IL-6磁微粒化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)方法的建立和評(píng)價(jià)

劉 珂 李雙法 李 奎 于 林 程云龍

(鄭州安圖生物工程股份有限公司，鄭州 450016)

IL-6是機(jī)體細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的重要成員，屬于先天性免疫系統(tǒng)細(xì)胞因子，主要由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，在機(jī)體各組織普遍表達(dá)，在健康人血清中的含量極低[1]。IL-6最早于1980年被發(fā)現(xiàn)，分子量為22～27 kD，其前體肽有212個(gè)氨基酸，其中1～28位氨基酸是其前導(dǎo)肽，成熟肽由184個(gè)氨基酸組成[2]。作為當(dāng)前所發(fā)現(xiàn)的功能最廣泛的細(xì)胞因子之一，IL-6生物效能復(fù)雜，能夠作用于多種效應(yīng)細(xì)胞，在機(jī)體的造血調(diào)控和免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要作用。IL-6 的失調(diào)可能導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，例如腫瘤、慢性炎癥(如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)、膿毒癥等，其臨床表現(xiàn)為發(fā)病時(shí) IL-6 水平增高[3]。另外，手術(shù)患者的IL-6濃度可以預(yù)示手術(shù)并發(fā)癥產(chǎn)生的可能[4，5]；連續(xù)監(jiān)測(cè)重癥監(jiān)護(hù)患者IL-6的水平能夠有效評(píng)估系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征的嚴(yán)重程度，膿毒血癥以及膿毒血癥性休克的預(yù)后情況[6，7]；IL-6還能作為膿毒血癥的早期警告指標(biāo)[8，9]。目前，IL-6檢測(cè)已在臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛開(kāi)展，其檢測(cè)方法主要有生物學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)檢測(cè)方法。免疫學(xué)方法檢測(cè)作為臨床常用的檢測(cè)方法，已有相關(guān)商品化試劑盒供應(yīng)，如電化學(xué)或化學(xué)發(fā)光法 IL-6 免疫分析試劑盒等。但是目前醫(yī)院所用大多為進(jìn)口試劑盒，儀器、試劑和耗材價(jià)格昂貴，儀器維護(hù)成本高。隨著國(guó)內(nèi)全自動(dòng)磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)的提高及國(guó)產(chǎn)試劑盒質(zhì)量的改善，自主開(kāi)發(fā)IL-6檢測(cè)試劑盒十分必要。在市場(chǎng)上占有率最高的羅氏公司IL-6試劑盒采用電化學(xué)發(fā)光原理，三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物，在三丙胺的作用下發(fā)生氧化還原反應(yīng)發(fā)出可見(jiàn)光，其相對(duì)光強(qiáng)度RLU與待測(cè)IL-6抗原濃度成正比。本研究利用國(guó)產(chǎn)全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，采用辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記在IL-6抗體上，固相抗體、IL-6抗原與HRP標(biāo)記的抗體在發(fā)光底物魯米喏的作用下，持續(xù)發(fā)出可見(jiàn)光，RLU與待測(cè)IL-6抗原濃度也成正比例關(guān)系，在此原理下基于CLIA建立IL-6水平檢測(cè)方法，對(duì)其進(jìn)行條件優(yōu)化及性能評(píng)估。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1血清標(biāo)本 收集2019年1～7月于鄭州市中心醫(yī)院就診的發(fā)熱、肺炎等患者血清300例；正常人標(biāo)本200例取自體檢科。

1.1.2試劑與儀器 鄭州安圖生物工程股份有限公司生產(chǎn)的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀 AutoLumo A2000 plus；羅氏 e601及配套IL-6電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒；抗IL-6小鼠單克隆抗體(鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司)；IL-6國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品(英國(guó)國(guó)家生物標(biāo)準(zhǔn)與檢定，NIBSC，89/548)。

1.2方法

1.2.1包被抗體的制備 取磁珠包被緩沖液300 μl，加入300 μg的磁珠原液反復(fù)吹打，置于磁珠分離器上吸取上清后，添加碳二亞胺活化液，室溫反應(yīng)30～60 min，然后加入鼠抗人IL-6捕獲抗體偶聯(lián)2 h或過(guò)夜，偶聯(lián)結(jié)束后，置于磁珠分離器上吸取上清，加入乙醇胺溶液進(jìn)行封閉30 min，吸取上清后加入封閉液，混勻后置于磁珠分離器，棄上清，重復(fù)3～5次后，加入封閉液定容至3 ml，置于2～8℃保存。

1.2.2辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記IL-6抗體的制備 采用過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記IL-6抗體并用半飽和硫酸銨法純化并透析，取上清加入50%甘油于-20℃保存。

1.2.3條件優(yōu)化 包被磁珠保護(hù)液緩沖、包被抗體濃度、酶標(biāo)記抗體濃度等條件均需優(yōu)化，本文采用高值和低值混合血清標(biāo)本來(lái)優(yōu)化以上條件。

1.2.3.1共比較3種緩沖體系： ① 0.02 mol/L PBS(pH7.2)；② 0.05 mol/L Tris-HCl(pH7.2)；③ 0.05 mol/L MES(pH5.5)，以檢測(cè)信號(hào)值和與羅氏濃度相關(guān)性為主要考核目標(biāo)。

1.2.3.2考核包被抗體濃度 以信號(hào)值為主要標(biāo)準(zhǔn)，選擇三個(gè)梯度：10 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml，比較其高中低值標(biāo)本的信號(hào)值大小。

1.2.3.3選擇最優(yōu)酶標(biāo)記抗體濃度 設(shè)置不同的梯度：0.6 μg/ml、0.4 μg/ml、0.2 μg/ml、0.1 μg/ml、0.05 μg/ml，考核其信號(hào)值大小。

1.2.4IL-6標(biāo)準(zhǔn)品配制 將 IL-6國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品用體系緩沖液(0.01 mol/l PBS、10 g/l BSA) 稀釋配制成不同濃度的校準(zhǔn)品溶液S0～S5，濃度分別是0、5、50、200、500、1 000 pg/ml，分裝保存于-20℃。

1.2.5分析性能評(píng)估

1.2.5.1靈敏度 按照 CLSI EP17-A 文件[10]進(jìn)行靈敏度的考核。準(zhǔn)備5份接近0值的臨床標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次，連續(xù)檢測(cè)4 d；準(zhǔn)備5份濃度范圍在LoB的1～4倍之間的標(biāo)本，每天各檢測(cè)4次，間隔不小于2 h，每個(gè)指標(biāo)2個(gè)重復(fù)，共進(jìn)行5 d；按照EP17-A2的方法進(jìn)行結(jié)果分析，計(jì)算LoB、LoD、FS。

1.2.5.2精密度 檢測(cè)高、中、低值混合均勻的IL-6水平血清標(biāo)本，不同濃度標(biāo)本每天各檢測(cè)2次，每次2個(gè)重復(fù)，間隔不小于2 h，連續(xù)測(cè)定20 d，分別計(jì)算各標(biāo)本分析內(nèi)精密度、分析間精密度及總不精密度。

1.2.5.3線(xiàn)性范圍 根據(jù)EP06-A文件進(jìn)行線(xiàn)性范圍的建立。具體方法如下：準(zhǔn)備10份濃度約為1 300 pg/ml的臨床高值標(biāo)本和1份濃度接近于0的臨床低值標(biāo)本，按照不同比例混合，制備出10組系列濃度的標(biāo)本，作為線(xiàn)性標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算線(xiàn)性范圍。

1.2.5.4最大稀釋倍數(shù) 選擇線(xiàn)性范圍內(nèi)的高值血清，用校準(zhǔn)品稀釋液按2、4、8、16、32倍比稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋倍數(shù)連續(xù)測(cè)定3次，取其平均值作為實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果，計(jì)算偏差。偏差=(實(shí)測(cè)值-預(yù)測(cè)值)/預(yù)測(cè)值×100%。

1.2.5.5準(zhǔn)確度 根據(jù)EP09文件進(jìn)行試劑盒的回收率評(píng)估。具體方法如下：選擇高值標(biāo)本10份，按照1∶9的比例分別加入到10份低值標(biāo)本/基質(zhì)標(biāo)本中，制成回收標(biāo)本，每個(gè)回收標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)3次求均值，計(jì)算回收率?；厥章蕆=[ C×(V0+VS)-C0×V0]/(CS×VS)×100% (V0：低值標(biāo)本的體積，VS：高值標(biāo)本的體積，C：回收標(biāo)本的檢測(cè)濃度，C0：低值標(biāo)本的檢測(cè)濃度，CS：高值標(biāo)本的檢測(cè)濃度)。

1.2.5.6干擾實(shí)驗(yàn) 取 IL-6濃度高、低值血清待測(cè)標(biāo)本，分別加入不同濃度的血紅蛋白、三酰甘油、 膽紅素作為干擾標(biāo)本，同時(shí)添加相同體積的體系緩沖液作為基礎(chǔ)標(biāo)本，用本方法測(cè)定濃度值。計(jì)算干擾率。干擾率=(分析樣品的測(cè)定濃度-基礎(chǔ)樣品的測(cè)定濃度)/基礎(chǔ)樣品的測(cè)定濃度×100%。

1.2.5.7方法學(xué)比對(duì) 根據(jù)EP09-A2文件，分別用本文方法和羅氏檢測(cè)系統(tǒng)平行檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 線(xiàn)性擬合采用Excel軟件進(jìn)行，性能評(píng)價(jià)按照EP文件的實(shí)驗(yàn)要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1條件優(yōu)化

2.1.1包被磁珠保護(hù)液緩沖條件 本研究中，磁珠包被結(jié)束后保護(hù)液的選擇至關(guān)重要，圖1A表明，使用0.02 mol/L PBS作為保護(hù)緩沖液時(shí)，檢測(cè)信號(hào)值達(dá)到最大，且相關(guān)性也較好，故體系緩沖液采用0.02 mol/L PBS。

圖1 IL-6磁微粒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑條件優(yōu)化Fig.1 Optimization of conditions for IL-6 magnetic particle chemiluminescence reagent

2.1.2包被抗體濃度 由圖1B可知，隨包被抗體濃度增加，發(fā)光信號(hào)值并沒(méi)有明顯升高，說(shuō)明當(dāng)包被抗體濃度為10 μg/ml已達(dá)到飽和狀態(tài)，故將包被抗體濃度定為10 μg/ml。

2.1.3酶標(biāo)記抗體濃度 隨標(biāo)記抗體濃度的增大，信號(hào)值逐漸升高，但陰性值區(qū)信號(hào)值也增大，導(dǎo)致陽(yáng)性和陰性濃度比值(P/N)減小，低值標(biāo)本區(qū)分度較差。綜合考慮信號(hào)值和本底問(wèn)題，選擇酶標(biāo)記抗體濃度0.2 μg/ml為最佳標(biāo)記抗體濃度，見(jiàn)表1。

表1 IL-6酶標(biāo)記抗體濃度檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Results of labeled antibody concentrations

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 依次配制不同濃度的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品(1 000、500、200、50、5、0 pg/ml)，采用每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)3次，得到一組對(duì)應(yīng)的IL-6濃度與發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度值。建立四參數(shù)擬合數(shù)學(xué)模型，以濃度的lg值為X，以光信號(hào)強(qiáng)度的lg值為Y，函數(shù)方程為Y=(8.270 65-3.725 51)/[1+(X/35.563 55)^(-0.489 29)]+3.725 51，R2=0.999，見(jiàn)圖2。

圖2 IL-6磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2 Standard curve of IL-6 magnetic particle chemiluminescence assay

2.3分析性能評(píng)估

2.3.1靈敏度 按照CLSI EP17-A文件，對(duì)靈敏度的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行分析和計(jì)算，得到LoB、LoD、FS各為0.5 pg/ml、2 pg/ml、2.5 pg/ml。

2.3.2精密性 對(duì)高、中、低值三個(gè)標(biāo)本分別80個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，分析內(nèi)精密度、分析間精密度均小于10%，總不精密度小于15%，見(jiàn)表2。

表2 IL-6磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑精密度檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Precision of IL-6 magnetic particle chemiluminescence assay

2.3.3線(xiàn)性范圍 10組線(xiàn)性標(biāo)本回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.990，且每個(gè)標(biāo)本的實(shí)際測(cè)得濃度與理論濃度的相對(duì)偏差均小于10%，以一組標(biāo)本為例，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。因此本研究建立的IL-6檢測(cè)方法的線(xiàn)性范圍為3～1 000 pg/ml。

表3 IL-6磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑線(xiàn)性范圍檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Linear range of IL-6 magnetic particle chemilum-inescence assay

2.3.4最大稀釋倍數(shù) 由表4可得，此方法中稀釋倍數(shù)為8，10個(gè)標(biāo)本的偏差均 ≤ 15%，故此方法的最大稀釋倍數(shù)為8倍。

表4 IL-6磁微粒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑最大稀釋倍數(shù)檢測(cè)結(jié)果Tab.4 Maximum dilution factor of IL-6 magnetic particle chemiluminescence assay

2.3.5準(zhǔn)確度 選擇線(xiàn)性范圍內(nèi)的高值血清，用接近0值的陰性血清按1∶9的比例稀釋?zhuān)瞥苫厥諛?biāo)本，回收率在(100±15)%為符合需要。由表5可知，實(shí)驗(yàn)中的10個(gè)標(biāo)本的回收率均在誤差范圍內(nèi)，故此方法的回收率滿(mǎn)足要求。

表5 IL-6磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑回收率檢測(cè)結(jié)果Tab.5 Recovery rate of IL-6 magnetic particle chemiluminescence assay

2.3.6干擾實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)備IL-6濃度高、低值血清待測(cè)標(biāo)本，分別將不同濃度的血紅蛋白、三酰甘油、 膽紅素加入2份待測(cè)標(biāo)本中作為干擾標(biāo)本，同時(shí)以添加相同體積的體系緩沖液作為基礎(chǔ)標(biāo)本，來(lái)得到干擾率，由表6可知，血紅蛋白、三酰甘油、膽紅素濃度分別≤200 mg/dl、2 000 mg/dl、45 mg/dl時(shí)，干擾率≤15%IL-6的檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著影響。

表6 IL-6磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑干擾實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果Tab.6 Interference rate of IL-6 magnetic particle chemiluminescence assay

2.3.7方法學(xué)比對(duì) 根據(jù)EP09-A2文件，采用安圖和羅氏操作系統(tǒng)，分別測(cè)定100份臨床血清，以羅氏IL-6檢測(cè)結(jié)果為X軸，以基于本方法的安圖IL-6檢測(cè)結(jié)果為Y軸，如圖3所示，線(xiàn)性回歸方程為：Y=0.955 X+9.263，R2=0.993 2。

圖3 兩種系統(tǒng)測(cè)試結(jié)果相關(guān)性擬合曲線(xiàn)Fig.3 Correlation curve of test results of two system

3 討論

IL-6是一種功能廣泛的細(xì)胞因子，也是一種重要的炎癥因子，在發(fā)生內(nèi)外傷、外科手術(shù)、感染、腦死亡及其他情況的急性炎癥反應(yīng)過(guò)程中，IL-6會(huì)快速生成，同時(shí)IL-6在慢性炎癥反應(yīng)(如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)中也扮演重要角色[11，12]。能夠準(zhǔn)確快速地定量檢測(cè)體內(nèi)血清或血漿中IL-6水平，對(duì)炎癥、感染性疾病等患者具有重要的臨床指導(dǎo)意義。本研究采用雙抗體夾心法，基于安圖磁微粒發(fā)光系統(tǒng)，建立了IL-6磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量檢測(cè)法。

本文介紹的IL-6檢測(cè)方法，其LoB、LoD、FS分別為0.5 pg/ml、2 pg/ml、2.5 pg/ml；且精密度良好，分析內(nèi)變異≤7%，分析間變異≤10%，總不精密度≤12%；線(xiàn)性范圍3～1 000 pg/ml，若有超限標(biāo)本，最大稀釋倍數(shù)為8倍，即將超限標(biāo)本與稀釋液最大按1∶7稀釋可計(jì)算其具體濃度；其回收率在(100±15)%以?xún)?nèi)，符合要求；另外，標(biāo)本中的血紅蛋白、三酰甘油、膽紅素濃度分別為200 mg/dl、2 000 mg/dl、45 mg/dl時(shí)，其檢測(cè)結(jié)果基本不受影響。且利用本檢測(cè)系統(tǒng)與試劑與羅氏檢測(cè)系統(tǒng)與試劑平行檢測(cè)100份血清標(biāo)本，結(jié)果顯示二者有較高的擬合性，其斜率為0.955，相關(guān)性R2≥ 0.99。

本研究建立的IL-6定量檢測(cè)的方法具有快速、高通量、高靈敏度、高精密度和高特異性等優(yōu)點(diǎn)，可滿(mǎn)足臨床IL-6定量分析的需要，為術(shù)后患者恢復(fù)過(guò)程的監(jiān)測(cè)及炎癥甚至膿毒癥的早期臨床預(yù)警診斷提供幫助，如反映炎癥活動(dòng)情況及疾病嚴(yán)重程度，且與進(jìn)口試劑相比價(jià)格相對(duì)低廉，性?xún)r(jià)比高，能夠緩解患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，有較大的臨床使用價(jià)值。