紫球藻蛋白和活性肽的研究進展

謝文熙，羅輝，黃永梅，雷金麗，唐曉寧，張海濤,

1. 廣東醫(yī)科大學(xué)海洋醫(yī)藥研究院（湛江 524023）；2. 廣東醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室（湛江 524023）

海洋藻類包括宏藻和微藻，是一類能進行光合作用的生物體。它們能在高鹽、低光照強度、溫度變化和營養(yǎng)缺乏等復(fù)雜的環(huán)境中生存[1]。宏藻和微藻含有豐富的多不飽和脂肪酸、多糖以及蛋白質(zhì)等，是其他海洋生物獲取食物的能量來源，也是海洋的初級生產(chǎn)者。目前，海洋藻類的研究熱門對象有螺旋藻、小球藻、龍須菜和雨生紅球藻等。有研究表明蛋白質(zhì)在這些藻類含量中比例可觀，占10%～71%不等[2]。且這些藻類源性的蛋白質(zhì)具有天然無毒、功能多樣等特點，既能作為天然色素蛋白應(yīng)用于食品色素添加、化妝品和染料等[3]行業(yè)，又可作為熒光試劑，用于免疫化學(xué)、生物工程等科研范圍[4]。紫球藻作為紅藻門的微藻代表，國內(nèi)外學(xué)者主要關(guān)注于其脂肪酸和多糖的活性研究，而對紫球藻蛋白質(zhì)的研究仍聚焦在生物合成方面，其活性應(yīng)用的報道偏少。就紫球藻蛋白質(zhì)的分類特征、分離純化，以及紫球藻源性的蛋白質(zhì)和多肽的活性及應(yīng)用進行分析，以期尋找有利于人類健康和具有開發(fā)利用前景的蛋白質(zhì)和生物活性肽。

紫球藻是一類單細胞的海洋微藻，屬于紅藻門（Rhodophyta），紅毛菜綱（Bangiophyceae），紫球藻目（Porphtridiales），紫球藻科（Porphyridiaceae），紫球藻屬（Porphyridium）。紫球藻細胞呈球形，細胞外被一層水溶性黏多糖形成黏質(zhì)鞘，使多個細胞粘附聚集成團，所以在液體培養(yǎng)基中可見紫球藻附壁生長或成塊狀沉淀。紫球藻細胞內(nèi)中央?yún)^(qū)是一個星狀的紅色載色體，內(nèi)含大量的色素，如藻紅素、藻藍素、葉綠素、胡蘿卜素和葉黃素等。因紫球藻細胞載色體內(nèi)含藻紅素最多，紫球藻細胞呈深紅色[5]。紫球藻可以生成多種生物活性物質(zhì)，如硫酸酯多糖、多不飽和脂肪酸以及藻膽蛋白等[6]。

1 紫球藻蛋白的結(jié)構(gòu)特性

紫球藻藻膽蛋白（Phycobiliprotein，PBP）是一種親水性的色素蛋白，它是由藻膽素（Phycobilin，PB）[7]和脫輔基蛋白通過硫醚鍵共價交聯(lián)構(gòu)成[5]，屬于藻類特有的捕光系統(tǒng)。藻膽蛋白根據(jù)結(jié)構(gòu)和光譜特性的不同可分為藻紅蛋白（Phycoerythrin，PE），波長540～570 nm；藻藍蛋白（Phycocyanin，PC），波長610～620 nm；異藻藍蛋白（Allophycocyanin，A-PC），波長650～655 nm[8]。

紫球藻細胞內(nèi)的載色體中含有豐富的藻紅蛋白，可達紫球藻總蛋白量的84%。根據(jù)藻紅蛋白的吸收光譜，可以分為三大類：R-藻紅蛋白，B-藻紅蛋白和C-藻紅蛋白[9]。藻紅蛋白是由α、β、γ3種亞基組成的（αβ）6-γ六聚體，α和β亞基分子量為17～20 kDa，γ亞基的分子量為30～33 kDa。α、β亞基上的藻紅膽素分別與脫輔基半胱氨酸結(jié)合形成色素體，而γ亞基與另一種未知的膽色素連接形成色素體[10]。因此，藻紅蛋白的特征吸收光譜在540和565 nm各有一個吸收峰，在498 nm處有一個峰肩[11]。γ亞基處于六聚體的中心位置，連接α和β亞基，對于維持藻紅蛋白的穩(wěn)定有重要的意義。

2 紫球藻蛋白及活性肽的生物合成與分離純化

2.1 紫球藻蛋白的生物合成與生長影響因素

紫球藻內(nèi)的亞鐵血紅素是藻膽蛋白的合成起點。亞鐵血紅素在血紅素氧化酶和鐵氧化酶家族的作用下，生成藻膽素。藻膽素在裂合酶的催化下，與脫輔基蛋白結(jié)合成藻膽蛋白。藻膽蛋白作為捕光蛋白系統(tǒng)，將吸收的光能傳遞至反應(yīng)中心進行光合作用，促進紫球藻的生長[12]。

紫球藻的生長受溫度、光照強度、氮鹽以及各種金屬微量元素等因素影響[13]。目前用于紫球藻生長的培養(yǎng)基主要為f/2海水培養(yǎng)基、ASW培養(yǎng)基等。學(xué)者們在這些培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，嘗試改變碳源、氮源、緩沖體系、微量元素等的構(gòu)成比例，均可促進藻細胞生長和形成不同代謝產(chǎn)物[14]。多項研究結(jié)果顯示，高強度的光照[15]以及在一定范圍內(nèi)提高培養(yǎng)液中氮鹽濃度[16-17]、磷酸鹽濃度[14]和微量元素如三價鐵離子[18]的濃度，均有利于紫球藻細胞中藻紅蛋白的積累。有學(xué)者認(rèn)為眾多營養(yǎng)因素中，磷酸鹽緩沖系統(tǒng)對藻紅蛋白的生物量影響最大[14]。此外，B-藻紅蛋白的積累也受pH的影響。當(dāng)pH小于2或大于12時，藻紅蛋白均可發(fā)生降解[19]。當(dāng)pH接近7時，B-藻紅蛋白是高度穩(wěn)定的。即使在室溫下放置25 d后，其吸光度和熒光也僅是損失20%[20]，其穩(wěn)定性有利于藻紅蛋白在商業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。

2.2 紫球藻蛋白及活性肽的分離和純化

因紫球藻藻膽蛋白為藻細胞內(nèi)的水溶性蛋白，所以細胞破碎技術(shù)直接影響藻膽蛋白的分離純化效率。目前，紫球藻蛋白的提取主要分為細胞破碎、藻蛋白分離和藻蛋白純化三大步（圖1）。

圖1 紫球藻藻蛋白分離純化路線

目前藻細胞的破碎主要依靠物理破碎。其中，超聲波破碎法耗時短，效率高，且有利于維持藻膽蛋白熒光性質(zhì)的穩(wěn)定[21]。反復(fù)凍融法操作簡便，藻蛋白得率較高[22]，但耗時長，效率低。有學(xué)者認(rèn)為，采用反復(fù)凍融法破碎細胞會導(dǎo)致藻膽體解體[23]。所以在研究藻膽體這一特殊結(jié)構(gòu)時，不宜選用反復(fù)凍融法提取藻膽蛋白。珠磨法和液氮研磨法[17,24]雖然成本低，破壁效果好，但耗時長易致蛋白失活。因此，合理組合不同的細胞破碎法，可優(yōu)化下一步藻蛋白的提取條件。

藻細胞破碎后所得的藻蛋白純度低，需要進一步分離純化。硫酸銨鹽析法是比較常見的蛋白沉淀法。其成本低，不易破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但提取的蛋白純度低。膜超濾法可通過分子篩的作用除去無機鹽和小分子雜質(zhì)，分段截留不同分子量的蛋白質(zhì)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。離子交換層析法是利用不同蛋白質(zhì)等電點的差異，梯度洗脫蛋白。此方法成本高，但提取量大，蛋白純度高，耗時短，已成為常用的分離純化方法。雙水相萃取法是目前較新的蛋白純化方法。即在特定條件下，將水溶性蛋白從一個水相轉(zhuǎn)移到另一個水相中，從而分離目標(biāo)蛋白。它具有操作時間短、蛋白回收率高、可濃縮蛋白的優(yōu)點。

合理的組合純化方法可提高藻蛋白的純度，但藻蛋白的回收率也會相應(yīng)減少。有學(xué)者組合鹽析法、超濾法和層析法純化藻紅蛋白，可使其純度達5.21，回收率為39.2%[17]?；蛘咴诔Ｒ姷募兓A(chǔ)上，結(jié)合新型的殼聚糖吸附法粗提，再進一步離子交換層析純化，可獲得純度達到5.1的藻紅蛋白，回收率達68.5%[25]。這些結(jié)果可作為參考依據(jù)指導(dǎo)工業(yè)化生產(chǎn)分析級的藻紅蛋白。此外，有學(xué)者提倡綠色環(huán)保的純化方法，應(yīng)用300 MPa的高靜水壓在5 min內(nèi)提取紫球藻中的B-藻紅蛋白[26]，對B-藻紅蛋白含量和結(jié)構(gòu)影響不大。

3 紫球藻蛋白及多肽的生物活性與應(yīng)用

3.1 天然色素

紫球藻含有豐富的藻紅蛋白，這種天然色素著色能力強、天然無毒，可作為食用性色素用于食品加工，如果凍、糕點、飲料等。此外，由于具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性[20]，B-藻紅蛋白可用于生產(chǎn)口紅、眼影等著色性化妝品[27]。

3.2 熒光探針用于輔助診斷

熒光探針是一類具有特征性激發(fā)光譜，可與核酸、蛋白質(zhì)等大分子結(jié)合，而發(fā)生熒光性質(zhì)改變的物質(zhì)。藻紅蛋白具有較高的熒光量子產(chǎn)率，且熒光性質(zhì)穩(wěn)定，是理想的非放射性標(biāo)志物。其stroke位移高達79 nm，且與生物大分子結(jié)合后不變性，而一般熒光劑的stroke位移小于30 nm，且有一定的毒性。因此，藻紅蛋白可代替放射性同位素，作為天然無毒的熒光探針廣泛應(yīng)用到臨床診斷和科研中[3,28]。有學(xué)者用多克隆抗體交聯(lián)法把R-藻紅蛋白和純化的禽流感病毒H9亞型結(jié)合，并以制備的R-藻紅蛋白熒光探針標(biāo)記抗體，來檢測禽流感病毒H9尿囊毒，其檢測靈敏度高于FITC標(biāo)記探針。因此，R-藻紅蛋白可與FITC等傳統(tǒng)熒光染料結(jié)合應(yīng)用，或直接將其替代用于多色熒光免疫檢測[29]。另外，小鼠抗人CD4/CD8單克隆抗體用R-藻紅蛋白標(biāo)記，可檢測正常人外周血淋巴細胞表面CD4抗原和CD8抗原的表達[30]，且被標(biāo)記的抗CD4/CD8單抗特異性保持完好，熒光強度較高，可以形成單色或合用其他熒光染料標(biāo)記的CD系列單抗組成雙色、多色的熒光試劑，輔助診斷免疫性疾病。

3.3 光動力學(xué)治療腫瘤

光動力學(xué)療法，是指進入體內(nèi)的光敏劑在特殊激發(fā)光的作用下誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡的治療方法。藻紅蛋白作為高熒光量子產(chǎn)率的光敏劑，當(dāng)它被生物體獲取后，可經(jīng)過一定波長的激活產(chǎn)生激發(fā)態(tài)氧分子。這種單線態(tài)氧可親和性結(jié)合腫瘤細胞，并在腫瘤細胞內(nèi)蓄積進而殺傷腫瘤細胞，對正常細胞損傷卻比較小。已有學(xué)者以藻紅蛋白作為光敏劑進行光動力體外實驗，該光敏劑對8113人口腔上皮癌細胞株、7721肝癌細胞株和S180小鼠腹水瘤細胞株殺傷效果均較明顯[31]。另有研究表明藻紅蛋白對人結(jié)腸癌SW-480細胞有較強的抑制作用，可以誘導(dǎo)其凋亡[32]。

此外，藻藍蛋白作為光敏劑聯(lián)合光動力療法，可以促進荷MCF-7瘤小鼠體內(nèi)癌細胞[33]和MDA-MB-231乳腺癌細胞[34]凋亡，提示了藻藍蛋白在腫瘤光動力療法中亦有發(fā)展空間。

有學(xué)者從紅毛藻中酶解獲得血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制肽，其氨基酸序列為ALLAGDPSVLEDR，來源于R-藻紅蛋白β-亞基。該ACE抑制肽對Hep G2肝癌細胞、SMMC 7721肝癌細胞、Caco-2結(jié)腸癌細胞的增殖具有很好的抑制作用[35]。

3.4 抗動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化是脂質(zhì)代謝障礙類血管疾病如冠心病、腦梗死等的基礎(chǔ)病變。動脈粥樣硬化泡沫細胞形成是該病變的起點。RAW 264.7細胞系分泌的炎性因子是促進動脈粥樣硬化泡沫細胞形成的重要因素。有學(xué)者分別從紫球藻總蛋白和純化的藻紅蛋白中，分離出組氨酸-谷氨酸（HE）和甘氨酸-脯氨酸（GP）兩種二肽。這兩種肽在非細胞毒性濃度下作用于RAW 264.7細胞系，可降低其TNF-α和IL-6炎性因子的分泌，從而減少泡沫細胞的形成，起到預(yù)防動脈粥樣硬化的作用。分子相互作用的研究發(fā)現(xiàn)，這兩種肽是以CD36、SRA1和Map激酶p38（一種蛋白介質(zhì)）作為靶點結(jié)合。其中，甘氨酸-脯氨酸（GP）在預(yù)防抗動脈粥樣硬化泡沫細胞形成作用最強[36]。

3.5 抗氧化

目前，癌癥、衰老和某些疾病的發(fā)生與體內(nèi)氧自由基的大量積蓄有關(guān)已成為共識。環(huán)境污染和輻射等都可使體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生增加，進而損害人體正常細胞和組織。具有抗氧化活性的生物分子越來越受到食品工業(yè)、醫(yī)藥和制藥等領(lǐng)域的關(guān)注。有研究結(jié)果表示，藻紅蛋白的α和β亞基分別含有約50%和52%的疏水性氨基酸（ala、cys、ile、leu、met、phe、pro、trp、tyr、val）。疏水性氨基酸具有重要的抗氧化作用，因為它們能夠提供質(zhì)子和生成金屬離子而具有還原能力。B-藻紅蛋白的α和β亞基分別有38和33個帶電荷殘基，這些氨基酸殘基可作為電荷供體螯合自由基和金屬離子[37]。有研究將紫球藻中純化的藻紅蛋白用于不同的抗氧化試驗，如DPPH清除活性試驗、亞鐵離子螯合試驗、β-胡蘿卜素漂白試驗和O2-、ABTS+還原力試驗等[31,38]。結(jié)果表明，純化的藻紅蛋白有一定的抗氧化能力，其抗氧化能力是電子供體氨基酸組成的螯合能力的結(jié)果，有望作為天然活性蛋白應(yīng)用于化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域。

3.6 基因工程

紫球藻蛋白除了來源于藻類自身的生物合成，還可將其蛋白基因轉(zhuǎn)到基因工程宿主，進行體外重組獲得。紫球藻分離純化藻紅蛋白的步驟復(fù)雜，其純度和產(chǎn)量也受各種因素影響而不穩(wěn)定。利用基因工程技術(shù)實現(xiàn)藻紅蛋白在受體細胞中大量表達，是穩(wěn)定獲得藻紅蛋白的有效途徑。大腸桿菌、畢赤酵母菌作為原核細胞和真核細胞的代表，可與藻紅蛋白亞基重組共表達載體。有學(xué)者將紫球藻藻紅蛋白α、β亞基基因（pe A、pe B）分別插入到畢赤酵母表達載體p AO815和大腸桿菌表達載體p ET-28a中。重組的共表達載體轉(zhuǎn)入受體細胞內(nèi)，均可表達藻紅蛋白[39]。藻紅蛋白的體外重組，豐富了紫球藻基因組表達文庫的篩選流程和構(gòu)建方法，進一步指出了藻膽蛋白的異源生物合成的新思路，為藻膽蛋白的應(yīng)用開拓了空間。

3.7 染料敏化太陽能電池

染料敏化太陽能電池是以二氧化鈦和光敏燃料為主要原料，模擬自然界中植物的光合作用，將太陽能轉(zhuǎn)化為電能的一種環(huán)保捕光器件。藻膽蛋白是紫球藻的捕光天線復(fù)合物，這提示紫球藻可以通過藻膽蛋白這個捕光體系，將光能高效吸收并轉(zhuǎn)化成生物能。藻膽蛋白與連接蛋白有序結(jié)合構(gòu)成藻膽體，藻膽體能將95%以上的光能量傳遞到光反應(yīng)中心。近年來，藻膽蛋白的基因工程構(gòu)建重組，為生物傳感器開辟了新途徑[40]。染料敏化太陽能電池效率的高低，主要由生物染料敏化劑原料決定?，F(xiàn)階段，天然的生物染料敏化劑較常見的問題主要集中在較窄的光譜響應(yīng)范圍和低量子產(chǎn)率等方面。有研究表明，用B-藻紅蛋白作為染料敏化二氧化鈦光陽極，其分子量小，在染料敏化太陽能電池的光電陽極上的吸附效果好，可以提高染料敏化太陽能電池的光電性能[12]。這不僅為研究藻膽蛋白的結(jié)構(gòu)和功能提供了新的途徑，也為生物染料敏化太陽能電池的進一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)語

紫球藻蛋白質(zhì)的分離純化技術(shù)發(fā)展成熟，并已進入了體外重組的水平。紫球藻蛋白質(zhì)的應(yīng)用亦涉及食品、工業(yè)、科研和醫(yī)療等行業(yè)。但紫球藻蛋白質(zhì)的活性研究只限于藻膽蛋白尤其是藻紅蛋白這一類大分子蛋白質(zhì)，而鮮少關(guān)注小分子多肽。蛋白質(zhì)衍生物、小分子活性肽和氨基酸等小分子，因結(jié)構(gòu)特殊，在人體內(nèi)代謝快，不易沉積，已成為新型活性物質(zhì)用于保健品和藥物治療等領(lǐng)域。這些小分子藥物比常規(guī)藥物具有更高的生物利用度和靶點特異性。紫球藻等藻類的小分子蛋白天然無毒，在藥物、保健品和護膚品等領(lǐng)域的產(chǎn)品研發(fā)，具有很大的潛力和寬闊的前景。