IL-2與IL-33佐劑增強(qiáng)銅綠假單胞菌外膜囊泡的免疫保護(hù)效果①

肖 非 曹二龍 卿 蕊 胡 智

(邵陽(yáng)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，邵陽(yáng) 422000)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，Pa)是一種廣泛存在于人體內(nèi)的革蘭氏陰性條件致病菌，可導(dǎo)致泌尿道、燒傷創(chuàng)面、下呼吸道等多種組織系統(tǒng)的嚴(yán)重感染[1]。研究表明，Pa是引起院內(nèi)和社區(qū)獲得性感染的主要原因之一，特別對(duì)于免疫系統(tǒng)較弱的人群，包括囊性纖維化以及手術(shù)治療患者，其對(duì)Pa感染更為敏感[2]。而隨著多重耐藥菌株乃至泛耐藥菌株的出現(xiàn)，Pa相關(guān)感染的治療難度也越來(lái)越大，常規(guī)抗生素藥物已無(wú)法滿足目前的治療需求[3]。因此，開發(fā)相關(guān)疫苗是預(yù)防Pa流行性暴發(fā)的有效手段[4]。

外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)是Pa在感染過(guò)程中分泌釋放到外膜的重要成分，具有多種生物學(xué)功能，其對(duì)于Pa的定植以及生存至關(guān)重要[5]。既往研究表明，腦膜炎奈瑟菌、幽門螺桿菌、肺炎克雷伯菌等多種革蘭氏陰性菌的OMVs均具有較強(qiáng)的免疫原性，能夠在動(dòng)物感染模型中提供保護(hù)性免疫[6-8]。最新研究證實(shí)Pa-OMVs也具有上述作用[9]。盡管如此，Pa-OMVs作為免疫抗原仍然存在效力較弱、持續(xù)時(shí)間較短等問(wèn)題。因此，尋找合適的疫苗佐劑來(lái)增強(qiáng)OMVs的免疫效果十分必要。本研究通過(guò)明確IL-2、IL-33佐劑對(duì)Pa-OMVs抗感染免疫保護(hù)作用的影響，以期為Pa臨床疫苗的開發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料 銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC-27853)購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；IL-2、IL-33佐劑購(gòu)自BD Pharmingen公司；6～8周雌性BALB/c小鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)有限公司(SCXK湘2016-0002)；Goat anti-mouse IgG、IgG1、IgG2a、IgA二抗購(gòu)自Proteintech公司；Mouse IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12 ELISA試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；Mouse CD4、CD8 蛋白ELISA試劑盒購(gòu)自武漢塞培生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)試劑、耗材均購(gòu)自上海生物工程股份有限公司。

1.2方法

1.2.1OMVs提取與純化 Pa中加入LB培養(yǎng)基并于37℃振蕩培養(yǎng)。依據(jù)參考文獻(xiàn)[9]提取OMVs。具體操作如下：收取Pa進(jìn)行超聲破碎，破碎后10 000 r/min離心20 min，用0.22 μm濾網(wǎng)過(guò)濾上清，超濾收集OMVs。BCA法測(cè)定OMVs濃度后于-80℃保存。

1.2.2小鼠分組與免疫接種 90只6～8周雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組：OMVs-IL-2組、OMVs-IL-33組、OMVs組及IL-2、IL-33對(duì)照組。將提取的OMVs(1 mg/ml)與IL-2、IL-33佐劑等量混合后皮下注射免疫小鼠3次(50 μl/只)，陰性對(duì)照組分別通過(guò)皮下注射給予50 μl IL-2以及IL-33，間隔2周。末次免疫2周后取小鼠血清，無(wú)菌條件下取小鼠脾細(xì)胞制成細(xì)胞懸液待用。

1.2.3血清抗體檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清抗體水平。將OMVs用包被液稀釋后加入96孔板中，0.4 μg/孔，4℃包被過(guò)夜。收集上述小鼠血清按1∶1 000稀釋后作為一抗加入96孔板中室溫孵育2 h。隨后將HRP連接的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgA稀釋后加入96孔板，37℃孵育1 h。酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定各孔OD值，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平 將上述收集的小鼠脾細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后以2×103個(gè)/孔接種于96孔板中，每只小鼠設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。用10 μg OMVs刺激細(xì)胞同時(shí)以10 μg ConA刺激細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后每孔加入CCK-8溶液10 μl。繼續(xù)培養(yǎng)2 h后于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定各組OD值。刺激指數(shù)(SI)=(刺激組OD值-空白組OD值)/(未刺激組OD值-空白組OD值)。

1.2.5ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子及CD4、CD8蛋白水平 將上述收集的小鼠脾細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后以1×106個(gè)/ml加入24孔板，1 ml/孔。并在每孔細(xì)胞中加入20 μg OMVs進(jìn)行刺激。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞上清，并按照Mouse IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、CD4、CD8 ELISA試劑盒說(shuō)明書要求檢測(cè)各細(xì)胞因子以及CD4、CD8蛋白水平。

1.2.6菌體載量以及組織學(xué)分析 末次免疫2周后，Pa菌標(biāo)準(zhǔn)株滴鼻感染小鼠(4×106CFU/只)，并記錄各組小鼠感染后10 d內(nèi)的死亡情況并計(jì)算死亡率。隨后于感染后10 d處死小鼠，并取小鼠肺組織進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)：加入無(wú)菌PBS將肺組織研磨成勻漿，1∶10稀釋后涂于LB平板中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后菌落計(jì)數(shù)。同時(shí)取肺組織進(jìn)行HE染色：將收集的肺組織用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片后進(jìn)行HE染色分析。

2 結(jié)果

2.1小鼠血清IgA與IgG及其亞類水平 ELISA結(jié)果顯示，末次免疫2周后OMVs組血清IgG、IgA水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且OMVs-IL-33與OMVs-IL-2組明顯高于單獨(dú)OMVs組(P<0.05)，但單獨(dú)的分子佐劑并不能促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體(圖1A)。此外，IL-33與IL-2佐劑(OMVs-IL-33、OMVs-IL-2組)同樣能夠有效提升OMVs產(chǎn)生的血清IgG1、IgG2a水平，且各實(shí)驗(yàn)組中IgG2a/IgG1均>1(圖1B)。

圖1 免疫小鼠血清IgG、IgA以及IgG亞類水平Fig.1 Levels of serum IgG,IgA and IgG subclass in immunized mice

2.2淋巴細(xì)胞增殖水平 CCK-8結(jié)果顯示，末次免疫2周后，加入IL-33與IL-2佐劑的OMVs組脾細(xì)胞SI明顯高于單獨(dú)OMVs組及對(duì)照組(P<0.05)，且與ConA陽(yáng)性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

圖2 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平Fig.2 Level of lymphocyte proliferation in immunized mice

2.3細(xì)胞因子檢測(cè) 如圖3A所示，OMVs-IL-2、OMVs-IL-33組小鼠脾細(xì)胞中IFN-γ以及IL-2水平均顯著高于OMVs組與對(duì)照組(P<0.05)，但脾細(xì)胞上清中Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-6在各組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B)。此外，添加IL-33與IL-2佐劑同樣能夠提高細(xì)胞上清中IL-12水平(圖3C)。

圖3 ELISA檢測(cè)免疫小鼠脾細(xì)胞上清細(xì)胞因子水平Fig.3 Levels of cytokines in spleen cell supernatant of immunized mice detottod by ELISA

2.4CD4、CD8 蛋白水平檢測(cè) 進(jìn)一步檢測(cè)免疫小鼠脾細(xì)胞上清中CD4、CD8蛋白水平,結(jié)果如圖4所示，加入IL-33與IL-2佐劑的免疫小鼠脾細(xì)胞上清中CD4 蛋白水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05,圖4A)。此外，OMVs-IL-2 以及 OMVs-IL-33組小鼠CD8蛋白水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05,圖4B)。

圖4 ELISA檢測(cè)免疫小鼠脾細(xì)胞上清CD4、CD8蛋白水平Fig.4 Levels of CD4 and CD8 proteins in supernatant of immunized mice detected by ELISA

2.5抗感染保護(hù)作用 檢測(cè)Pa感染后小鼠的死亡率以及肺組織菌體載量，結(jié)果顯示，應(yīng)用IL-33與IL-2佐劑的實(shí)驗(yàn)組小鼠死亡率以及肺組織菌體載量(圖5A、表1)均顯著低于單純OMVs組與對(duì)照組(P<0.05)。此外，OMVs-IL-33與OMVs-IL-2組的小鼠肺組織病理侵潤(rùn)程度也顯著輕于對(duì)照組(圖5B)。表明分子佐劑能夠顯著增強(qiáng)OMVs的抗感染保護(hù)作用。

表1 各免疫組小鼠Pa攻擊后死亡率Tab.1 Mortality of immunized mice after Pa attack

圖5 Pa感染小鼠肺組織菌體載量及病理侵潤(rùn)情況Fig.5 Bacterial load and pathological invasion of lung tissues in Pa infected mice

3 討論

目前臨床Pa感染治療以抗生素為主，但由于Pa存在天然耐藥性，且耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，使得有效的抗生素越來(lái)越少，治療難度也越來(lái)越大[3,10]。因此，迫切需要新的替代治療策略，而抗感染疫苗就是預(yù)防控制Pa感染的有效手段[11]。OMVs是Pa在感染宿主過(guò)程分泌的毒力因子，參與調(diào)節(jié)Pa的應(yīng)激反應(yīng)，并促進(jìn)宿主免疫應(yīng)答，是一種重要的生物成分。而最新研究表明，Pa-OMVs能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的體液以及細(xì)胞免疫反應(yīng)，進(jìn)而有效減輕Pa感染引起的損傷[9]。因此，以Pa自身成分OMVs為免疫抗原設(shè)計(jì)相關(guān)疫苗將更具優(yōu)勢(shì)[12]。本研究通過(guò)應(yīng)用IL-2、IL-33佐劑增強(qiáng)Pa-OMVs的抗感染保護(hù)效果，以期為加速Pa臨床疫苗的研制提供理論依據(jù)。

IL-2、IL-33是目前應(yīng)用較為廣泛的分子佐劑，其可通過(guò)促進(jìn)T細(xì)胞分化發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用[13]。細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)先天性免疫和獲得性免疫中均能夠發(fā)揮重要作用，同時(shí)還能夠增強(qiáng)疫苗的特異性免疫應(yīng)答。研究表明，應(yīng)用IL-2的Pa外膜蛋白OprI能夠增加免疫小鼠的血清抗體滴度，并減少感染后的病毒載量[14]。此外，其同樣能夠增強(qiáng)不可分型流感嗜血桿菌P6蛋白的免疫保護(hù)作用[15]。IL-33作為一種新的分子佐劑，能夠有效促進(jìn)抗原誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答，并對(duì)高劑量致死的腦膜炎病毒產(chǎn)生顯著的保護(hù)作用[16]。而本研究發(fā)現(xiàn)IL-33與IL-2佐劑均能夠促進(jìn)脾細(xì)胞上清中可溶性CD4、CD8蛋白的產(chǎn)生，這從某種程度上也間接反映了T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平。

細(xì)胞因子作為影響細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要因素，近年來(lái)備受關(guān)注。研究表明，不同細(xì)胞因子均可促進(jìn)B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞進(jìn)而分泌抗體來(lái)發(fā)揮免疫作用[9]。然而由于不同細(xì)胞因子可能會(huì)對(duì)不同免疫細(xì)胞的分化產(chǎn)生不同影響，包括Th1、Th2以及Treg細(xì)胞等，因此作為疫苗佐劑可能也會(huì)發(fā)揮不同的免疫增強(qiáng)作用。這也就可以解釋為什么本研究中IL-2、IL-33佐劑只對(duì)Th1型應(yīng)答有增強(qiáng)作用，而不影響Th2型免疫應(yīng)答。此外，有研究報(bào)道Th細(xì)胞在一定程度上能夠促進(jìn)B細(xì)胞成熟進(jìn)而增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答，其主要通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮作用。而本研究也證實(shí)IL-2、IL-33佐劑在增強(qiáng)Th1型免疫應(yīng)答的同時(shí)，對(duì)體液免疫也有一定的增強(qiáng)作用。

呼吸系統(tǒng)作為Pa感染的主要部位，有效減輕感染后呼吸系統(tǒng)的病理?yè)p傷是評(píng)估疫苗效果重要指標(biāo)[17,18]。細(xì)胞因子作為一種非特異性免疫佐劑，當(dāng)與抗原一起進(jìn)入機(jī)體時(shí)，能夠有效增強(qiáng)抗原的免疫效應(yīng)，進(jìn)而通過(guò)細(xì)胞以及體液免疫發(fā)揮抗感染保護(hù)作用。本研究在檢測(cè)IL-2、IL-33佐劑對(duì)OMVs的免疫增強(qiáng)作用后，進(jìn)一步明確了其抗感染保護(hù)效果。結(jié)果表明IL-2與IL-33佐劑均能夠更好地發(fā)揮OMVs的抗感染作用，并有效減輕感染引起的病理?yè)p傷，是潛在的Pa疫苗佐劑。

綜上所述，通過(guò)檢測(cè)IL-2與IL-33佐劑對(duì)Pa-OMVs免疫效果以及抗感染保護(hù)作用的影響，發(fā)現(xiàn)IL-2與IL-33佐劑均能夠有效增強(qiáng)Pa-OMVs疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答，并顯著提高其抗感染保護(hù)作用。但因細(xì)胞因子佐劑存在穩(wěn)定性較差等問(wèn)題，Pa-OMVs疫苗仍需進(jìn)一步優(yōu)化。