鳀魚活性肽制備及其α-糖苷酶抑制活性初步研究

勞敏軍，周小敏，李英，朱燕芳

浙江興業(yè)集團有限公司（舟山 316101）

鳀魚（Engraulis japonicus）是鳀屬（Engraulis）魚類的統(tǒng)稱, 主要分布于南北半球溫帶水域, 占世界水產(chǎn)品產(chǎn)量的10%～20%, 。中國鳀魚資源豐富, 蘊藏量280萬～300萬 t, 年可捕量50萬 t以上[1-3]。鳀魚營養(yǎng)價值較高, 蛋白質(zhì)含量15%～20%, 是優(yōu)質(zhì)動物蛋白的重要來源[2,4], 由于鳀魚個體較小, 出水后極易破肚, 進而腐敗變質(zhì), 因而鳀魚的傳統(tǒng)加工方式是制作魚粉, 附加值低且對環(huán)境造成嚴重污染, 因此進一步挖掘鳀魚蛋白中的功能多肽, 對于提高鳀魚的價值具有重要意義[5-6]。

糖尿病是一種因體內(nèi)胰島素絕對或相對分泌不足而引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂的慢性全身性疾病[7-8]。有資料表明：到2030年, 全球糖尿病患者將增長到4.39億[9], 糖尿病成為21世紀全世界最重要的健康問題之一。α-葡萄糖苷酶抑制劑是一類以延緩腸道碳水化合物吸收而達到降低餐后血糖治療糖尿病的口服降糖藥物, 如阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇, 但這類藥物會導(dǎo)致腸胃氣脹、腹瀉及腹痛等, 因此, 尋找新穎、無副作用、有效安全的α-糖苷酶抑制劑對于治療糖尿病具有重要意義[10-12]。胡曉飛等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者服用鳀魚提取物（魚醬油）后血糖有所降低, 鳀魚提取物能提高受試小鼠的糖耐受水平, 但由于魚醬油鹽度過高, 限制食用人群范圍, 因此, 以鳀魚為原料, 制備抑制α-糖苷酶活性多肽、開發(fā)降血糖類功能性食品具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要原料

鳀魚原料（浙江興業(yè)集團有限公司提供，一半于-20 ℃冰柜冷凍保存，另一半將其二次細切處理以保證原料的均勻一致，分裝后置于-20 ℃冰柜冷凍保存）。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（安捷倫）；H2050R-1高速冷凍離心機（長沙湘儀集團）；DGG-9620AD型電熱恒溫鼓風干燥機（上海森信實驗儀器有限公司）；EMS-8B磁力攪拌器（天津市榮譽儀器有限公司）；ELX808酶標儀（美國伯騰儀器）；JA2003分析天平（上海方瑞儀器有限公司）；TQ-5型臺式細切機（廣東番禺市恒聯(lián)食品機械廠）；W5-100 SP數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海申生科技有限公司）；LGJ型冷凍干燥機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；KDA-08A自動凱氏定氮儀（上海昕瑞儀器儀表有限責任公司）等。

1.1.3 主要試劑

米椛（大連松井食品有限公司）；4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（源葉生物）；α-葡萄糖苷酶（Sigma）；阿卡波糖（拜耳醫(yī)藥保健有限公司）；水解蛋白酶（alcalase 2.4 L）、風味蛋白酶（Flavourzyme 1 000 L）均為食品級（丹麥諾維信公司）；0.01 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8）；0.2 mol/L Na2CO3；牛血清蛋白、RNase A、抑肽酶、維生素B12、慶大霉素（北京迪郎生化科技有限公司）；乙腈、三氟乙酸（國藥集團化學試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 鳀魚理化性質(zhì)分析

采用常壓干燥法測定鳀魚水分，參照G B/T 5009.3—2010；采用干法灰化法測定鳀魚灰分，參照GB/T 5009.4—2010；索氏提取法測定鳀魚脂肪，參照GB/T 5009.6—2003；采用凱氏定氮法測定鳀魚蛋白質(zhì)，參照GB/T 5009.5—2010。

1.2.2 鳀魚酶解工藝流程

鳀魚解凍，稱取150 g鳀魚碎肉于500 mL燒杯中，按料水比1∶1.5（g/mL）加水，攪拌均勻，根據(jù)蛋白酶的水解特點，選擇水解蛋白酶（內(nèi)切酶）進行酶解，酶解條件為：pH 8，酶添加量為底物質(zhì)量的0.2%，55 ℃酶解4 h。選擇風味蛋白酶（外切酶）進行酶解，酶解條件為：pH 6，酶的添加量為底物質(zhì)量的0.4%。55 ℃酶解5 h后，酶解結(jié)束后將燒杯置于85℃水中滅酶處理20 min，取出冷卻至室溫，離心取上清液記錄質(zhì)量和體積，分裝于-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 鳀魚發(fā)酵工藝

鳀魚解凍，稱取5 kg鳀魚于10 L發(fā)酵罐中，添加1.5%米椛、20%鹽，罐頂部用150 g食鹽進行鹽封，發(fā)酵罐置于28 ℃恒溫室內(nèi)發(fā)酵6個月，發(fā)酵結(jié)束后過濾得到發(fā)酵液備用。

1.2.4 酶解液、發(fā)酵液氨基態(tài)氮和全氮含量測定

氨基態(tài)氮含量測定方法參照GB 5009.235—2016，采用凱氏定氮法測定鳀魚全氮含量。

1.2.5 鳀魚多肽凍干粉的制備

按照上酶解發(fā)酵條件制備鳀魚酶解液和鳀魚發(fā)酵液，經(jīng)100 D透析袋透析48 h后，進行冷凍干燥，條件為-60 ℃、0.005 mBar、48 h。

1.2.6 酶解液對α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

參照Rivera-Chávez[10]、Hyun[11]和Uraipong等[15]方法并略作修改。分別配制0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8），1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mmol/L PNPG（4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷）溶液，0.5和1.0 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，0.2 mol/L Na2CO3溶液。反應(yīng)試劑按照表1依次添加，利用酶標儀測定405 nm波長處的吸光度，并計算抑制率，以阿卡波糖作為陽性對照。

表1 各反應(yīng)物添加劑量和順序

1.2.7 鳀魚多肽分子量的測定[16]

色譜條件：色譜柱TsK gel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，流動相為乙腈-水-三氟乙酸30∶70∶0.1（體積比）。

樣品制備：以流動相為溶劑配置濃度5.00 mg/mL的樣品，微孔濾膜（0.45 μm）過濾后進樣。

標準品的制備：將牛血清蛋白（Mr 66430）、RNase A（Mr 13700）、抑肽酶（Mr 6500）、維生素B12（Mr 1355）、慶大霉素（Mr 576）配成混標，每種物質(zhì)含量均為5.00 mg/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 鳀魚理化性質(zhì)分析

由表2可知，鳀魚除水分外，蛋白質(zhì)含量最高，為18.62%，其次是脂肪和灰分，分別為8.61%和2.67%，說明鳀魚是良好的動物性蛋白來源。

表2 鳀魚原料主要成分分析

2.2 酶解液氨基態(tài)氮和全氮含量測定

按照上述方法制備的鳀魚酶解液和發(fā)酵液按照GB 5009.235—2016氨基態(tài)氮的測定法和凱氏定氮法分別測定其氨基態(tài)和全氮含量，鳀魚酶解液和發(fā)酵液的氨基態(tài)氮分別為3.5%和10.0%，全氮含量分別為12.5%和13.5%，鳀魚發(fā)酵液水解度較高。

2.3 鳀魚活性肽對α-糖苷酶的抑制能力

由圖1可知，鳀魚酶解液和發(fā)酵液在0.25～2.00 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著濃度增加，對α-糖苷酶的抑制作用逐漸增強，鳀魚酶解液抑制率分別為17.58%，22.63%，25.54%和33.94%，鳀魚發(fā)酵液抑制率分別為13.49%，19.81%，25.52%和28.45%，阿卡波糖為藥物對照。在這一濃度范圍內(nèi)，鳀魚酶解液對α-糖苷酶抑制作用略高于鳀魚發(fā)酵液，由于酶解和發(fā)酵是2種不同處理機制，所以得到的活性肽的種類和大小存在差異，進而說明鳀魚中存在豐富的α-糖苷酶抑制活性肽。

圖1 相對α-糖苷酶活力檢測

2.4 鳀魚活性肽的分子量分布

結(jié)果表明，鳀魚酶解液對α-糖苷酶抑制作用略高于鳀魚發(fā)酵液，因為酶解法制備活性肽可以在短時間內(nèi)高效完成，因此，選擇鳀魚酶解液進行分析。選用牛血清蛋白、RNase A、抑肽酶、維生素B12、慶大霉素5種標準品進行HPLC分析，根據(jù)凝膠柱滲透層析原理，分子量大的物質(zhì)先被洗脫，具體分子量、分子量對數(shù)和對應(yīng)的保留時間見表3。

表3 標準品的分子量與保留時間關(guān)系表

制作5種標準品相對分子量對數(shù)與標準品經(jīng)HPLC的保留時間的關(guān)系曲線，得到回歸方程為y=-2.877 7x+21.064（R2=0.999 5），其中x為分子量對數(shù)，y為保留時間（min）。

由圖2可以看出，鳀魚活性肽主要出現(xiàn)5個組分峰，洗脫時間分別為10.793，11.587，12.408，12.617和14.324 min，根據(jù)標準曲線計算出各峰組分的分子量分別為3 708.26，164.51，1 018.49，861.65和219.86 Da，根據(jù)峰面積計算出這5個峰的含量分別為12.40%，24.49%，13.12%，17.95%和20.87%，占總量的88.83%，見表4。

圖2 鳀魚活性肽的HPLC圖譜

表4 鳀魚活性肽分子量分布情況表

3 討論

根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）調(diào)查的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，1965—2014年，全球水產(chǎn)品產(chǎn)量穩(wěn)定增長，食用水產(chǎn)品供應(yīng)量年均增長3.2%[17]。世界水產(chǎn)品產(chǎn)量中國連續(xù)23年居于首位，水產(chǎn)養(yǎng)殖總量占全球的20%。隨著科技進步，傳統(tǒng)的加工方式無法滿足消費者對食品營養(yǎng)價值和感官品質(zhì)等方面的要求，研究顯示，酶技術(shù)特別是蛋白酶對改善水產(chǎn)品及其副產(chǎn)物風味、生物特性有顯著效果[18]。伴隨現(xiàn)代文明而來的各種富貴病如高血壓、高血脂、糖尿病和癌癥等越來越引起關(guān)注，消費觀念從吃飽吃好轉(zhuǎn)向防病治病，在這種形式下，功能性食品越來越受到青睞。

以鳀魚為研究對象，對鳀魚進行常規(guī)成分分析，得到鳀魚蛋白質(zhì)含量為18.62%；利用酶工程技術(shù)和生物發(fā)酵工程技術(shù)對鳀魚活性肽進行開發(fā)，鳀魚經(jīng)水解蛋白酶和風味蛋白酶分步酶解，得到氨基態(tài)氮和全氮含量分別為3.5%和12.5%的酶解液，鳀魚經(jīng)1.5%米椛固態(tài)發(fā)酵6個月后，得到氨基態(tài)氮和全氮含量分別為10.0%和13.5%的酶解液，鳀魚發(fā)酵液的水解度較高，但是水解周期長；經(jīng)微量板半定量法檢測鳀魚酶解液和發(fā)酵液對α-糖苷酶的抑制作用，在0.25～2 mg/mL范圍內(nèi)，隨著濃度升高，鳀魚酶解液和發(fā)酵液對α-糖苷酶抑制作用逐漸增強，且鳀魚酶解液活性略高于鳀魚發(fā)酵液，2 mg/mL時抑制率高達33.94%，由于酶工程和生物發(fā)酵工程是不同技術(shù)手段，其原理不同產(chǎn)物也存在差異，但鳀魚酶解液和鳀魚發(fā)酵液均含有良好的α-糖苷酶抑制作用，說明鳀魚中存在豐富活性多肽。由于酶解法較發(fā)酵法周期短，更利于產(chǎn)業(yè)化，因此選擇鳀魚發(fā)酵液進行分析，使用HPLC對鳀魚酶解液的分子量分布進行分析，得知酶解液中鳀魚活性肽分子量在219.86～3 708.26 Da范圍之間，分子量有12.40%分布在3 708.26 Da、24.49%分布在1 964.51 Da、13.12%分布在1 018.49 Da、17.95%分布在861.65 Da、20.87%分布在219.86 Da，分子量均在4 000 Da以下，均屬于小分子肽。綜上可知，鳀魚蛋白質(zhì)含量高，含有種類多樣的抑制α-糖苷酶的活性肽，其鳀魚酶解液制備周期短、效率高，且具有較小分子量，更易于人體吸收，具備開發(fā)降血糖保健食品的潛在優(yōu)勢，是開發(fā)降血糖功能食品的良好來源。

4 結(jié)論

試驗以鳀魚為原料, 分別采用酶工程法和生物發(fā)酵工程法進行處理, 制備了對α-糖苷酶具有抑制活性的鳀魚活性肽, 結(jié)果表明, 兩種制備方方法獲得的產(chǎn)物對α-糖苷酶均有較好的抑制效果, 其中酶法制備效率相對較高；對酶法制備產(chǎn)物進行分析后可知, 酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度在0.25～2 mg/mL范圍內(nèi), 對α-糖苷酶的抑制活性隨著濃度增加而增強, 酶解液質(zhì)量濃度在0.25,0.50, 1.00和2.00 mg/mL時, 其抑制率分別為17.58%,22.63%, 25.54%和33.94%。其分子量在219.86～3 708.26 Da范圍之間, 具有分子量小、易吸收的特點。