TRIM31過表達改善脂多糖誘導(dǎo)下神經(jīng)細胞的炎癥損傷①

王 濤 梁日初 周 佳 羅 煒

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科,衡陽 421001)

阿爾茲海默癥(Alzheimer′s disease,AD)和帕金森癥(Parkinson′s disease,PD)等神經(jīng)退行性疾病嚴(yán)重威脅人類健康，其發(fā)病原因復(fù)雜，機制尚未完全明確。炎癥小體介導(dǎo)的炎癥途徑與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1]。NOD樣受體蛋白3(nod-like receptor pyrin domain 3,NLRP3)炎癥小體是機體固有免疫應(yīng)答的重要組成部分，其過度激活可通過活化caspase-1持續(xù)地將無活性的IL-1β前體剪切為成熟IL-1β，激活下游信號通路產(chǎn)生大量的炎癥因子，引起神經(jīng)炎癥反應(yīng)，促進細胞凋亡，導(dǎo)致大腦病變[2]。E3泛素連接酶31(TRIM31)是TRIM家族成員，可通過對特定靶分子進行泛素化修飾和降解，參與細胞增殖、分化、癌變、自噬、凋亡等多種細胞生物學(xué)過程[3]。目前關(guān)于TRIM31的研究較少且主要集中于癌癥研究，如胰腺癌、大腸癌、膽囊癌和肝癌等，關(guān)于其與神經(jīng)退行性疾病的研究鮮有報道[4-7]。研究報道，TRIM31可通過促進NLRP3蛋白酶體泛素化降解，抑制NLRP3炎癥小體活化，推測TRIM31可能通過抑制NLRP3炎癥小體活化改善神經(jīng)細胞炎癥損傷[8]。本研究擬采用LPS誘導(dǎo)PC12細胞建立體外神經(jīng)細胞炎癥損傷模型，探討TRIM31對PC12細胞損傷的保護作用及機制，為神經(jīng)退行性疾病治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞株由上海中科院細胞庫提供；LPS購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；TRIM31過表達質(zhì)粒pcDNA3.1-TRIM31及其陰性對照質(zhì)粒pcDNA3.1-NC均由漢恒生物科技(上海)有限公司構(gòu)建；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18 ELISA試劑盒購自上海卡努生物科技有限公司；MTT檢測試劑盒、BCA試劑盒和Annexin V-FITC流式凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TRIM31、NLRP3、caspase-1、Cleaved-caspase-3、Bcl-2、Bax和GAPDH抗體均購自美國Abcam公司。酶標(biāo)儀、電泳儀購自美國Bio-Rad公司；流式細胞儀購自美國Backman公司。

1.2方法

1.2.1MTT檢測細胞增殖活性 取對數(shù)生長的PC12細胞以5×104個/ml接種于96孔板，每孔100 μl，培養(yǎng)過夜。分別采用0、50、125、250、500和1 000 μg/ml LPS處理細胞24 h，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，37℃孵育4 h，酶標(biāo)儀測定各組490 nm處吸光度值，并計算存活率，選擇最佳細胞損傷濃度進行后續(xù)實驗。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染及分組處理 取對數(shù)生長期PC12細胞，胰酶消化制備單細胞懸液，2×105個/孔接種于6孔板，待細胞融合度達到80%時，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將pcDNA3.1-TRIM31和pcDNA3.1-NC分別轉(zhuǎn)染至PC12細胞，另取不做任何質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PC12細胞作為空白對照組(blank)，分別記為TRIM31組、NC組和blank組。轉(zhuǎn)染48 h后，qRT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染后PC12細胞中TRIM31表達水平以驗證轉(zhuǎn)染效果。將細胞分為4組：①對照組(Control)：PC12細胞不經(jīng)任何處理；②LPS組：PC12細胞經(jīng)500 μg/ml LPS處理24 h；③LPS+NC組：轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒后的PC12細胞，再經(jīng)500 μg/ml LPS處理24 h；④ LPS+TRIM31組：轉(zhuǎn)染TRIM31過表達質(zhì)粒后的PC12細胞，再經(jīng)500 μg/ml LPS處理24 h。

1.2.3ELISA檢測細胞上清中炎癥因子含量 收集各組細胞培養(yǎng)上清，5 000 r/min離心10 min，收集上清，按照試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量。

1.2.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集各組細胞，離心、洗滌后置于流式管，加入195 μl Annexin V結(jié)合液重懸細胞，再加入5 μl Annexin V 染液，振蕩混勻后于室溫下避光孵育15 min，加入10 μl PI染液，室溫下避光孵育10 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5免疫熒光檢測NLRP3蛋白表達 將轉(zhuǎn)染的PC12細胞以1×105個/孔接種于含無菌載玻片的6孔板，待細胞融合度達到70%時，加入500 μg/ml LPS處理24 h。棄細胞培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗3次后以2%BSA室溫封閉1 h，再加入50 μl NLRP3抗體稀釋液，4℃孵育過夜。次日，PBS洗滌并滴加Alexa Fluor?488標(biāo)記的熒光二抗稀釋液，避光室溫孵育30 min，PBS洗滌加入DAPI室溫下染核5 min，PBS洗滌，載玻片上滴加適量抗熒光淬滅封片劑，置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6qRT-PCR檢測基因表達 收集各組細胞，Trizol法提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，熒光PCR擴增儀擴增各基因mRNA，95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算TRIM31、NLRP3和caspase-1 mRNA相對表達水平，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.7Western blot檢測蛋白表達 收集最佳濃度處理后的PC12細胞和未經(jīng)任何處理的PC12細胞沉淀，收集1.2.2各組細胞沉淀，分別加入適量RIPA裂解液于冰上裂解，12 000 r/min于4℃離心20 min，取上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取25 μg 蛋白經(jīng)沸水浴變性后，10% SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗TRIM31、NLRP3、caspase-1、Cleaved-caspase-3、Bcl-2、Bax和GAPDH，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光液，暗室顯影并拍照。Image J軟件對蛋白電泳條帶灰度值進行定量分析。

2 結(jié)果

2.1LPS對PC12細胞增殖活性的影響 MTT檢測結(jié)果顯示，隨LPS干預(yù)濃度提高，PC12細胞增殖活性逐漸降低(F=62.820，P<0.001)。50 μg/ml和125 μg/mlLPS處理對PC12細胞增殖活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。250、500、1 000 μg/ml LPS處理PC12細胞時細胞增殖活性分別為(80.67±4.92)%、(66.01±3.27)%和(43.66±3.30)%，見圖1。根據(jù)MTT結(jié)果選擇500 μg/ml LPS作為后續(xù)實驗工作濃度。

圖1 不同濃度LPS對PC12細胞存活率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of LPS on survival rate of PC12 cells

2.2LPS對PC12細胞TRIM31蛋白表達的影響 500 μg/ml LPS處理PC12細胞24 h后，PC12細胞TRIM31蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，見圖2。

圖2 LPS處理后PC12細胞TRIM31蛋白表達水平Fig.2 Protein expression levels of TRIM31 in PC12 cells after LPS treatment

2.3TRIM31過表達對PC12細胞TRIM31 mRNA和蛋白表達的影響 與blank組相比，NC組PC12細胞TRIM31 mRNA和蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與NC組相比，TRIM31組PC12細胞TRIM31 mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)，見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染后PC12細胞中TRIM31 mRNA和蛋白表達水平Fig.3 mRNA and protein expression levels of TRIM31 in infected PC12 cells

2.4TRIM31過表達對LPS誘導(dǎo)下PC12細胞炎癥因子水平的影響 與Control組相比，LPS組細胞上清IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18表達水平均顯著上升(P<0.01)；與LPS組相比，LPS+TRIM31組細胞上清IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18表達水平均顯著下降(P<0.01)，與LPS+NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組細胞上清IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量Fig.4 Contents of IL-6,TNF-α,IL-1β and IL-18 in cell supernatant of each group

2.5TRIM31過表達對LPS誘導(dǎo)下PC12細胞凋亡的影響 與Control組相比，LPS組細胞凋亡率顯著上升(P<0.01)，細胞內(nèi)Cleaved-caspase-3、Bax蛋白水平顯著上調(diào)(P<0.01)，Bcl-2蛋白水平顯著下調(diào)(P<0.01)；與LPS組相比，LPS+TRIM31組細胞凋亡率顯著下降(P<0.01)，細胞內(nèi)Cleaved-caspase-3、Bax蛋白水平顯著下調(diào)(P<0.01)，Bcl-2蛋白水平顯著上調(diào)(P<0.05)，與LPS+NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖5、6。

圖5 各組細胞凋亡率Fig.5 Apoptosis rate of cells in each group

圖6 各組細胞Cleaved-caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達水平Fig.6 Expression levels of Cleaved-caspase-3,Bcl-2 and Bax proteins in each group

圖8 各組細胞NLRP3和caspase-1表達水平Fig.8 Expression levels of NLRP3 and caspase-1 in each group

2.6TRIM31過表達對LPS誘導(dǎo)下PC12細胞NLRP3炎癥小體活化的影響 與Control組相比，LPS組細胞NLRP3熒光強度顯著增強，細胞內(nèi)NLRP3、caspase-1 mRNA和蛋白表達水平均顯著增加(P<0.01)；與LPS組相比，LPS+TRIM31組細胞NLRP3熒光強度顯著減弱，細胞內(nèi)NLRP3、caspase-1 mRNA和蛋白表達水平均顯著降低(P<0.01)，與LPS+NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖7、8。

圖7 免疫熒光檢測各組細胞中NLRP3表達水平(×200)Fig.7 Expression level of NLRP3 of cells in each group detected by immunofluorescence (×200)

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病呈進行性發(fā)展，且發(fā)病機制不明確，治愈率較低。近年研究已明確NLRP3作用，且在AD、PD等患者中均發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體的活化[9,10]。激活的NLRP3炎癥小體可促進關(guān)鍵致炎因子IL-1β等成熟和分泌，參與內(nèi)在免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥細胞凋亡。神經(jīng)免疫炎癥是級聯(lián)反應(yīng)，事件啟動后將產(chǎn)生大量神經(jīng)免疫炎癥因子，尋找神經(jīng)免疫炎癥的上游因子作為關(guān)鍵靶點，將為根源上遏制神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病提供思路。TRIM31是TRIM家族Ⅴ亞族成員，但其相關(guān)研究報道較少，可能與炎癥和腫瘤相關(guān)，但具體作用機制尚不明確，且其在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中的作用鮮有報道。在靜止和活化的巨噬細胞中，TRIM31可直接與NLRP3炎癥小體結(jié)合，介導(dǎo)其蛋白酶降解維持其低表達，抑制炎癥反應(yīng)，提示TRIM31可能參與AD、PD等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)展[8]。但TRIM31與NLRP3炎癥小體在AD和PD中的關(guān)系如何、TRIM31是否可通過調(diào)控NLRP3炎癥小體活化參與AD和PD病理進程等尚不明確。本研究結(jié)果顯示，LPS處理可抑制PC12細胞TRIM31蛋白表達，而過表達TRIM31可減少PC12細胞炎癥反應(yīng)和細胞凋亡，其作用機制可能與抑制NLRP3炎癥小體活化相關(guān)。

PC12細胞來源于大鼠嗜鉻細胞瘤細胞，具備神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的一般特征，廣泛用于神經(jīng)生理和神經(jīng)藥理學(xué)研究[11]。本研究采用LPS誘導(dǎo)PC12細胞建立體外神經(jīng)細胞炎癥損傷模型，結(jié)果表明LPS劑量依賴性抑制PC12細胞增殖活性，LPS作用濃度為500 μg/ml時，PC12細胞存活率約為65%，與陳艷杰等[12]研究結(jié)果相似。500 μg/ml LPS作用PC12細胞24 h，細胞活力雖有所下降，但活性仍為65%，仍可保持細胞持續(xù)增殖狀態(tài)，符合細胞模型的一般要求，故本研究選取該濃度進行后續(xù)研究。

炎癥因子作為神經(jīng)細胞應(yīng)激活化后釋放的分子在AD和PD等神經(jīng)炎癥中起核心作用。研究證實，AD和PD患者大腦黑質(zhì)和紋狀體組織中存在異常表達的炎癥因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，與神經(jīng)細胞的凋亡和神經(jīng)損傷相關(guān)[13]。Miryam等[14]在AD和PD動物模型中發(fā)現(xiàn)，IL-1β、IL-6等炎癥因子在模型動物海馬組織中高表達。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)下的PC12細胞內(nèi)IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量顯著上升，細胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase-3、Bax蛋白水平顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白水平顯著下調(diào)。轉(zhuǎn)染TRIM31過表達質(zhì)粒后，PC12細胞炎癥因子、細胞凋亡率及Cleaved-caspase-3和Bax蛋白明顯下調(diào)，Bcl-2蛋白上調(diào)，提示TRIM31可能減少炎癥物質(zhì)分泌，改善PC12細胞炎癥損傷，減少細胞凋亡。

NLRP3炎癥小體由NLRP3炎癥小體受體蛋白、ASC銜接蛋白和caspase-1構(gòu)成，是炎癥因子成熟的重要途徑，在IL-1β、IL-18等炎癥因子釋放過程中發(fā)揮重要作用。NLRP3炎癥小體異?；罨蓪?dǎo)致包括神經(jīng)退行性疾病在內(nèi)的多種炎癥性疾病[15]。Heneka等[16]發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體激活可促進APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白沉積和AD病理進程，NLRP3基因敲除小鼠可顯著緩解空間記憶障礙。Gordon等[17]發(fā)現(xiàn)PD模型小鼠大腦黑質(zhì)IL-1β、caspase-1和NLRP3表達顯著上調(diào)，但經(jīng)NLRP3抑制劑MCC950治療后，PD小鼠運動能力明顯改善，提示NLRP3可能是AD、PD等神經(jīng)退行性疾病的潛在靶點。TRIM31可促進NLRP3蛋白酶體泛素化降解[8]。為進一步明確TRIM31與NLRP3炎癥小體在神經(jīng)細胞炎癥損傷中的調(diào)控作用，本研究檢測各組細胞NLRP3和caspase-1表達水平，結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)PC12細胞后，細胞NLRP3和caspase-1表達顯著上調(diào)，說明NLRP3炎癥小體被激活。轉(zhuǎn)染TRIM31過表達質(zhì)粒后，細胞NLRP3和caspase-1表達被顯著抑制，說明過表達TRIM31可能促進NLRP3蛋白酶體泛素化降解，抑制NLRP3炎癥小體活化，進而抑制LPS誘導(dǎo)的PC12細胞炎癥損傷。

綜上所述，過表達TRIM31可通過抑制NLRP3炎癥小體活化，減輕LPS誘導(dǎo)下PC12細胞內(nèi)炎癥反應(yīng)，減少細胞凋亡，緩解PC12細胞炎癥損傷，為AD和PD等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的防治提供全新的藥物作用靶點。臨床應(yīng)用該類藥物時可通過設(shè)計合成TRIM31小分子激動劑或?qū)ふ姨烊换衔镒饔糜谠摪悬c，并進行化學(xué)修飾、制劑改造、聯(lián)合用藥、超聲波干預(yù)等，促使其進入血腦屏障。