不同產地綿馬貫眾飲片標準湯劑制備與質量標準研究

姚 娜，黃燕明，李雪銀，陳桂生，康志英，3，徐 超，張立明

(1.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.隆德縣六盤山中藥資源開發(fā)有限公司，寧夏 固原 756300；3.廣東香雪南藥發(fā)展有限公司，廣東 肇慶 526642；4.寧夏職業(yè)技術學院，寧夏 銀川 750000；5.寧夏醫(yī)科大學 藥學院，寧夏 銀川 750004)

標準湯劑又稱標準煎液，是一種傳統(tǒng)的臨床廣泛使用的用藥形式。標準湯劑系遵循中醫(yī)藥理論，按照臨床湯劑煎煮方法規(guī)范煎煮，固液分離，經適當濃縮制備或經適宜方法干燥制得，作為衡量中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一致的標準參照物。

綿馬貫眾為鱗毛蕨科植物粗莖鱗毛蕨DryopteriscrassirhizomaNakai的干燥根莖和葉柄殘基。秋季采挖，削去葉柄、須根，除去泥沙，曬干。道地產區(qū)為吉林，主產區(qū)有黑龍江、吉林和遼寧。其具有清熱解毒，驅蟲的功效，臨床上多用于治療蟲積腹痛、瘡瘍[1-2]。藥理研究表明，綿馬貫眾有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、驅蟲等作用[3-4]。綿馬貫眾主要化學成分有間苯三酚類、黃酮類、萜類、甾體類、苯丙素類以及脂肪族類化合物等[5-8]。綿馬貫眾屬于冷背藥材，對其研究報道不多。目前，關于綿馬貫眾標準湯劑制備及標準研究未見報道。本研究從標準湯劑的角度，收集15批綿馬貫眾飲片為原料，依據(jù)《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》和《醫(yī)療機構中藥煎藥室管理規(guī)范》，對其進行標準湯劑制備研究，并進行質量標準研究，以期為綿馬貫眾水提物及配方顆粒的質量評價提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；MS204TS萬分之一電子分析天平(瑞士Mettler toledo公司)；Simplicity超純水器(美國密理博Millipore公司)；KQ500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

綿馬貫眾對照藥材(中國食品藥品檢定研究所，121034-200302，規(guī)格：1.0 g/瓶)。

乙腈(天津賽孚瑞公司，色譜級)；醋酸為分析純，GENERAL-REAGENT；甲醇(國藥集團化學試劑廠，分析純)。

1.3 樣品

共收集15批綿馬貫眾飲片，均為野生品，遼寧西豐縣3批，吉林白山6批，黑龍江伊春3批，遼寧清原3批；包含了綿馬貫眾藥材的道地產區(qū)和主產區(qū)。樣品經廣州市香雪制藥股份有限公司高級工程師康志英鑒定為真品。

2 方法與結果

2.1 綿馬貫眾飲片標準湯劑制備

取綿馬貫眾飲片100 g，加8倍量水，浸泡30 min，煎煮20 min，濾過；第二次加6倍量水，煎煮15 min，濾過，濾液合并，減壓濃縮至飲片投料量∶浸膏體積約為1∶1(g∶mL)的浸膏，冷凍干燥，即得。

2.2 綿馬貫眾飲片標準湯劑薄層鑒別

取本品粉末1.0 g，加沸水50 mL，攪拌使溶解，濾過，濾液用鹽酸酸化至pH=2～3，置分液漏斗中，用無水乙醚萃取3次，合并乙醚液，濃縮至干，殘渣加氯仿3 mL使溶解，作為供試品溶液。另取綿馬貫眾對照藥材1.0 g，加水50 mL，煎煮1 h，離心取上清液，同法制成對照藥材溶液。按照薄層色譜法(《中國藥典》2015版四部通則0502)試驗，吸取上述2種溶液，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-冰醋酸(12∶1∶0.25)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.3%堅牢藍BB鹽稀乙醇溶液，日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的主斑點，見圖1。

注：1.綿馬貫眾對照藥材；2.標準湯劑(MAGZ-01)；3.標準湯劑(MAGZ-02)；4.標準湯劑(MAGZ-03)；5.標準湯劑(MAGZ-04)；6.標準湯劑(MAGZ-05)；7.標準湯劑(MAGZ-06)；8.標準湯劑(MAGZ-07)；9.標準湯劑(MAGZ-08)；10.標準湯劑(MAGZ-09)；11.綿馬貫眾對照藥材；12.標準湯劑(MAGZ-10)；13.標準湯劑(MAGZ-11)；14.標準湯劑(MAGZ-12)；15.標準湯劑(MAGZ-13)；16.標準湯劑(MAGZ-14)；17.標準湯劑(MAGZ-15)。

2.3 綿馬貫眾標準湯劑指紋圖譜研究

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Waters Symmetry?-C18色譜柱(柱長為25 cm，柱內徑為4.6 mm，粒徑為5 μm)；以乙腈為流動相A，以1%醋酸溶液為流動相B，按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫；檢測波長為330 nm。

時間(min)流動相A(%)流動相B(%)0-1510→2090→8015-2520→4080→6025-4040→6060→40

2.3.2 參照物溶液制備 取綿馬貫眾飲片約1.0 g，精密稱定，加水50 mL，煎煮30 min，取出，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加適量甲醇超聲處理使溶解，取出，放冷，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為飲片參照物溶液。取綠原酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成40 μg/mL的溶液，作為對照品參照物溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 取本品粉末1.0 g，精密稱定，精密加甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.4 指紋圖譜方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 取綿馬貫眾飲片標準湯劑,按供試品溶液制備方法制備，按“2.3.1”項下的色譜條件測定，結果表明，12個共有色譜峰的鑒定均不受溶劑因素干擾，具有良好的專屬性。

2.4.2 精密度試驗 取同一批綿馬貫眾飲片標準湯劑樣品依法制備，按色譜條件測定，連續(xù)進樣6次，每次10 μL，記錄色譜。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.1版)》進行評價，結果顯示相似度均大于0.90，表明該儀器的精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 取同一批綿馬貫眾飲片標準湯劑樣品，平行6份，依法制備，按“2.3.1”項下的色譜條件分別進樣，記錄色譜。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.1版)》進行評價，結果顯示相似度均大于0.90，表明該方法重復性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，按色譜條件，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h進樣分析，記錄色譜。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.1版)》進行評價，結果顯示相似度均大于0.90，表明供試品溶液在48 h內穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜的構建

取15批綿馬貫眾飲片標準湯劑，按供試品溶液制備方法和色譜條件測定，得到15批綿馬貫眾飲片標準湯劑的色譜疊加圖(圖2)。根據(jù)相對保留時間穩(wěn)定及各批次樣品均能檢出的原則，選擇了12個特征峰作為共有峰。

圖2 15批綿馬貫眾飲片標準湯劑HPLC指紋圖譜疊加

2.6 綿馬貫眾飲片-提取液-凍干粉指紋圖譜關聯(lián)性分析

測定同批次飲片、提取液、標準湯劑溶液，制備方法制備供試品，測定，結果綿馬貫眾飲片、水提液、標準湯劑凍干粉的色譜圖上均呈現(xiàn)12個共有峰(見圖3)，且相似度均大于0.90，說明綿馬貫眾飲片-水提液-凍干粉相關性良好。

圖3 綿馬貫眾飲片-水提液-標準湯劑HPLC指紋圖譜疊加

3 討論

本研究在薄層鑒別方法探索過程中，筆者首先參照《中國藥典》2015版一部“綿馬貫眾”【鑒別】項下薄層色譜方法，結果供試品色譜中在與飲片溶液色譜相應的位置上，均沒有斑點出現(xiàn)，分析原因為凍干粉是由飲片經過水煮后所得，大部分成分為極性大的物質，環(huán)己烷為極性小的溶劑，藥典方法處理所得的供試品大多為小極性物質，因此藥典方法不適用于凍干粉的薄層鑒別，于是更換薄層鑒別方法進行探索。

在流動相條件考察時，考察酸的種類及濃度對色譜峰型及分離度的影響，結果發(fā)現(xiàn)，1%醋酸色譜峰分離度較好，故選擇乙腈-1%醋酸溶液作為流動相進行梯度洗脫。

采用光電二極管陣列檢測器考察綿馬貫眾標準湯劑供試品溶液在不同波長下色譜圖情況。供試品溶液在190～400 nm波長下進行掃描，通過3D視圖和等吸收圖譜進行分析，通過供試品溶液在不同波長下的色譜圖比較發(fā)現(xiàn)，在230～400 nm波長范圍內，基線較平穩(wěn)，250～330 nm信息逐漸增多，340 nm以后色譜峰信息逐漸減少，在330 nm色譜峰響應值適中，信息量較大，故選330 nm作為檢測波長。

綜上所述，本試驗中綿馬貫眾飲片標準湯劑的制備方法簡單，所建立的TLC定性鑒別法及HPLC法測定指紋圖譜的方法簡便、可靠，可為綿馬貫眾配方顆粒的質量評價提供參考。