酸棗仁提取物對睡眠剝奪大鼠免疫功能的影響①

趙 翠 張 穎 王 璐 王國玉 陳 軍 曲忠慧 李 偉

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院老年病科，承德 067000)

睡眠是維持生命所需的生物節(jié)律，睡眠剝奪限制了機體正常需要睡眠時間，會使機體產(chǎn)生疲勞感，損害學(xué)習(xí)記憶能力和降低機體免疫能力，增加糖尿病、高血壓、冠心病的發(fā)病風(fēng)險，甚至導(dǎo)致死亡。隨著生活節(jié)奏加快，生活壓力增加，人們趨向于不健康的生活習(xí)慣，越來越多人處于睡眠剝奪的狀態(tài)[1]。研究表明，睡眠剝奪會影響免疫系統(tǒng)功能，包括T細(xì)胞亞群的比例和細(xì)胞因子水平等[2,3]。酸棗仁(Ziziphi Spinosae Semen)是鼠李科棗屬植物干燥種子，具有寧心安神、斂汗、生津、養(yǎng)肝的功效，主要含有皂苷、黃酮、多糖、生物堿和脂肪酸等主要成分[4]。研究表明，酸棗仁提取物具有提高免疫力、鎮(zhèn)靜催眠的作用[5]。目前尚未發(fā)現(xiàn)酸棗仁提取物改善睡眠剝奪的研究報道，因此，本研究主要通過觀察酸棗仁提取物對睡眠剝奪大鼠行為學(xué)、T 細(xì)胞亞群及炎癥因子等免疫指標(biāo)的影響，探討酸棗仁提取物對睡眠剝奪的改善作用并闡明其保護機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康4周齡SD大鼠30只，雄性，體質(zhì)量200～250 g，購自河北省醫(yī)科大學(xué)，合格證號：SYXK(冀)2018-005。飼養(yǎng)溫度(25±2)℃，濕度40%～60%，正常睡眠條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進食和飲水。

1.1.2藥物與試劑 高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；-80℃冰箱(日本三洋公司)；流式細(xì)胞儀(山東萊索科技有限公司)；TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6 ELISA試劑盒(Biolegend公司)；中藥酸棗仁購自河北省中醫(yī)院。

1.2方法

1.2.1藥材處理 酸棗仁粉碎后精密稱取200 g，加入石油醚于60℃下加熱4 h脫脂，加入70%乙醇85℃下回流除去皂苷、黃酮等成分，殘渣干燥后加入蒸餾水煎煮2 h，溶液濃縮后加入95%乙醇，得到沉淀靜置后3 000 r/min離心15 min，棄上清，溶于水再次加入乙醇沉淀，得到水提物，干燥后備用[6]。

1.2.2動物分組與處理 30只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、實驗組，每組10只。模型組、實驗組建立睡眠剝奪模型。造模后，實驗組灌胃給予酸棗仁提取物7.5 g/kg(按人體60 kg計算，酸棗仁的成人日用量為25 g/kg，大鼠給藥劑量為成人日用量的6倍，150 g/kg，酸棗仁提取物的生藥量為50 mg/g)，1次/d，連續(xù)給藥7 d。對照組與模型組灌胃給予相同劑量的生理鹽水。

1.2.3動物模型的建立 參考文獻[7]，采用多平臺水環(huán)境法建立大鼠睡眠剝奪模型，鼠籠內(nèi)設(shè)置直徑6.5 cm，高8.0 cm的平臺18個，平臺間隔15 cm。鼠籠注水后水面低于平臺1 cm，保持40 W燈光照射，大鼠放置平臺上，當(dāng)進入快速眼球運動睡眠時，全身骨骼肌張力明顯降低，頸部肌張力降低，引起節(jié)律性低頭，觸水，從而無法進入快速眼球運動睡眠，連續(xù)造模4 d。

1.2.4大鼠行為學(xué)測定 實驗組大鼠睡眠剝奪結(jié)束后進行曠場實驗，通過水平得分與垂直得分評價各組大鼠的行為差異。80 cm×80 cm×40 cm的曠場箱，內(nèi)壁涂黑色，將敞箱底面分成25個面積相等的方格，把大鼠置于曠場箱中央，觀察5 min內(nèi)的行為活動。水平運動得分為穿越底面方格數(shù)，穿越1格得1分，垂直得分為雙足離地的直立次數(shù)，雙足離地1次得1分。

1.2.5脾臟和胸腺指數(shù)的測定 給藥28 d后大鼠摘眼球取血，室溫放置15 min后，3 500 r/min離心5 min，取上清于-80℃冰箱保存。取血后，頸椎脫臼處死，稱量大鼠體質(zhì)量，無菌條件下取脾臟、胸腺稱重，計算臟器指數(shù)：脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/大鼠體質(zhì)量(g)；胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/大鼠體質(zhì)量(g)。

1.2.6脾淋巴細(xì)胞增殖活性的測定 取大鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至1×107個/ml，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μl/孔，設(shè)6個復(fù)孔，其中前3孔加入100 μl ConA(5 μg/ml)，另外3孔不加ConA。置于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后加入MTT(5 mg/ml)，10 μl/孔，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入100 μl 10% SDS，置搖床上低速振蕩15 min，37℃靜置過夜，在酶標(biāo)儀570 nm波長處測量各孔的吸光度(OD值)。大鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力=實驗孔OD值-對照孔OD值[6]。

1.2.7NK細(xì)胞活性測定 實驗前24 h傳代培養(yǎng)靶細(xì)胞YAC-1，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個/ml。取大鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，加入0.5 ml滅菌水裂解紅細(xì)胞，20 s后再加入8 ml Hank′s液，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 ml含10 %小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液，搖勻，加入1 %冰醋酸稀釋，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個/ml。將靶細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板，100 μl/孔，試驗孔加入100 μl脾細(xì)胞(效靶比50∶1)，自然釋放孔加入100 μl培養(yǎng)液，最大釋放孔加入100 μl 2% NP40，37℃培養(yǎng)4 h，離心，取上清100 μl，置96孔酶標(biāo)板，加入LDH基質(zhì)液100 μl反應(yīng)8 min，加入30 μl 1 mol/L HCl終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀492 nm波長處測定OD值。NK細(xì)胞活性(%)= (反應(yīng)孔OD值-自然釋放孔OD值)/(最大釋放孔OD值-自然釋放孔OD值)×100%。

1.2.8外周血T淋巴細(xì)胞亞群測定 取大鼠外周血0.1 ml，加入肝素抗凝，加Anti-mouse CD3 FITC、Anti-mouse CD4 APC、Anti-mouse CD8 PE，室溫下避光孵育20 min，PBS洗滌3次，2 500 r/min離心5 min，棄上清，加入溶血素溶解紅細(xì)胞，離心，棄上清，加入PBS 1 ml，混勻，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.9血清炎癥因子的測定 取大鼠血清，采用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6水平，測定方法嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠曠場實驗結(jié)果 與對照組相比，模型組大鼠水平運動得分和垂直運動得分均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，實驗組大鼠水平運動得分和垂直運動得分均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表1。

表1 各組大鼠曠場實驗分值比較Tab.1 Comparison of field test scores of rats among various

圖1 各組大鼠曠場實驗分值比較Fig.1 Comparison of field tests cores among various groups

2.2各組大鼠脾臟和胸腺指數(shù)比較 與對照組相比，模型組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著降低，與模型組相比，實驗組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、表2。

表2 各組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)比較Tab.2 Comparison of spleen index and thymus index among various

圖2 各組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)比較Fig.2 Comparison of spleen index and thymus index among various groups

2.3脾淋巴細(xì)胞活性和NK細(xì)胞活性檢測結(jié)果 模型組大鼠NK細(xì)胞活性和脾淋巴細(xì)胞的增殖能力明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實驗組大鼠NK細(xì)胞活性和脾淋巴細(xì)胞的增殖能力明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠NK細(xì)胞核脾淋巴細(xì)胞增殖活性比較Tab.3 Comparison of activity of NK cell and splenic lym-phocyte proliferation among various n=10)

2.4外周血T淋巴細(xì)胞亞群測定結(jié)果 與對照組相比，模型組大鼠CD4+T淋巴細(xì)胞比例和CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值顯著降低，CD8+T淋巴細(xì)胞比例顯著上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，實驗組大鼠CD4+T淋巴細(xì)胞含量和CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值顯著上升，CD8+含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4、圖3。

圖3 各組大鼠T淋巴細(xì)胞亞群流式細(xì)胞圖Fig.3 Flow cytometry of T lymphocyte subsets of rats among various groups

表4 各組大鼠T淋巴細(xì)胞亞群比較Tab.4 Comparison of T-lymphocyte subsets of rats among various

2.5血清TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6檢測結(jié)果 與對照組相比，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，實驗組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6水平均顯著降低(P<0.05)，見表5。

表5 各組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6水平比較n=10)Tab.5 Comparison of TNF-α，IL-1β，IL-2，IL-6 of rats among various

3 討論

睡眠是促進生長發(fā)育、形成學(xué)習(xí)記憶能力、維持生理機能必需的節(jié)律。睡眠剝奪會引起神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的失衡，影響生理、心理功能，導(dǎo)致機體產(chǎn)生焦慮、學(xué)習(xí)記憶力下降、免疫功能失調(diào)[9]。焦慮行為對評價睡眠剝奪程度有重要意義。曠場實驗被廣泛地應(yīng)用于評價動物的焦慮行為，其中水平得分反映行為活躍程度，垂直得分反映實驗動物對新環(huán)境的好奇程度。本研究結(jié)果表明，睡眠剝奪使大鼠曠場實驗的水平得分與垂直得分降低，說明大鼠睡眠-覺醒周期紊亂，興奮性增強，認(rèn)知能力下降，給予酸棗仁提取物后得到顯著改善，說明酸棗仁提取物具有鎮(zhèn)靜催眠作用，能夠緩和睡眠剝奪引起的情緒緊張。研究表明，酸棗仁是安神之要藥，其水提物能夠改善中樞CRF/CRF1R信號通路，對焦慮起抑制作用，本研究中曠場實驗結(jié)果與相關(guān)文獻報道一致[10]。

脾臟作為機體最大的免疫器官，是細(xì)胞免疫和體液免疫的主要發(fā)生場所，在機體免疫過程中起重要作用。T淋巴細(xì)胞是調(diào)控機體免疫反應(yīng)的重要的免疫細(xì)胞，CD4+、CD8+T細(xì)胞是其重要組成部分，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值是評價機體免疫功能的重要指標(biāo)[11]。Wilder-Smith等[12]研究發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪會導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞亞群平衡失調(diào)，這可能與睡眠不足導(dǎo)致機體抗感染能力變化有關(guān)。NK細(xì)胞是原始?xì)鸗 細(xì)胞，具有非特異性殺傷功能，其活性能夠直接反映機體細(xì)胞免疫的狀態(tài)[13]。微生物產(chǎn)物和炎癥細(xì)胞因子參與睡眠的過程，其中TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6在睡眠過程中起重要作用[14]。TNF-α是機體受到損害最先分泌的炎癥細(xì)胞因子，同時誘導(dǎo)多種細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生，并誘發(fā)多種細(xì)胞的增殖或凋亡；IL-1β由TNF-α 誘導(dǎo)或由內(nèi)毒素直接刺激產(chǎn)生[15]。CD4+T淋巴細(xì)胞由Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞構(gòu)成，IL-2由Th1輔助細(xì)胞分泌，能提高巨噬細(xì)胞殺菌活性，具有抗腫瘤、抗感染的作用[16]。IL-6由Th2輔助細(xì)胞分泌，主要通過刺激B細(xì)胞生長和分化，參與體液免疫反應(yīng)過程[17]。在睡眠過程中，TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6等細(xì)胞因子具有一定的晝夜節(jié)律性能促進睡眠。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-6水平升高在患者嗜睡的發(fā)病中起重要作用，降低血漿IL-6、TNF-α水平對改善睡眠質(zhì)量有重要意義[18]。

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞活性和NK細(xì)胞活性顯著降低，CD4+T淋巴細(xì)胞比例和CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值顯著下降，CD8+T淋巴細(xì)胞比例顯著升高，TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6水平均顯著上升，說明睡眠剝奪導(dǎo)致機體免疫功能紊亂，處于應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致血清炎癥因子水平升高。給予酸棗仁提取物干預(yù)后，脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞活性明顯改善，T淋巴細(xì)胞亞群恢復(fù)平衡，TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6等細(xì)胞因子水平明顯下降，說明酸棗仁能夠調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞亞群平衡，抑制炎癥因子釋放，改善睡眠剝奪引起的免疫功能紊亂。

綜上所述，酸棗仁提取物對睡眠剝奪大鼠的焦慮行為具有緩解作用，能夠改善睡眠剝奪引起的免疫功能紊亂，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群平衡，抑制血清TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6細(xì)胞炎癥因子釋放。