益生菌緩解環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫功能低下①

田 艷 劉青青 田海霞 謝 宜 樊衛(wèi)平

(山西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，太原 030001)

抗腫瘤化療藥在抗腫瘤的同時(shí)，往往抑制血細(xì)胞增殖而降低機(jī)體免疫功能?？勾x類化療藥物環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)通過抑制快速增殖的血細(xì)胞(包括各類免疫細(xì)胞)DNA合成從而廣泛抑制造血和免疫細(xì)胞增殖以降低免疫功能。惡心嘔吐、血細(xì)胞減少、免疫力低下等副作用是患者放棄化療的主要原因。緩解化療副作用、改善化療所致免疫低下、提高患者耐受力在抗腫瘤治療中具有重要意義。益生菌具有拮抗致病菌、促進(jìn)營養(yǎng)、改善代謝的作用，通過腦腸軸、肝腸循環(huán)等多途徑多機(jī)制改善機(jī)體功能狀態(tài)，提高免疫力[1]。益生菌在腸道黏膜疾病、自身免疫病及腫瘤中的有益作用已多有報(bào)道[2-4]。雙歧桿菌和乳桿菌作為最常見的益生菌備受關(guān)注。陸文偉等[5]研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌可促進(jìn)CTX所致急性免疫低下小鼠IL-1、IL-6產(chǎn)生，增強(qiáng)免疫力。Reyna-Figueroa等[6]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充益生菌可減少急性白血病患者化療引起的胃腸道副作用。Tian等[7]研究發(fā)現(xiàn)腸道益生菌可提高化療后肺癌患者的白細(xì)胞水平，并降低腹瀉等副作用。本課題擬探索包含多種雙歧桿菌和乳桿菌的復(fù)合益生菌制劑對CTX所致單純免疫功能低下小鼠的血象、胸腺及脾臟指數(shù)、T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖指數(shù)、脾細(xì)胞中CD4和CD8細(xì)胞百分率、CD4/CD8及脾細(xì)胞凋亡率的影響，明確益生菌可否緩解CTX所致免疫功能低下，為臨床化療前后益生菌調(diào)節(jié)機(jī)體狀態(tài)、拮抗化療導(dǎo)致的免疫功能低下提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 清潔級雄性C57BL/6小鼠24只，6周齡，體質(zhì)量(20±1)g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：SCXK(晉)2015-0001。

1.1.2主要試劑 益生菌凍干粉(乳雙歧桿菌HN019、兩歧雙歧桿菌Bb06、動物雙歧桿菌BB-2、乳雙歧桿菌Bi07、長雙歧桿菌R175、動物雙歧桿菌B94、鼠李糖乳桿菌GG、干酪乳桿菌LC11、瑞士乳桿菌R52、副干酪乳桿菌Lpc37、植物乳桿菌L1012、羅伊式乳桿菌HA88、鼠李糖乳桿菌R11、嗜酸乳桿菌NCFM、嗜熱鏈球菌St21、每克含一百億菌落形成單位活菌)由中科宜康(北京)生物科技有限公司惠贈；注射用環(huán)磷酰胺(CTX)購自百特國際有限公司(批號：8E242E)；Anti-mouse CD4 PE-Cy5、Anti-mouse CD8 PE購自美國eBioscience公司；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購自北京四正柏生物公司；MTT及脂多糖(LPS)購自北京索萊寶公司；刀豆蛋白A(ConA)購自美國Sigma公司。

1.1.3主要儀器 流式細(xì)胞儀購自美國Beckman公司；微量移液器購自德國Eppendorf公司；酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司；顯微鏡購自Leica公司。

1.2方法

1.2.1動物造模及給藥 24只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對照組、CTX組和益生菌+CTX組，每組8只。對照組和CTX組小鼠灌胃生理鹽水[0.2 ml/(只·d)]，益生菌組灌胃同體積益生菌[0.75 g，75億菌落形成單位活菌/(只·d)]，連續(xù)灌胃20 d，在第15～17天，CTX組及益生菌+CTX組連續(xù)3 d腹腔注射CTX 50 mg/(kg·d)。

1.2.2血常規(guī)檢測 第21天采集小鼠EDTA-K2抗凝血，全自動血細(xì)胞分析儀檢測血常規(guī)。

1.2.3體質(zhì)量及胸腺、脾臟指數(shù)檢測 小鼠稱重記錄后頸椎脫臼處死，無菌取胸腺、脾臟并稱重。計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)×10；脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)×10。

1.2.4T、B細(xì)胞增殖功能檢測 無菌收集小鼠脾細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml，取100 μl于96孔板，分別加入含ConA(終濃度為5 μg/ml)和LPS(終濃度為10 μg/ml)的1640培養(yǎng)液100 μl，同時(shí)設(shè)陰性對照，37℃，5%CO2培養(yǎng)72 h后加MTT(5 mg/ml)20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心培養(yǎng)板，棄上清，加DMSO 150 μl/孔，振蕩，570 nm測OD值，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，結(jié)果以刺激指數(shù)表示。刺激指數(shù)(SI)=刺激孔(加ConA或LPS)OD值/對照孔OD值。

1.2.5CD4和CD8陽性細(xì)胞比例及CD4/CD8檢測 無菌收集小鼠脾細(xì)胞，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml，取200 μl于流式管，加CD4和CD8熒光抗體孵育30 min，PBS洗滌后200 μl重懸，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4和CD8陽性細(xì)胞占脾淋巴細(xì)胞的比例，并計(jì)算CD4/CD8。

1.2.6脾細(xì)胞凋亡檢測 無菌收集小鼠脾細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml，取200 μl細(xì)胞于流式管，加Binding buffer 100 μl，按照說明書加入5 μl Annexin-V和10 μl PI染色，流式細(xì)胞儀檢測脾淋巴細(xì)胞凋亡。

2 結(jié)果

2.1小鼠體質(zhì)量及免疫器官指數(shù)檢測結(jié)果 與對照組比較，CTX組體質(zhì)量、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均降低(P<0.05)。而經(jīng)益生菌處理小鼠后體質(zhì)量、胸腺指數(shù)較CTX組顯著增加(P<0.05)，脾臟指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但益生菌+CTX組的體重和胸腺指數(shù)依然低于對照組(P<0.05)，脾臟指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1、表1。

2.2血常規(guī)檢測結(jié)果 CTX組紅細(xì)胞、白細(xì)胞數(shù)量顯著低于對照組(P<0.05)，血小板差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而益生菌+CTX組的白細(xì)胞及血小板數(shù)量較CTX組升高(P<0.05)，紅細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與對照組相比，紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)仍偏低(P<0.05)，見圖2、表2。

圖1 小鼠體質(zhì)量及免疫器官指數(shù)檢測結(jié)果Fig.1 Results of weight,spleen index and thymus indexNote:*.P<0.05;**.P<0.01;****.P<0.000 1.

表1 小鼠體質(zhì)量及免疫器官指數(shù)檢測結(jié)果

圖2 血常規(guī)檢測結(jié)果Fig.2 Results of peripheral blood cells countNote:*.P<0.05;**.P<0.01;****.P<0.000 1.

表2 小鼠血常規(guī)檢測結(jié)果

圖3 T、B細(xì)胞增殖功能檢測結(jié)果Fig.3 Results of proliferation index of T and B cellsNote:*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001.

表3 T、B細(xì)胞增殖功能檢測結(jié)果

圖4 CD4、CD8陽性細(xì)胞比例及CD4/CD8檢測結(jié)果Fig.4 Ratios of CD4+，CD8+ cell in spleen lymphocytes and ratios of CD4/CD8Note:*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001;****.P<0.000 1.

圖5 小鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果Fig.5 Results of ratio of apoptosis in spleen lymphocytesNote:**.P<0.01,***.P<0.001.

2.3T、B細(xì)胞增殖功能檢測 MTT法檢測脾淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，CTX組T、B細(xì)胞增殖指數(shù)均明顯低于對照組(P<0.05)，益生菌處理后T細(xì)胞增殖指數(shù)顯著提高(P<0.001)，已達(dá)到正常組水平(P>0.05)，B細(xì)胞增殖指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，依然低于對照組(P>0.05)。表明益生菌可促進(jìn)免疫低下小鼠T細(xì)胞增殖，見圖3、表3。

2.4CD4、CD8陽性T細(xì)胞比例及CD4/CD8檢測 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，CTX組CD4 T細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞占脾淋巴細(xì)胞的百分率及CD4/CD8均低于對照組(P<0.05)，益生菌治療后以上指數(shù)均升高(P<0.05)，接近正常組水平(P>0.05)，見圖4。

2.5小鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡檢測 CTX組脾淋巴細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，益生菌治療后脾淋巴細(xì)胞凋亡等比例降低(P<0.01)，接近對照組水平(P>0.05)，見圖5。

3 討論

CTX作為抗代謝促凋亡化療藥已廣泛用于腫瘤治療，但其在殺傷腫瘤細(xì)胞同時(shí)會抑制正常免疫細(xì)胞功能，造成免疫低下及繼發(fā)感染。本研究結(jié)果表明50 mg/kg CTX連續(xù)3 d腹腔注射可顯著降低小鼠外周血紅細(xì)胞及白細(xì)胞數(shù)量，降低胸腺及脾臟指數(shù)，降低T、B細(xì)胞增殖指數(shù)，降低CD4、CD8細(xì)胞比例及CD4/CD8，促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡，成功建立小鼠急性免疫功能低下模型，與CTX抗代謝促凋亡的藥理作用一致[8,9]。包含多種雙歧桿菌和鏈球菌的復(fù)合益生菌0.75 g/(只·d)灌胃干預(yù)治療后可一定程度拮抗CTX造成的免疫功能極度低下狀態(tài)，使小鼠體質(zhì)量增加，外周血白細(xì)胞、血小板數(shù)量、胸腺指數(shù)升高，也能促進(jìn)T細(xì)胞增殖，提高CD4和CD8 T細(xì)胞占脾細(xì)胞的比例，提高CD4/CD8，減少脾淋巴細(xì)胞凋亡，緩解CTX造成的免疫功能低下，使其接近正常水平。但研究結(jié)果提示益生菌對脾臟指數(shù)、B細(xì)胞增殖指數(shù)的改善沒有作用，且脾臟中CD4和CD8陽性細(xì)胞比例的提高提示B細(xì)胞比例下降。因此推測益生菌可能主要通過提高T細(xì)胞功能拮抗CTX所致的免疫功能低下，機(jī)制可能與腸道微生物代謝調(diào)節(jié)宿主免疫功能有關(guān)[10]。也可能與益生菌增加腸黏膜完整性、減少有害菌侵入、降低腸道炎癥反應(yīng)有關(guān)。Veiga等[11]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌GG可產(chǎn)生2種可溶性蛋白p40和p75，保護(hù)上皮細(xì)胞免受凋亡，從而增加黏膜完整性，防止病原菌入侵，降低盲腸pH值，增加乳酸和丁酸鹽消耗細(xì)菌的相對數(shù)量，減少腸道炎癥。復(fù)合益生菌提高CTX化療后小鼠免疫功能的具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

本研究通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了益生菌可拮抗CTX所致免疫功能低下，為臨床化療后益生菌調(diào)節(jié)機(jī)體狀態(tài)、拮抗化療導(dǎo)致的免疫低下提供了依據(jù)，也間接證實(shí)補(bǔ)充益生菌有助于提高患者化療耐受性，提高患者生存質(zhì)量。