中藥多糖成分前處理及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

周偉娥，周學(xué)鋒，王宇陽，凌 云，李 平,3*，張 峰*

(1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 食品安全研究所，北京 100176；2.中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，免疫炎性疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 研究生院，北京 100730)

糖類屬于多羥基或多羥基酮及其衍生物或聚合物，包括單糖、寡糖和多糖，是廣泛存在于中藥中的有機(jī)化合物[1]。單糖是該類物質(zhì)的基本單元，可通過共價(jià)鍵結(jié)合生成寡糖和多糖[2]。其中多糖類化合物具有廣泛的生物活性。大量研究表明，中藥多糖具有降血脂、降血糖、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗凝血、抗炎癥、抗衰老等生物活性[3]，是近年來中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究重點(diǎn)，具有廣闊的新藥開發(fā)前景[4]。但該類成分具有極性強(qiáng)、分子量大、結(jié)構(gòu)難確證等特點(diǎn)，成為中藥多糖定性定量分析的難點(diǎn)以及新藥開發(fā)的瓶頸[5]。本文綜述了近10年關(guān)于中藥多糖的前處理和檢測(cè)方法，前處理方法包括提取方法和分離凈化技術(shù)，檢測(cè)方法包括檢測(cè)技術(shù)以及結(jié)構(gòu)分析技術(shù)。其中新型含量檢測(cè)技術(shù)包括高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)、高效陰離子交換色譜法(HPAEC)、氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)；新型結(jié)構(gòu)分析技術(shù)有傅里葉變換紅外光譜法(FTIR)、核磁共振波譜法(NMR)、高分辨質(zhì)譜法(HRMS)等，以期為中藥多糖定性定量分析和質(zhì)量控制，多糖藥物深度開發(fā)和中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的全面研究提供參考，以進(jìn)一步保證多糖藥物的臨床療效及安全性。

1 中藥多糖前處理方法

前處理技術(shù)是為了最大限度地提取、分離、凈化和富集中藥中的多糖，便于分析檢測(cè)。但由于多糖極性強(qiáng)、結(jié)構(gòu)易受破壞，且中藥基質(zhì)復(fù)雜、干擾物質(zhì)多，增大了提取和凈化難度，加之提取過程中有機(jī)試劑的用量較多，所以需尋找一個(gè)選擇性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、提取效率高、綠色環(huán)保且穩(wěn)定的前處理技術(shù)解決中藥多糖的檢測(cè)問題。目前，許多前處理技術(shù)應(yīng)用于中藥多糖成分的提取、分離和凈化，各前處理方法的優(yōu)缺點(diǎn)見表1，需要根據(jù)檢測(cè)的要求以及多糖性質(zhì)進(jìn)行選擇。

表1 中藥多糖成分的前處理方法及其優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 The advantages and disadvantages of the pretreatment method for polysaccharide in traditional Chinese medicine

1.1 提取方法

1.1.1 傳統(tǒng)提取方法熱水提取法[6]、酸堿提法[7-8]、酶提法[9]、超聲輔助法[10]、微波輔助法[11]等屬于中藥多糖傳統(tǒng)的提取方法，均以極性溶劑提取為基礎(chǔ)。這些技術(shù)主要是將中藥進(jìn)行粉粹、過篩等處理后，以水、乙醇等極性溶劑提取，并利用水浴加熱、振蕩、超聲、微波、加酶、加酸堿等提高提取效率。如王鋒等[12]將靈芝粉碎，過60目篩后，采用5%NaOH溶液進(jìn)行超聲輔助提取，再用熱水浴浸提后獲得靈芝粗多糖，采用苯酚-硫酸法測(cè)得多糖含量為67.8 mg/g，提取效率為單純的熱水提取法和超聲輔助提取法的1.5～3.0倍。可見酸堿溶液可以提高酸性糖類的提取效率且純度較高，并利于糖類與蛋白質(zhì)間結(jié)合型的轉(zhuǎn)化。此外，酶提法易受提取時(shí)間、提取溫度和pH值等因素的影響，主要通過單因素、正交實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法等試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝[7]。丁霄霄等[13]采用水浴加熱，石油醚除脂，用纖維素酶、木瓜蛋白酶和半纖維素酶復(fù)合酶恒溫水浴下輔助提取靈芝藥材，采用苯酚-硫酸法測(cè)得靈芝多糖得率為3.73%，明顯高于單純熱水提取法的得糖率(1.28%)。酶提取明顯提高了得糖率，但處理?xiàng)l件較嚴(yán)格?？傊瑐鹘y(tǒng)前處理技術(shù)具有設(shè)備要求低、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)勢(shì)，但耗時(shí)長(zhǎng)、有機(jī)溶劑用量大、共提取的雜質(zhì)較多等，增加了分離凈化的難度。

1.1.2 新型提取方法高壓脈沖電場(chǎng)輔助法、動(dòng)態(tài)高壓微射流輔助法、加速溶劑萃取法和超臨界流體萃取法屬于中藥多糖成分的新型提取方法，這些技術(shù)均需與溶劑提取相結(jié)合。與傳統(tǒng)提取方法相比，新型提取技術(shù)能夠明顯提高多糖得率，加快提取速度，且更加綠色環(huán)保。高壓脈沖電場(chǎng)輔助法和動(dòng)態(tài)高壓微射流輔助法利用高壓電場(chǎng)或大氣高壓實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥多糖的有效提取，提取時(shí)間遠(yuǎn)少于熱水提取法，多糖得率明顯高于熱水提取法。如劉航等[14]比較了高壓脈沖電場(chǎng)輔助提取法和傳統(tǒng)熱水法提取海帶多糖，結(jié)果表明，高壓脈沖電場(chǎng)輔助提取法的提取時(shí)間是傳統(tǒng)熱水提取法的1/2，多糖提取效率提高45%，降低了能耗?？苡馵15]比較了傳統(tǒng)熱水提取法與動(dòng)態(tài)高壓微射流輔助熱水法提取荷葉多糖，結(jié)果表明，兩者提取溫度相當(dāng)，而后者多糖得率高于前者，且提取時(shí)間短于前者。另外，加速溶劑萃取法是利用高溫高壓條件實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥多糖的有效提取，該法操作更簡(jiǎn)便、提取時(shí)間更短、能耗更低、多糖得率更高，但需避免高溫高壓條件對(duì)中藥多糖結(jié)構(gòu)和活性的破壞。如陳德力等[16]采用加速溶劑萃取法提取彎柄靈芝多糖，在提取溫度180 ℃，提取時(shí)間 12 min，靜態(tài)循環(huán)提取2次的最佳條件下，多糖得率為(12.66±1.05)%；與熱水提取法(0.37±0.09)%相比，提取時(shí)間縮短15倍，多糖得率提高34.22倍。而超臨界流體萃取法是在超臨界狀態(tài)下，使用綠色流動(dòng)相進(jìn)行提取、分離中藥多糖，利于環(huán)保。 如楊孝輝等[17]用乙醚脫脂，超臨界CO2流體萃取淮山多糖，在壓力35 MPa、溫度45 ℃、夾帶劑(90%乙醇)用量150 mL、時(shí)間2.5 h的最佳條件下，淮山多糖萃取率最高。

1.2 分離凈化方法

1.2.1 傳統(tǒng)分離凈化方法溶劑提取后的中藥多糖溶液大多含有無機(jī)鹽、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)，需進(jìn)一步分離純化。傳統(tǒng)分離凈化方法包括有機(jī)試劑法、蛋白酶法、活性炭或過氧化氫凈化法、分級(jí)沉淀法。其中，有機(jī)試劑法常用于去除蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及色素。常用的有機(jī)試劑為石油醚[13]、三氟乙酸[8,18-19]、無水乙醇[6,12-13]、丙酮[6,19]、乙醚等[19]及其混合溶劑[6]。其中Sevage試劑(正丁醇∶氯仿，按一定比例混合)是常用的去除蛋白質(zhì)的混合有機(jī)溶劑，而石油醚、乙醚等常用于去除脂質(zhì)[20-22]。但有機(jī)試劑毒性較高且用量較大，易造成多糖成分損失且破壞其結(jié)構(gòu)。若需保持中藥多糖的生物活性，可選擇蛋白酶法去除中藥多糖中的蛋白質(zhì)[20]。蛋白酶具有專一性，作用條件溫和、綠色環(huán)保，但價(jià)格較昂貴?；钚蕴?、過氧化氫常用于除去中藥多糖中的色素[23-24]。活性炭一般用于去除鞣質(zhì)色素，但其疏松多孔、無選擇性，會(huì)降低中藥糖類含量，且炭殘留除凈較困難。過氧化氫適用于去除含不飽和雙鍵、芳香環(huán)和羥基的色素，但其氧化性較強(qiáng)，可能會(huì)造成多糖結(jié)構(gòu)的改變。此外，分級(jí)沉淀法一般包括有機(jī)試劑沉淀法[25]、季銨鹽沉淀法[26]等。有機(jī)試劑沉淀法利用多糖易溶于水，不溶于乙醇的特性，以不同濃度的乙醇實(shí)現(xiàn)不同多糖的分級(jí)沉淀而分離出多糖。季銨鹽沉淀法是利用季銨鹽與多糖形成不溶性的化合物而從溶液中分離出多糖，主要用于酸性多糖的分離純化。

1.2.2 新型分離凈化方法

1.2.2.1 柱層析法柱層析法是中藥多糖的新型分離凈化方法，主要利用選擇性吸附和分子篩的作用提高中藥多糖純度。根據(jù)萃取柱的類型，主要采用陰離子交換柱[27]、大孔樹脂柱[28-29]和凝膠柱[30]分離凈化中藥多糖。楊波等[28]將玉竹粉碎后用熱水法提取，采用苯酚-硫酸法測(cè)定玉竹粗多糖的純度為65.229%，當(dāng)進(jìn)一步通過AB-8大孔樹脂凈化后，多糖純度增至78.64%，而用D-101大孔樹脂凈化后多糖純度為73.79%。大孔樹脂柱利用選擇性吸附和分子篩作用，可獲得純度更高的極性大和分子量大的多糖，且AB-8大孔樹脂效果比D-101大孔樹脂更好。董雯雯等[30]利用離子葡聚糖凝膠柱層析法凈化北五味子粗多糖，NaCl洗滌后，經(jīng)過一系列操作可得到3種分子量的多糖組分(SCP-Ⅰ、SCP-Ⅱ和 SCP-Ⅲ)。

1.2.2.2 透析法透析法是利用一定孔徑的半透膜使小分子透過，大分子截留的原理，通常將中藥溶液裝入透析袋，用自來水、蒸餾水透析，將中藥多糖大分子物質(zhì)截留在半透膜中，而無機(jī)鹽、單糖、雙糖等小分子物質(zhì)透過，實(shí)現(xiàn)多糖與小分子寡糖或單糖的分離純化，比大孔樹脂和活性炭吸附法的純化效果更好。如丁晨等[31]采用熱水提取法提取中華蘆薈多糖，分別采用MD-77透析袋、AB-8型大孔吸附樹脂、活性炭?jī)艋瘶悠?，苯?硫酸法測(cè)定多糖含量，結(jié)果表明，透析法的多糖得率(86.60%)明顯高于大孔樹脂吸附法(10.56%)以及活性炭吸附法(8.21%)。

1.2.2.3 超濾法超濾分離法即膜分離技術(shù)，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量差別實(shí)現(xiàn)高分子和小分子溶質(zhì)的分離。該法可在較低壓力下明顯提高中藥多糖的純度。如馮孟鑫等[32]采用水提醇沉法提取人參果多糖，超濾法凈化，在0.1 MPa下超濾40 min，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，結(jié)果表明，純化后人參果樣品的多糖純度為77.5%，是未經(jīng)超濾純化的多糖純度(24.5%)的3.2倍。

1.3 其他前處理方法

近年來，也有文獻(xiàn)采用徑向流色譜新技術(shù)[33]去除中藥多糖中的蛋白質(zhì)，該方法簡(jiǎn)單、環(huán)保，適合工業(yè)化生產(chǎn)，但儀器較貴。另外，當(dāng)單一方法無法滿足需求時(shí)，將多種前處理技術(shù)聯(lián)用也是比較常用的策略[34]。

2 中藥多糖檢測(cè)方法

2.1 含量檢測(cè)技術(shù)

2.1.1 傳統(tǒng)含量檢測(cè)技術(shù)化學(xué)分析法、光譜法、薄層色譜法(TLC)等是用于中藥多糖含量測(cè)定的傳統(tǒng)技術(shù)。其中化學(xué)分析法包括比色法和滴定法，光譜法包括紫外-可見分光光度法和近紅外分光光度法。而比色法與紫外-可見分光光度法相結(jié)合常用于中藥多糖的含量測(cè)定[35-36]。楊勤等[37]比較了苯酚-硫酸和蒽酮-硫酸比色法對(duì)地參多糖的顯色反應(yīng)，并用UV-2450型紫外-可見分光光度儀分別在488 nm和625 nm處測(cè)定多糖含量。結(jié)果表明，苯酚-硫酸法的精密度和穩(wěn)定性更高，更利于地參多糖含量測(cè)定，測(cè)得其平均含量為14.41%。TLC具有操作簡(jiǎn)單、快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥多糖的單糖組成及含量的測(cè)定。鄧勇等[38]以乙酸乙酯-吡啶-醋酸-水(7.0∶3.0∶0.2∶1.4)為展開劑，苯胺-鄰苯二甲酸為顯色劑，采用薄層掃描儀于410 nm波長(zhǎng)下掃描定量蟲草多糖，該方法檢測(cè)限、定量限分別為 0.02～0.10 μg和0.08～0.40 μg，靈敏度偏低，不利于低含量中藥多糖的測(cè)定。而近紅外光譜的光譜圖復(fù)雜，信號(hào)重疊嚴(yán)重，很難找出光譜圖吸收峰的歸屬來直接分析樣品信息，通常需建立模型才能進(jìn)行定性和定量[39]，因此目前較少用于中藥多糖的含量測(cè)定。

2.1.2 新型含量檢測(cè)技術(shù)

2.1.2.1 高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)HPCE是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，根據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為的差異而實(shí)現(xiàn)分離，是近年發(fā)展較快的分析技術(shù)之一。該方法應(yīng)用于中藥多糖的單糖組成以及含量測(cè)定時(shí)效果良好，測(cè)定多糖含量的能力與化學(xué)分析法相當(dāng)，但需進(jìn)行柱前衍生，且常與毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)的分離機(jī)制和紫外檢測(cè)(UV)器相結(jié)合應(yīng)用。如郭懷忠等[40]用熱水提取黃精多糖和玉竹多糖，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)進(jìn)行衍生化，結(jié)果表明，苯酚-硫酸法測(cè)定的多糖含量(4.39%～7.24%)與CZE-UV法(4.24%～7.86%)相當(dāng)，經(jīng)過硫酸降解多糖，CZE-UV法還能測(cè)定黃精和玉竹多糖的單糖組成及其含量。

2.1.2.2 高效陰離子交換色譜法(HPAEC)HPAEC是檢測(cè)中藥多糖的單糖組成及含量的常用離子色譜法。因中藥多糖含有O—H基團(tuán)，易生成帶負(fù)電荷的陰離子，利于檢測(cè)。本課題組利用該技術(shù)測(cè)定了不同產(chǎn)地葛根[41]以及山銀花[21]多糖的單糖組成及含量。如吳寒秋等[21]采用超聲輔助水溶液提取山銀花多糖，Sevage溶液(正丁醇∶氯仿，1∶5)多次萃取除蛋白，三氟乙酸溶液水解多糖，CarboPac PA20色譜柱分離，HPAEC測(cè)定多糖的單糖組成以及含量。結(jié)果表明，該方法靈敏度高，重復(fù)性好，無需衍生，操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可靠，為中藥山銀花的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了參考。

2.1.2.3 氣相色譜法(GC)GC適用于低沸點(diǎn)、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定組分分析，但中藥多糖的沸點(diǎn)較高、極性強(qiáng)，不能直接進(jìn)行GC檢測(cè)，需經(jīng)過柱前衍生。衍生劑包括三氟乙酸鹽、乙酸鹽、三甲基硅醚、甲醚、三甲基硅烷、糖腈乙酸酯和三甲基硅烷基烷基肟等[42-44]，其中乙酸鹽是常用的衍生化劑[43-46]。如王鑫彤等[45]采用熱水提取肉蓯蓉多糖，乙醇沉淀，三氯乙酸除蛋白，透析凈化，硫酸水解多糖，乙酸酐衍生化，DB-5 毛細(xì)管柱分離，GC-氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)測(cè)定肉蓯蓉多糖的單糖組成及含量。該方法具有所需樣品量少、靈敏度高、準(zhǔn)確度好等優(yōu)勢(shì)，常用于中藥多糖中單糖組成的定性定量分析。隨著分析技術(shù)的開發(fā)，發(fā)展了GC串聯(lián)質(zhì)譜(MS)的新技術(shù)，進(jìn)一步減少樣品的用量。李莉等[46]采用水浴加熱提取肉桂多糖，三氟乙酸水解，乙酸酐衍生化，HP-5MS毛細(xì)管柱分離，GC-MS鑒定肉桂多糖的6種化合物并測(cè)定含量，結(jié)果表明，D-呋喃葡萄糖的比例最大，占38.64%。另外GC-MS也是目前用于中藥多糖鑒定和定量的有效手段。

2.1.2.4 高效液相色譜法(HPLC)HPLC是根據(jù)不同組分在固定相和流動(dòng)相中吸附或分配系數(shù)的差異而達(dá)到分離的方法。該技術(shù)可串聯(lián)各類檢測(cè)器，廣泛應(yīng)用于中藥多糖的單糖組成以及含量檢測(cè)，常采用氨基柱、糖色譜柱及C18色譜柱對(duì)中藥多糖進(jìn)行分離。HPLC可串聯(lián)的檢測(cè)器包括蒸發(fā)光散射器(ELSD)、示差折光檢測(cè)器(RID)、紫外檢測(cè)器(UV)、熒光檢測(cè)器(FLD)、四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器(MS)、三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器(MS/MS)等。一般情況，HPLC串聯(lián)ELSD、RID等通用型檢測(cè)器時(shí)，樣品無需柱前衍生。黃超等[47]采用熱水提取茯苓水溶性多糖，三氟乙酸水解多糖后無需衍生，即可采用Shodex Asahipak NH2P-50 4E糖色譜柱分離單糖，運(yùn)用HPLC-ELSD測(cè)定茯苓水溶性多糖中的單糖組成和含量比例。該法可在20 min內(nèi)完成分析，定量限為0.44～4.43 μg。于雷等[48]用熱水提取，石油醚、乙酸乙酯及無水乙醇凈化后無衍生化，即可用Agilent Zorbax NH2色譜柱分離,HPLC-RID測(cè)定懷地黃鮮品及生品的單糖和低聚糖含量。該方法在25 min內(nèi)完成分析，定量限為2.41～2.88 μg。可見，HPLC-ELSD及HPLC-RID技術(shù)無需衍生化，操作方便、快速，利于中藥多糖的含量測(cè)定。

由于中藥糖類成分基本無紫外-可見吸收基團(tuán)或熒光基團(tuán)，當(dāng)利用UV、FLD檢測(cè)器測(cè)定時(shí)，均需柱前衍生化。而PMP衍生化是HPLC-UV較常用的衍生化方法。李衛(wèi)燕等[8]采用堿溶液提取，無水乙醇沉淀，三氟乙酸水解多糖及PMP衍生化后，在250 nm波長(zhǎng)下利用HPLC-UV測(cè)定當(dāng)歸酸性多糖中的單糖含量。另有研究[49]比較了HPLC和HPCE測(cè)定洋甘菊多糖中單糖含量,發(fā)現(xiàn)HPCE比HPLC的線性范圍寬，但HPLC的精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性均略優(yōu)于HPCE。因此，目前HPLC-UV更常用于中藥多糖的分析。目前應(yīng)用的熒光衍生化試劑包括氨基吡啶類、酰肼類、苯胺類和氨基苯甲酸酯類等，其中氨基苯甲酸酯類衍生劑較常用。張其安等[50]采用水溶解蜂蜜樣品后，用氨基苯甲酸衍生化，Sinochrom ODS-BP柱分離，HPLC-FLD測(cè)定蜂蜜中果糖、葡萄糖和麥芽糖含量。該方法在20 min內(nèi)完成分析，檢出限為96～240 μg/kg，且色譜峰干擾少，具有選擇性高、靈敏度高、受外界條件影響小等優(yōu)點(diǎn)。

質(zhì)譜(MS)屬于通用型檢測(cè)器，具有適用范圍廣、靈敏度高、檢測(cè)速度快等特點(diǎn)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)ELSD、RID、UV、FLD檢測(cè)器靈敏度低、選擇性差、重復(fù)性差等缺點(diǎn)，在中藥多糖的含量測(cè)定中顯示出較大的發(fā)展?jié)摿?。趙孟欣等[22]用Kro-masil-C18色譜柱分離，HPLC-MS測(cè)定枸杞多糖中各類單糖含量，采用電噴霧離子源和正離子模式(ESI+)，并在選擇離子掃描模式(SIM)下對(duì)PMP衍生化單糖產(chǎn)物進(jìn)行定量，該法通過母離子即可進(jìn)行準(zhǔn)確定量，檢出限和定量限分別可達(dá)0.003～0.05 mg/L、0.01～0.15 mg/L。Gao等[51]采用UPLC-MS/MS測(cè)定防風(fēng)多糖中各類單糖含量，并通過ESI+和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)對(duì)PMP衍生化單糖產(chǎn)物進(jìn)行定量，通過母離子和子離子精準(zhǔn)定量，檢出限和定量限分別可達(dá)1.50～2.49 ng/mL、4.94～8.21 ng/mL。近年來，電霧式檢測(cè)器(CAD)作為一種新型通用檢測(cè)器，靈敏度遠(yuǎn)高于ELSD 和 RID檢測(cè)器，已被成功應(yīng)用于中藥多糖的單糖組成以及含量檢測(cè)。梁琰等[19]采用高效液相色譜聯(lián)用電霧式檢測(cè)器(HPLC-CAD)檢測(cè)靈芝多糖的組成和含量，該方法無需衍生可在12 min完成樣品分析，檢出限和定量限分別為0.01～0.17 μg/mL和0.02～0.59 μg/mL，具有簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性高、穩(wěn)定性好和靈敏度高等特點(diǎn)。

2.2 結(jié)構(gòu)分析技術(shù)

2.2.1 傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)分析技術(shù)研究多糖的單糖組成是分析多糖結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。通常將中藥多糖水解成單糖后，經(jīng)過衍生化、中和、過濾等操作后，再利用TLC、HPCE、GC、HPAEC及HPLC等技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)多糖的單糖組成檢測(cè)[21,39,41,46,48]。其中GC、HPAEC和HPLC的應(yīng)用較廣泛,這些技術(shù)可以檢測(cè)出多糖的單糖組成及其含量比。另外，高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)是凝膠滲透色譜(GPC)和 HPLC的結(jié)合產(chǎn)物，常用于中藥多糖分子量大小和分布范圍的檢測(cè)[52]。 為進(jìn)一步得到更多的結(jié)構(gòu)信息，高碘酸氧化[53]、Smith降解[53]和甲基化分析[54]等化學(xué)方法被用于中藥多糖的結(jié)構(gòu)分析。高碘酸氧化可通過高碘酸的消耗量以及甲酸的生成量判斷多糖中糖苷鍵的位置和連接方式等結(jié)構(gòu)信息。Smith降解是將高碘酸氧化物還原后進(jìn)行水解而推測(cè)出糖苷鍵的鍵型及其位置等信息。甲基化分析則是通過甲基化試劑將單糖的游離殘基全部甲基化，并通過還原和乙酰化反應(yīng)后采用GC-MS檢測(cè)[53]，從而能推斷各單糖的連接方式。此外，采用PMP衍生化標(biāo)記單糖后，可利用HPLC-MS提供的分子一級(jí)質(zhì)譜(即母離子信息)對(duì)中藥多糖中的單糖標(biāo)記物結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)和測(cè)定[22]。再者,HPLC-MS/MS可提供分子的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜結(jié)構(gòu)信息(即母離子和子離子碎片)對(duì)中藥多糖的單糖進(jìn)行確認(rèn)后測(cè)定[54]。另外，糖譜法是多糖通過化學(xué)或系列定位酶切等技術(shù)獲得多糖降解產(chǎn)物片段，并聯(lián)用色譜等手段實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥多糖分離鑒定的技術(shù)[55]。該技術(shù)在一定程度上可表征一類多糖降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征，且1種多糖只有1個(gè)特征糖譜，可作為中藥多糖的指紋圖譜。

2.2.2 新型結(jié)構(gòu)分析技術(shù)

2.2.2.1 傅里葉變換紅外光譜法(FTIR)紅外光譜(IR)是一種電磁波，多糖結(jié)構(gòu)中的基團(tuán)能夠呈現(xiàn)特異的紅外吸收光譜，因此IR可用于中藥多糖結(jié)構(gòu)分析。目前IR主要使用波數(shù)為 4 000～400 cm-1的波段檢測(cè)多糖成分，是目前解析多糖結(jié)構(gòu)的一種重要手段。隨著儀器技術(shù)的發(fā)展，F(xiàn)TIR技術(shù)在IR的基礎(chǔ)上被開發(fā)，其靈敏度、信噪比、分辨率、掃描速率、重現(xiàn)性及波長(zhǎng)準(zhǔn)確性等方面具有很大的改善，該技術(shù)主要用于中藥多糖基團(tuán)結(jié)構(gòu)和糖苷鍵連接方式的分析。Zhao等[56]利用FTIR技術(shù)在4 000～400 cm-1波段對(duì)玉竹多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，圖譜顯示，1 740、1 630 cm-1處有吸收，判斷存在COO—R基團(tuán)，而1 420 cm-1有吸收峰表明此處為對(duì)稱的羧酸陰離子。此外，930、815 cm-1有吸收峰，表明有果糖且為β-型糖苷鍵連接方式。

2.2.2.2 核磁共振波譜法(NMR)NMR是利用磁場(chǎng)作用檢測(cè)分子中原子核性質(zhì)及其與周圍化學(xué)環(huán)境的相互作用而實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)分析。該技術(shù)不破壞多糖樣品，可準(zhǔn)確反映多糖的整體真實(shí)結(jié)構(gòu)，是目前中藥多糖結(jié)構(gòu)分析的主要技術(shù)。隨著高磁場(chǎng)技術(shù)的發(fā)展，NMR可分為1H-NMR、13C-NMR和二維NMR譜(2D-NMR)。這些技術(shù)可提供單糖殘基的類型，各糖殘基中C、H化學(xué)位移歸屬，各糖殘基間的連接位置和連接順序等結(jié)構(gòu)信息。Chen等[57]采用該技術(shù)鑒定白芨須根中一位新多糖結(jié)構(gòu)，主要通過1H-NMR的5個(gè)異頭氫的化學(xué)位移信息δ5.32、4.99、 4.98、4.91、5.32 ppm推斷出β-吡喃糖基和α-吡喃糖基；通過13C-NMR中5個(gè)異頭氫的化學(xué)位移信息δ101.26、100.04、99.51、97.8、174.6 ppm鑒定出糖醛酸雜質(zhì)，結(jié)合2D-NMR鑒定出各殘基的連接位置為1，6-鏈接β-D吡喃糖等結(jié)構(gòu)信息，促進(jìn)了中藥多糖結(jié)構(gòu)分析。

2.2.2.3 高分辨質(zhì)譜法(HRMS)隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，HRMS技術(shù)在中藥多糖的結(jié)構(gòu)解析中顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿?。HRMS具有靈敏度高、分辨率高、掃描速度快等特點(diǎn)，可為中藥未知多糖提供精確的分子質(zhì)量及相關(guān)結(jié)構(gòu)信息。目前，HRMS主要有飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF)、靜電場(chǎng)軌道阱(Orbitrap)等應(yīng)用于中藥多糖的結(jié)構(gòu)分析。廖俊昭[58]采用高效液相色譜-電噴霧離子源-飛行時(shí)間質(zhì)譜法(HPLC-ESI-Q-TOF MS)鑒定人參粗多糖的部分酸水解產(chǎn)物，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)二糖提供的MS和MS/MS提供的結(jié)構(gòu)信息確定人參多糖的糖苷鍵類型主要為1,3糖苷鍵和1,4糖苷鍵類型，為中藥的指紋性多糖圖譜研究提供了新方法。另外，張亞麗等[59]采用高效液相色譜-線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜法(HPLC-LTQ-Orbitrap-MS)鑒別黃連的多糖結(jié)構(gòu)，應(yīng)用二級(jí)、三級(jí)及多級(jí)質(zhì)譜(MSn)分析了黃連多糖中單糖的裂解規(guī)律，可獲得高靈敏度和高分辨的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并首次鑒定出黃連多糖中的核糖和巖藻糖，為鑒定中藥未知多糖的結(jié)構(gòu)奠定了良好基礎(chǔ)。另外，HRMS可結(jié)合其他檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)更多維的中藥多糖結(jié)構(gòu)解析。王瑩等[60]采用GPC-RID 測(cè)定注射用黃芪多糖的重均分子量(Mw)及其分布，采用多角度激光光散射法(MALLS)及基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF MS)測(cè)定黃芪多糖的Mw及其結(jié)構(gòu)。通過3種方法的測(cè)定和相互驗(yàn)證，初步確定了注射用黃芪多糖的單元結(jié)構(gòu)信息，最終準(zhǔn)確而可靠地獲得黃芪多糖的Mw。

3 結(jié)論與展望

近年來，隨著中醫(yī)藥研究的深入，中藥多糖在醫(yī)藥行業(yè)具有巨大的開發(fā)前景。目前由于中藥多糖種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，研究尚不充分，上述的中藥多糖前處理以及檢測(cè)方法為中藥多糖的含量測(cè)定、多糖的單糖組成分析、多糖分子量以及結(jié)構(gòu)分析提供了參考。目前，尋找一種環(huán)保、成本低、提取效率高的前處理技術(shù)是中藥多糖成分的重要內(nèi)容之一，而高壓脈沖電場(chǎng)輔助提取法、動(dòng)態(tài)高壓微射流輔助提取法、加速溶劑萃取法和超臨界流體萃取法是近年來用于提取中藥多糖成分的新興技術(shù)。相比于傳統(tǒng)技術(shù)，新型技術(shù)具有綠色污染低、提取效率高等特點(diǎn)。此外，越來越多的學(xué)者逐步挖掘HPLC-HRMS及其相關(guān)聯(lián)用技術(shù)用于中藥多糖檢測(cè)。該方法能夠提供中藥多糖的Mw、數(shù)均分子量、分子量分布、多糖成分單元結(jié)構(gòu)、多糖的單糖組成以及含量等重要信息，所測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠，在中藥多糖的表征方面具有很好的應(yīng)用潛力，將有助于中藥多糖成分的進(jìn)一步開發(fā)利用。