LC-MS/MS測(cè)定新鮮水果蔬菜中LAE的方法

郝志闊，賈洪信，楊晉青

1. 廣東環(huán)境保護(hù)工程職業(yè)學(xué)院食品工程系（佛山 528216）；2. 上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院（上海 200233）

月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽（ethyl lauroyl arginate hydrochloride，LAE）是一種新型食品防腐劑，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、酵母和霉菌都具有明顯的抑制作用，具有廣譜抗菌性[1-3]。研究表明LAE具有極好的安全性，在人體內(nèi)通過(guò)化學(xué)和代謝途徑水解為人體日常飲食中攝入的化合物[4-5]。2005年，LAE被美國(guó)FDA列為一般公認(rèn)安全（GRAS）的食品添加劑，推薦添加量為200 mg/kg，允許用于肉類和禽類食品[6]。2007年，LAE通過(guò)歐洲食品安全管理局（EFSA）的安全食品認(rèn)證。2011年，LAE被國(guó)際食品法典委員會(huì)列入《食品添加劑通用法典標(biāo)準(zhǔn)》中，可廣泛用于多種食品及生鮮農(nóng)產(chǎn)品[7]。2012年，澳大利亞批準(zhǔn)LAE作為防腐劑使用在香腸和香腸肉（包括未加工的肉類原料）中，最大使用量為315 mg/kg[8-9]。根據(jù)我國(guó)衛(wèi)健委《食品添加劑新品種管理辦法》規(guī)定，2018年05月11日國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心發(fā)布關(guān)于《食品添加劑 Na-月桂酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽》的征求意見(jiàn)，主要包含食品添加劑申請(qǐng)者提交的申請(qǐng)資料中可公開(kāi)征求意見(jiàn)的內(nèi)容，內(nèi)容規(guī)定了新鮮水果和新鮮蔬菜的最大使用量為220 mg/kg。目前月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽尚未被列入GB 2760《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中，因此沒(méi)有相應(yīng)的食品添加劑月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)及其標(biāo)準(zhǔn)[10-11]。鑒于此，試驗(yàn)以新鮮水果和新鮮蔬菜為研究對(duì)象，利用高效液相色譜法檢測(cè)其中的防腐劑LAE含量，以期建立一種快速高效的新鮮水果和蔬菜中防腐劑LAE含量的檢測(cè)方法，為食品添加劑質(zhì)量規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）；月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品：USP，美國(guó)藥典委員會(huì)。

月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.0 mg/mL）：稱取0.100 0 g月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽于100 mL容量瓶中，用V（水）∶V（乙腈）=1∶9溶解并定容至刻度，存放于4 ℃冰箱中備用。月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)工作液：取1.0 mL月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用V（水）∶V（乙腈）=1∶9溶劑稀釋至1.0 mg/L備用。

月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)校正溶液：用V（水）∶V（乙腈）=1∶9溶劑稀釋月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)工作液，使其質(zhì)量濃度分別為20，10，5，1，0.2和0.1 μg/L。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；AB SCIEX QTRAP?6500質(zhì)譜儀（美國(guó)Sciex公司）；TB-114型分析天平（Mettler Toledo公司）；渦旋混合器（德國(guó)IKA公司）；超聲波清洗器（上海鯨德公司）；高速離心機(jī)（Eppendorf公司）；氮?dú)鉂饪s裝置（英國(guó)PEAK公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脫；流速為300 μL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣體積為2 μL。

質(zhì)譜條件：離子化方式，ESI；掃描方式，正離子掃描；檢測(cè)方式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；氣簾氣（CUR），20.0 psi；霧化氣（GS1），35.0 psi；加熱氣（GS2），30.0 psi；噴霧電壓（IS），5 500 V；去溶劑溫度（TEM），450 ℃；去簇電壓（DP）=30 V；定量離子對(duì)385.3/368.3，碰撞能（CE）=28 eV；定性離子對(duì)385.3/326.3，碰撞能（CE）=31 eV。

1.2.2 樣品前處理?xiàng)l件

準(zhǔn)確稱取2.50 g試樣于50 mL離心管中，加入25.0 mL乙腈，2 g氯化鈉，渦旋1 min，超聲5 min，以9 000 r/min離心1 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，濾液作為待測(cè)溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜方法

使用1 μg/mL濃度的LAE標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過(guò)流動(dòng)注射泵進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行母離子和子離子掃描優(yōu)化，離子化方式，ESI；掃描方式，正離子掃描；檢測(cè)方式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；氣簾氣（CUR），20.0 psi；霧化氣（GS1），35.0 psi；加熱氣（GS2），30.0 psi；噴霧電壓（IS），5 500 V；去溶劑溫度（TEM），450℃；優(yōu)化得到LAE的母離子、子離子及碰撞能量等質(zhì)譜采集參數(shù)如表1所示，其中385.3/368.3為定量離子。

表1 質(zhì)譜采集參數(shù)

2.2 液相色譜方法

使用10 ng/mL的LAE標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜方法優(yōu)化，分別使用甲醇- 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水和乙腈-質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度如表2所示，其中A相為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸水溶液，B相為有機(jī)相，得到的圖譜如圖1和圖2所示。

從圖1和圖2可以看出，乙腈的洗脫能力好于甲醇，質(zhì)譜響應(yīng)高于甲醇，且色譜峰較窄，故選擇乙腈-質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸水溶液作為L(zhǎng)AE檢測(cè)的流動(dòng)相。

表2 梯度洗脫條件

圖1 甲醇梯度洗脫色譜圖

圖2 乙腈梯度洗脫色譜圖

2.3 樣品前處理方法

2.3.1 提取溶劑的選擇

由于LAE易溶于水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，所以分別選擇水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯分別作為提取溶劑，考察了這4種不同提取溶劑對(duì)新鮮水果和蔬菜中LAE的提取效果。本試驗(yàn)選取新鮮蘋果為基質(zhì)樣品，將樣品粉碎成漿狀，稱取2.5 g試樣并向其中加入10 μg/kg的LAE標(biāo)準(zhǔn)品，分別選用水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶劑，然后對(duì)其進(jìn)行超聲提取相同時(shí)間，重復(fù)測(cè)定6次，考察提取效率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同提取溶劑對(duì)蘋果中LAE的提取效率

4種提取溶劑均能提取蘋果中LAE。水對(duì)于LAE提取效率較差，提取不完全，乙腈和乙酸乙酯的提取效率明顯優(yōu)于甲醇，而且乙酸乙酯提取后不能直接過(guò)濾上機(jī)，涉及到濃縮換溶的問(wèn)題，不便于前處理過(guò)程；而且考察結(jié)果的精密度乙腈明顯高于甲醇和乙酸乙酯，因此本文選擇乙腈作為最終的提取溶劑。

2.3.2 超聲時(shí)間和溫度的選擇

超聲提取時(shí)間是對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較大的因素之一，因此選取了不同的超聲時(shí)間進(jìn)行了試驗(yàn)。分別選取了5，10，15，20和30 min，在相同條件下進(jìn)行分析測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，試驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)超聲提取時(shí)間為15 min后，提取效果不再提高。所以，最終選擇最佳超聲提取時(shí)間為15 min。

表4 不同提取時(shí)間對(duì)樣品提取效率的影響

此外，還考察了溫度對(duì)提取效率的影響。分別選取了25，30和50 ℃ 3個(gè)不同溫度點(diǎn)，在相同條件下對(duì)試樣進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明3種超聲溫度下，提取效果基本相同，都能夠滿足測(cè)定要求。因此，超聲溫度沒(méi)有特別要求。

2.3.3 線性范圍與檢出限

準(zhǔn)確移取0.01，0.02，0.1，0.5，1.0和2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（0.1 mg/L）分別置于10 mL容量瓶中，用乙腈定容。各取2 μL分別按上述色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行分析。以相應(yīng)的色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)、待測(cè)組分的質(zhì)量濃度x（μg/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，經(jīng)線性回歸后求得相關(guān)系數(shù)。所得結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明待測(cè)組分在該濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系。

表5 線性范圍

根據(jù)檢出限定為響應(yīng)信號(hào)為噪音的3倍（S=3N）時(shí)所需的樣品量。定量限定義為響應(yīng)值為10倍基線噪音時(shí)所需的樣品量。當(dāng)取樣量為2.50 g，將一定濃度的LAE標(biāo)樣添加在空白基質(zhì)樣品中，定容體積為25.0 mL，在相同檢測(cè)條件下進(jìn)樣6針，按檢出限的定義分析數(shù)據(jù)如表6所示。LAE的檢出限為1.0 μg/kg，定量限為3.0 μg/kg。

表6 檢出限結(jié)果

2.3.4 方法回收率和精密度

試驗(yàn)選取2種有代表性的陰性空白樣品基質(zhì)（蘋果、青椒），分別添加低、中、高3個(gè)濃度水平（1.0，2.0和10.0 μg/kg），每一個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6次測(cè)定，其回收率和精密度結(jié)果如表7所示。從表7中可以看出，回收率范圍在GB 27404—2008標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的60%～120%之間，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜10%，能夠滿足試驗(yàn)要求。

表7 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.3.5 市售樣品分析

取空白基質(zhì)樣品30個(gè)，按照樣品處理方法對(duì)樣品處理，根據(jù)儀器分析方法，對(duì)樣品中的LAE上機(jī)分析，樣品中均未檢出月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽，可能是由于目前我國(guó)還缺乏此添加劑的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)和方法標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)銷售的新鮮水果和蔬菜沒(méi)有用其防腐保鮮。

3 結(jié)論

研究建立了一種測(cè)定新鮮水果和蔬菜中月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，此方法檢出限低、分析時(shí)間短，能夠高效準(zhǔn)確的測(cè)定新鮮水果和蔬菜中月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽的含量，希望能夠?yàn)榻窈髾z測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的開(kāi)發(fā)提供一定的技術(shù)支撐。