超聲微泡介導miR-126通過調節(jié)CRK抑制乳腺癌細胞生長①

李 敏 王健寶 楊大艷

(海南省瓊海市人民醫(yī)院超聲科，瓊海 571400)

乳腺癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤[1]。其中，三陰性乳腺癌占所有乳腺癌的15%，與其他乳腺癌亞型相比，其長期預后較差,是全球女性死亡的重要原因[2]。手術切除是目前最有效的治療手段，盡管如此，三陰性乳腺癌的復發(fā)率仍然很高[3]。另外，由于缺乏分子靶標，目前化學療法是唯一可用于三陰性乳腺癌的全身性治療方法。早期三陰性乳腺癌患者接受化療后，約30%～40%的患者已發(fā)展為轉移性疾病并因此死亡[4]。因此，迫切需要尋找有效的三陰性乳腺癌分子靶標及開發(fā)新的治療策略。

microRNA(miRNA)是長度約18～22 bp的內源非編碼RNA，可以與目標mRNA 3′-UTR區(qū)的目標位點結合而參與轉錄后基因調控，從而引起目標mRNA降解或翻譯抑制[5]。據(jù)報道，miRNA通過根據(jù)細胞環(huán)境特異性調節(jié)其靶基因的表達來充當致癌基因或抑癌基因[6]。在乳腺癌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多miRNA的異常表達[7]。并且一些miRNA在乳腺癌中的作用已經(jīng)被研究，例如miR-145-5p通過靶向SOX6抑制乳腺癌細胞活力[8]；miR-328-5p通過抑制RAGE的表達從而調控三陰性乳腺癌細胞增殖[9]。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者中miR-126表達異常，在乳腺癌細胞侵襲和血管生成中發(fā)揮重要作用，因此miR-126可能是乳腺癌診斷、治療和預后的有效分子靶標[10，11]。

CRK(CRK proto-oncogene，adaptor protein)是細胞內一種重要的信號接合物蛋白，參與細胞內受體整合蛋白和酪氨酸激酶等網(wǎng)絡信號分子的信號傳導。在許多癌癥中發(fā)現(xiàn)CRK有助于腫瘤的發(fā)展和轉移[12-14]。在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)CRK的表達與乳腺癌預后不良有關[15]。且CRK被發(fā)現(xiàn)是miR-126的靶標基因，在許多種癌癥，例如胃癌、胰腺癌和非小細胞肺癌等中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-126通過調控CRK的表達影響腫瘤惡性生物學行為[16-18]。但miR-126是否通過調節(jié)CRK的表達影響乳腺癌的發(fā)展還不得而知。

目前已經(jīng)針對癌癥治療開發(fā)了一系列基因療法，其中超聲微泡介導的基因傳遞可提高基因的傳遞效率且不引起細胞損傷，可能是未來癌癥基因治療的有效手段。為此，本研究利用超聲技術提取脂質微泡，與miR-126模擬物融合，在體外探究超聲介導的miR-126對乳腺癌細胞增殖、侵襲和凋亡的作用。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床樣本 選取我院2018年1月～2019年10月手術切除并經(jīng)病理鑒定的72例女性乳腺癌患者的癌組織和癌旁組織。按照TNM分期標準進行分期，其中Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期42例。其中40歲以下34例，40歲及以上患者38例。所有患者術前均未經(jīng)放療或化療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者知情同意。

1.1.2主要試劑 胰蛋白酶、胎牛血清、不完全培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素和LipofectamineTM2000 Reagent購于Invitrogen公司；TRIzol RNA提取試劑盒購于北京天健生物技術有限公司；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、PrimescripTMRT reagent Kit、miRNA PrimescripTMRT reagent Kit購于TaKaRa公司；引物委托Sangon Biotech(中國上海)合成；蛋白提取試劑盒購于南京凱基生物公司；Bcl-2、Bax、c-Caspase-3、pro-Caspase-3和GAPDH特異性抗體以及二抗IgG2購于美國Abcam公司；MTT試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天公司；Cell-light EdU熒光檢測試劑盒購于廣州銳博生物科技有限公司；Trasnwell小室購于Millipore公司。

1.1.3細胞來源 乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231(三陰性)以及人正常乳腺上皮細胞MCF-10A購于中國科學院細胞庫。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 在含有100 U/ml青霉素、50 mg/ml鏈霉素的10 %胎牛血清的完全培養(yǎng)基(DMEM/FBS)中貼壁生長培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。

1.2.2細胞轉染和處理 MDA-MB-231細胞按1×105個/孔接種于6孔板，在37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。使用LipofectamineTM2000與NC mimic、miR-126 mimic、NC-OE和CRK-OE質粒輕輕混勻后靜置，室溫孵育20 min后加入細胞培養(yǎng)液上清，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。使用RT-PCR和Western blot檢測miRNA的轉染效率。

1.2.3微泡的制備 參照文獻[19]的實驗方案，制備微泡。將聚乙二醇40硬脂酸酯(1 mg/ml)、1-雙硬脂?；字Ｄ憠A(2 mg/ml)、1,2-雙硬脂?；?3三氟甲基丙烷(0.4 mg/ml)和十氟丁烷混合置于超聲鍋中，超聲獲得陽離子脂質MB。通過倒置熒光顯微鏡和納米粒度分析儀來觀察和檢測合成的MB。利用無菌濾膜過濾得到純凈無菌的MB。將1 μg miR-mimic與50 μl MB懸浮液混合，并在37℃下培養(yǎng)30 min。用0.16 mol/L PBS洗去未結合的miR-126，得到miR-126-MB。

1.2.4qPCR檢測mRNA表達 根據(jù)試劑盒說明書提取乳腺癌組織和細胞的總RNA，將RNA濃度統(tǒng)一稀釋為500 ng/μl。使用PrimeScript RT和miRNA PrimescripTMRT試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒作為qPCR擴增模板。在LightCycle 96熒光定量PCR儀上進行qPCR。U6和GAPDH分別用作miR-126和CRK的內參，2-ΔΔCt法計算相對表達量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物列表Tab.1 Primer list of RT-qPCR

1.2.5Western blot 利用RIPA從組織或細胞中分離出蛋白質。將相同濃度的蛋白質與上樣緩沖液混合后95℃煮沸10 min，然后將20 μl的混合物加入10%的聚丙烯酰胺凝膠平板中，電泳分離蛋白質。將蛋白質從凝膠轉移到PVDF膜上，封閉，在4℃下與一抗(1∶3 000)孵育過夜。樣品用TBST洗滌，與二抗(1∶10 000)在室溫黑暗環(huán)境下孵育1 h。GAPDH用作內參，用ImageJ測定蛋白條帶灰度。

1.2.6細胞活力 刮取培養(yǎng)基上生長的MDA-MB-231細胞置于無血清培養(yǎng)液中，懸浮培養(yǎng)。在96孔板中按5 000個/孔接種細胞。轉染后，加入10 μl PBS溶解的MTT溶液，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)4～6 h，吸去孔內培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO，振蕩10 min，用酶標儀在570 nm處檢測吸光度值。

EdU染色法：使用Cell-light EdU熒光檢測試劑盒測定細胞活力。按照說明進行操作，在熒光顯微鏡下隨機選取視野進行拍攝。藍色熒光代表所有細胞，而紅色熒光代表由EdU染色的細胞。

1.2.7細胞凋亡測定 各組MDA-MB-231細胞在轉染48 h之后，低速離心5 min，棄上清，PBS洗滌細胞1次，棄上清。在6孔板中按1×105個/孔接種細胞并繼續(xù)培養(yǎng)12 h，然后根據(jù)試劑盒的操作流程，利用流式細胞儀檢測不同處理下細胞的凋亡情況。

1.2.8細胞侵襲測定 將1×105個轉染后的MDA-MB-231細胞接種于Matrigel覆蓋的Transwell小室上層，底部充滿常規(guī)培養(yǎng)基。24 h后取出小室，乙酸和甲醛的混合液固定細胞15 min，PBS沖洗3次，用棉簽擦去未穿過小室的細胞，結晶紫染色后用PBS沖洗3次。隨機選擇視野進行拍照，Image J軟件計算發(fā)生侵襲的細胞數(shù)目。

1.3統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism8軟件繪圖并進行統(tǒng)計分析。組間數(shù)據(jù)差異采用t檢驗(Student′sttest)和單因素方差分析(one-way ANOVA)，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1miR-126在乳腺癌組織和細胞中表達下調 miR-126在乳腺癌組織中的表達量顯著低于癌旁組織(圖1A)。相比于MCF-10A細胞，兩種乳腺癌細胞中miR-126的表達都明顯降低，在三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231中miR-126的表達量低于MCF-7細胞系，在三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231中的表達變化更為明顯(圖1B)。因此后續(xù)實驗采用MDA-MB-231細胞。

圖1 miR-126在乳腺癌組織和細胞系中的表達情況Fig.1 Expression level of miR-126 on breast cancer tissues and cells

2.2miR-126表達與臨床乳腺癌發(fā)展有關 分析72例患者乳腺癌組織中miR-126的表達情況和患者年齡、腫瘤大小和腫瘤分期等指標的關系，結果表明miR-126的表達與患者年齡、是否絕經(jīng)無顯著相關性，而與乳腺癌腫瘤大小、是否為三陰性和腫瘤分期顯著相關。見表2。

表2 miR-126表達與乳腺癌臨床特征的關系(n)Tab.2 Relationship of miR-126 expression and clinical features of breast cancer(n)

2.3微泡的鑒定 熒光顯微鏡檢查結果顯示微泡呈球形且均勻分散，無明顯聚集(圖2A)。大部分微泡直徑約5 μm(圖2B)。將微泡與正常乳腺細胞MCF-10A共培養(yǎng)，結果顯示微泡對MCF-10A細胞活力無影響(圖2C)。

圖2 微泡的鑒定Fig.2 Identification of microbubbles

2.4超聲微泡介導的miR-126顯著抑制乳腺癌細胞活力 用miR-126 mimic轉染細胞或用miR-126-MB處理細胞，qPCR檢查各組細胞中miR-126的表達情況(圖3A)。相比于對照組、空載組和微泡組，miR-126 mimic組和miR-126-MB組的細胞活力和侵襲能力顯著降低，并且miR-126-MB組細胞活力和侵襲能力比miR-126 mimic組更低(P<0.05，圖3B、C)。流式細胞術和Western blot結果表明，過表達miR-126和微泡介導的miR-126導致MDA-MB-231細胞凋亡比例增加，尤其超聲微泡介導的miR-126顯著增加乳腺癌細胞凋亡比例(P<0.05，圖3D、E)。

圖3 微泡介導的miR-126對乳腺癌細胞活力的影響Fig.3 Effects of ultrasound-microbubbles-mediated miRNA-126 on activities of breast cancer cells

2.5miR-126調節(jié)CRK的表達 檢測miR-126對CRK mRNA和蛋白水平的影響，結果發(fā)現(xiàn)過表達miR-126導致CRK水平降低，微泡介導的miR-126進一步抑制CRK表達(P<0.05，圖4A、B)。

圖4 miR-126在乳腺癌細胞中靶向調節(jié)CRK表達Fig.4 miR-126 regulated CRK expression in breast cancer cell

2.6超聲微泡介導miR-126通過調節(jié)CRK抑制乳腺癌細胞活性 功能性實驗結果顯示，過表達CRK顯著提高了MDA-MB-231細胞的活力和侵襲能力，并抑制了MDA-MB-231細胞凋亡，但是同時過表達miR-126和CRK導致MDA-MB-231細胞活力部分降低，并且微泡介導的miR-126進一步降低了CRK誘導的MDA-MB-231細胞活力(圖5)。

圖5 miR-126通過調節(jié)CRK的表達抑制乳腺癌細胞活力Fig.5 miR-126 inhibited activities of breast cancer cells by regulating CRK expression

3 討論

乳腺癌是女性致命癌癥，尤其是三陰性乳腺癌由于早期缺乏可靠的標記物導致5年生存率較低[21]。目前已經(jīng)證實miR-126在乳腺癌中的作用，miR-126過表達抑制了MCF-7細胞增殖和乳腺癌中血管生成[11]。另外，超聲微泡是眾所周知的納米氣泡，具有高安全性、穩(wěn)定性和提高轉染效率的優(yōu)點[22]。超聲微泡介導的miRNA基因療法的可行性已經(jīng)在肺癌、肝癌等癌癥中被證實[23,24]。因此，假設超聲微泡介導的miR-126在乳腺癌細胞活力中可能具有抑制作用。相應的結果表明，miR-126的過表達顯著抑制了三陰性乳腺癌MDA-MB-231的細胞活力和侵襲能力，并且由超聲微泡介導的miR-126可以進一步增強miR-126對MDA-MB-231生長的抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-126在乳腺癌組織和細胞中表達下調，與既往研究結果一致[10]。同時，調查miR-126的表達與乳腺癌患者的臨床特征發(fā)現(xiàn)，在腫瘤直徑大于2 cm患者、三陰性乳腺癌患者和TMN分期為3～4期的患者中miR-126表達明顯下調。該結果表明，miR-126有望作為三陰性乳腺癌的診斷、治療和預后的關鍵分子靶標，功能性實驗表明miR-126的過表達顯著抑制了MDA-MB-231細胞活力和侵襲能力，并有效誘導其凋亡，與既往研究結果一致[25]。但王承正等[26]研究發(fā)現(xiàn)miR-126對MDA-MB-231細胞侵襲能力有一定影響，而對增殖能力無明顯影響。鑒于miR-126在多種癌細胞中被證明對細胞增殖有抑制作用，而且本研究EdU染色結果也表明miR-126對MDA-MB-231細胞活力有一定影響。且由超聲微泡介導的miR-126具有更強的效果。說明超聲微泡介導的miR-126有望成為治療乳腺癌的一種有效方法。

此外，CRK是miR-126的特異性靶標。先前一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CRK具有調節(jié)腫瘤發(fā)展的作用。例如在膀胱癌中，CRK通過HGF/c-Met反饋環(huán)誘導膀胱癌細胞的上皮-間質轉化和轉移[6]；另外，CRK的失調會促進胃癌的發(fā)展[27]。重要的是，在乳腺癌中也證實了CRK作為促癌基因影響腫瘤的生長和轉移，CRK通過促進PD-L1的表達促進三陰性乳腺癌小鼠中EMT過程和免疫逃逸[28]；另外，CRK的磷酸化水平也和乳腺癌致瘤性和轉移有關[29]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-126能特異性調控CRK的表達并抑制MDA-MB-231細胞活力。該結果進一步說明miR-126作為三陰性乳腺癌分子靶標的可行性。

本研究證實miR-126在體外具有抑制三陰性乳腺癌細胞生長的能力，并且通過超聲微泡介導的miR-126進一步增強了這種抑制作用。本研究的結果證明超聲微泡介導的miRNA是一種有效的基因療法。同時，也探究了miR-126對CRK的調控作用，當然，miR-126的下游分子靶標不止CRK，但是該研究為下一步探索miR-126的其他靶標奠定了理論基礎，也為乳腺癌的臨床治療提供了理論支持。