 產(chǎn)量無顯著影響。這與單因素試驗結果相符。此外，A2B3C2D2與A1B1C1D1的OD530值(OD530＝0.151)有顯著差異，說明正交試驗結果正確。

表4 L9(34)正交試驗設計與水平Table4 Design and level of L9(34) orthogonal test

表5 正交試驗結果Table5 The result oforthogonal experimental

綜上，單因素試驗及正交優(yōu)化試驗結果表明，菌株UV19 產(chǎn)IAA 的最適培養(yǎng)條件:裝瓶量10%、接種量3%、初始pH 值8、培養(yǎng)溫度25℃、培養(yǎng)時間96 h、色氨酸添加量500 mg·L-1，此條件下，菌株IAA 產(chǎn)量為75.47 mg·L-1，為優(yōu)化前菌株IAA 產(chǎn)量的2.23 倍，為出發(fā)菌株F23 IAA 產(chǎn)量的12.6 倍(圖4)。

圖3 菌種UV19 在各因素各水平處理下相對IAA 產(chǎn)量的極差圖Fig.3 Range diagram of relative IAA production of strain UV19 under different factors and levels

圖4 出發(fā)菌株F23、突變株UV19 及優(yōu)化后UV19 的IAA 產(chǎn)量Fig.4 IAA production of starting strain F23，mutant strain UV19 and optimized strain UV19

3 討論

根際產(chǎn)IAA 菌株作為根際促生菌的一類，近年來有關該類菌株的研究報道較多，但大多集中在通過分離篩選來獲得高產(chǎn)IAA 菌株方面，有關通過誘變選育來提高其IAA 產(chǎn)量的研究較少[24]。本研究用UV 和DES 誘變方法對菌株F23 進行選育，發(fā)現(xiàn)這2 種方法均能夠得到高產(chǎn)IAA 的菌株。其中，UV 誘變得到的突變株UV19 IAA 產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了299.48%；DES 誘變得到的突變株H42 IAA 產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了86.63%。就菌株F23 而言，UV 誘變比DES 誘變更容易得到目標菌株。在誘變選育中，通過復合誘變往往能獲得更好的誘變效果[27]。而本試驗在DES 誘變后嘗試用UV 誘變1 min 進行復合誘變，但未得到目標菌株，其誘變條件有待進一步研究。

對菌株進行發(fā)酵條件優(yōu)化，在得到最適培養(yǎng)條件的同時，也能了解菌株的生物特性。本研究在優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中色氨酸添加量是影響菌株UV19 IAA 產(chǎn)量的最重要因素。菌株UV19 在沒有色氨酸存在時也能產(chǎn)生IAA，但添加色氨酸后其IAA 產(chǎn)量顯著提高。生物合成生長素有依賴色氨酸途徑和非依賴色氨酸途徑[33-34]，微生物可以利用色氨酸產(chǎn)生IAA[35-36]，推測菌株UV19 可能存在多種合成途徑。初始pH 值對菌株IAA 產(chǎn)量也有較大的影響[37]，酸性和強堿環(huán)境均不利于菌株UV19 產(chǎn)生IAA，因此UV19 作為菌劑可能較適宜應用于中性或偏堿性土壤；在培養(yǎng)溫度為20 ～30℃時，菌株UV19 的IAA 產(chǎn)量無顯著差異，說明其培養(yǎng)溫度范圍較寬，這對今后農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應用及工業(yè)生產(chǎn)極為有利。目前，IAA 生產(chǎn)主要采用化學方法，由吲哚、甲醛與氰化鉀在150℃、0.9～1.0 MPa 下反應生成3-吲哚乙腈，再在氫氧化鉀作用下水解生成，或由吲哚與羥基乙酸反應而得[38-39]，需要高溫高壓的生產(chǎn)條件，且會產(chǎn)生大量有害廢液。如能采用生物發(fā)酵法生產(chǎn)，不僅可以降低成本，而且不會對環(huán)境造成污染。

4 結論

UV 誘變和DES 誘變均能有效提高菌株F23 的IAA 產(chǎn)量，且UV 誘變比DES 誘變更為有效。UV 誘變獲得1 株高產(chǎn)IAA 并遺傳穩(wěn)定的菌株UV19，其IAA產(chǎn)量為出發(fā)菌株F23 的299.48%；發(fā)酵優(yōu)化可顯著提高其IAA 產(chǎn)量，在最適條件下菌株UV19 單位IAA 產(chǎn)量達75.47 mg·L-1，為優(yōu)化前的2.23 倍。本研究結果表明，發(fā)酵法生產(chǎn)IAA 在理論上是可行的，這為菌肥及生物發(fā)酵法生產(chǎn)IAA 提供了基礎材料，下一步將對菌株發(fā)酵液中的IAA 進行提取、純化技術研究。