高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定中成藥金蓮清熱膠囊中3種成分

李 琳，曹婭娟，李怡婧，陰 嬌

(寧夏啟元國(guó)藥有限公司，寧夏 銀川 750000)

金蓮清熱膠囊是在寧夏啟元國(guó)藥有限公司研制的金蓮清熱顆粒的基礎(chǔ)上，改變劑型開發(fā)的中藥新藥。該藥由金蓮花、大青葉、生地黃等組成，通過(guò)加水煎煮，過(guò)濾，濃縮，干燥，加入適量的輔料制成顆粒后，再灌裝入膠囊制成。其中金蓮花作為金蓮清熱膠囊的君藥之一，其主要指標(biāo)性成分為葒草苷、牡荊苷，具有清熱解毒、抗菌消炎的功效[1-2]；生地黃作為佐藥之一，具有潤(rùn)燥、清熱生津的功效，其主要指標(biāo)性成分為毛蕊花糖苷[3]。金蓮清熱膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一直為國(guó)家部頒標(biāo)準(zhǔn)(YBZ01712008)，未載入《中國(guó)藥典》中，其標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)臣藥知母中的菝葜皂苷元進(jìn)行了含量測(cè)定，采用的是薄層雙波長(zhǎng)掃描法。該方法不僅用到大量致癌有毒試劑——苯反復(fù)提取，造成檢測(cè)效率較低，且含量測(cè)定指標(biāo)不能準(zhǔn)確反映臨床療效，因此改進(jìn)含量檢測(cè)方法，選擇多種關(guān)鍵藥效成分進(jìn)行定量分析，能夠有效控制金蓮清熱膠囊的質(zhì)量[4]。

1 儀器與試藥

島津LC-20A，包括二元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，紫外檢測(cè)器，Labsolution工作站，電子天平METTLER TOLEDO AG104(101 g～0.1 mg)；KQ-300DE型數(shù)控超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

葒草苷(批號(hào)：111777-201302，含量：97.9%)，牡荊苷(批號(hào)：111687-201603，含量：95.7%)，毛蕊花糖苷(批號(hào)：111530-201512，含量：96.7%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈(均為Guangdong Guanghua Sci-Tech Co.，LTD色譜純)；水為公司自制純化水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch(月旭)C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：0.2%冰醋酸溶液，線性梯度洗脫，洗脫程序見表1；檢測(cè)波長(zhǎng)：340 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液配制

混合對(duì)照品溶液配制：取葒草苷對(duì)照品、牡荊苷對(duì)照品、毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含50 μg的混合溶液，即得。

供試品溶液配制：取金蓮清熱膠囊適量，除去囊殼，內(nèi)容物研細(xì)，精密稱定0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入30 mL水，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)60 min，過(guò)濾，取續(xù)濾液20 mL至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取3次(30 mL，30 mL，20 mL)，合并乙酸乙酯提取液，水浴80 ℃蒸干，用甲醇轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，定容，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，即得。

陰性溶液制備：按處方比例和制法分別制備不含金蓮花、大青葉和地黃的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液，按照本研究方法測(cè)定，并在二極管陣列檢測(cè)器上分析色譜峰。結(jié)果表明，方中其他成分不干擾葒草苷、牡荊苷和毛蕊花糖苷的測(cè)定。色譜見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密稱取葒草苷、牡荊苷及毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，加甲醇稀釋定容，制備混合對(duì)照品母液20 mL(紅草苷濃度1.008 mg/mL、牡荊苷濃度0.805 mg/mL、毛蕊花糖苷濃度0.062 mg/mL)。精密量取混合對(duì)照品溶液1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL置于1 0mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。取上述溶液各10 μL注入液相色譜儀中，按照擬定的色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。計(jì)算回歸方程，詳見表2。

注：1.葒草苷；2.牡荊苷；3.毛蕊花糖苷。A.混合對(duì)照溶液；B.缺地黃陰性對(duì)照溶液；C.缺金蓮花陰性對(duì)照溶液；D.供試品溶液。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

取上述混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按本研究所用方法測(cè)定。以峰面積計(jì)算，葒草苷、牡荊苷和毛蕊花糖苷的RSD分別為0.5%、0.8%和0.9%。結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批樣品(金蓮清熱膠囊，批號(hào)：170216)，精密稱定0.5 g左右樣品6份，按照供試品溶液制備方法制成供試品溶液，測(cè)定。結(jié)果葒草苷、牡荊苷和毛蕊花糖苷每粒平均含量分別為0.655、0.251、0.081 mg，RSD分別為0.4%、0.5%、1.3%(n=6)，說(shuō)明本方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知葒草苷含量的同一批號(hào)(含量：0.66 mg/粒)樣品6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入葒草苷對(duì)照品溶液(0.208 mg/mL)2 mL，按本研究所用方法測(cè)定，計(jì)算葒草苷的加樣回收率。精密稱取已知牡荊苷含量的同一批號(hào)(含量：0.26 mg/粒)樣品6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入牡荊苷對(duì)照品溶液(0.081 mg/mL)2 mL，按本研究所用方法測(cè)定，計(jì)算葒草苷的加樣回收率。精密稱取已知毛蕊花糖苷含量的同一批號(hào)(含量：0.082 mg/粒)樣品6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液(0.031 mg/mL)2 mL，按本研究所用方法測(cè)定，計(jì)算葒草苷的加樣回收率。見表3。

3 討論

3.1 波長(zhǎng)選擇

表3 金蓮清熱膠囊中3種成分的加樣回收率測(cè)定結(jié)果

將葒草苷、牡荊苷和毛蕊花糖苷的標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別在190～400 nm處進(jìn)行掃描，葒草苷最大吸收波長(zhǎng)為348 nm，牡荊苷最大吸收波長(zhǎng)為337 nm，毛蕊花糖苷最大吸收波長(zhǎng)為329 nm，經(jīng)過(guò)反復(fù)摸索，最終確定340 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，在該波長(zhǎng)下，所測(cè)各成分分離效果好，分離度達(dá)到要求。

3.2 提取因素考察

本研究對(duì)以下提取方法進(jìn)行了考察：甲醇超聲-水飽和正丁醇提取、乙酸乙酯∶70%乙醇=1∶2混合溶液提取、甲醇超聲提取[5]、大孔樹脂吸附-乙酸乙酯提取、乙酸乙酯提取。結(jié)果表明以乙酸乙酯-70%乙醇為提取溶劑，所測(cè)得待測(cè)成分含量較高，但單用乙酸乙酯提取得到的樣品，雜質(zhì)峰干擾較小且待測(cè)成分含量也較高，因此最終采用乙酸乙酯作為提取溶劑。

3.3 流動(dòng)相的考察

樣品處方中共有7味藥材，成分復(fù)雜，性質(zhì)相近的成分多，流動(dòng)相先后以等度洗脫方式：甲醇-0.4%磷酸[6]、乙腈-0.4%磷酸、乙腈-0.2%冰醋酸，未能得到良好分離效果，結(jié)合提取方法及色譜條件的考察，最終選擇乙腈-0.2%冰醋酸，梯度洗脫，系統(tǒng)分離效果較好。

本研究建立了金蓮清熱膠囊中多種指標(biāo)成分同時(shí)測(cè)定的方法，以表征金蓮清熱膠囊的質(zhì)量，多組分同時(shí)測(cè)定還可以反映復(fù)方中藥的配伍狀況，方法簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適于產(chǎn)品的含量測(cè)定及質(zhì)量控制。