微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-異亮氨酸的研究進(jìn)展

孔 帥，方應(yīng)浩，周 航，許鵬飛，楊 瀟，任立偉，龔大春*

（1.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué) 湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心，湖北 宜昌 443002；3.三峽大學(xué) 中國輕工業(yè)功能酵母重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002）

FISCHER于1901年第一次從蛋白質(zhì)的水解液中發(fā)現(xiàn)了和L-亮氨酸旋光度不同的物質(zhì)[1]，L-異亮氨酸這種物質(zhì)由此問世。L-異亮氨酸作為人和動(dòng)物體內(nèi)所必需的分支氨基酸之一，在食品、牲畜飼料和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的市場及應(yīng)用前景[2]。如功能性飲料中添加L-異亮氨酸，能有效的防止肌肉損傷，提高運(yùn)動(dòng)員的耐力[3]；毛湘冰等[4]在仔豬飼料中添加適量L-異亮氨酸能改善其回腸屏障功能，能有效預(yù)防輪狀病毒引起的腹瀉疾??；L-異亮氨酸還能在葡萄糖協(xié)同作用下促進(jìn)人體內(nèi)胰島素的分泌，達(dá)到迅速降低血液中的血糖濃度的目的，因而能有效的預(yù)防肥胖人群易得的突發(fā)性高血糖病癥[5]。

L-異亮氨酸在1904年第一次被EHRLICH從甜菜糖漿中分離出來[6]。隨著對制造L-異亮氨酸的不斷深入研究，人們開始在工業(yè)上大規(guī)模的生產(chǎn)L-異亮氨酸。相比利用蛋白質(zhì)水解法和化學(xué)合成法生產(chǎn)L-異亮氨酸，微生物發(fā)酵法在生產(chǎn)過程中綠色環(huán)保、成本大大減少、反應(yīng)易控制以及能適用于大規(guī)模的生產(chǎn)，是現(xiàn)在工業(yè)上生產(chǎn)L-異亮氨酸的主要方法。微生物發(fā)酵法包括添加前體物發(fā)酵法和直接發(fā)酵法。添加前體物發(fā)酵法因前體物作為中間代謝產(chǎn)物能夠直接參與L-異亮氨酸的合成，故而L-異亮氨酸生物合成路徑中的關(guān)鍵酶受到的反饋調(diào)節(jié)作用較小，能較快的生成終產(chǎn)物，但前體物價(jià)格昂貴，并不適用于大規(guī)模的工業(yè)發(fā)酵。相對于添加前體物發(fā)酵法，利用直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-異亮氨酸的成本要少的多，得以被大多數(shù)企業(yè)采納用來生產(chǎn)L-異亮氨酸。本文對L-異亮氨酸的生物合成途徑及調(diào)控機(jī)制、菌種選育現(xiàn)狀以及發(fā)酵控制工藝進(jìn)行了綜述，并結(jié)合自身相關(guān)科研經(jīng)驗(yàn)對L-異亮氨酸未來的生產(chǎn)提出展望。

1 L-異亮氨酸的生物合成途徑

1.1 L-異亮氨酸的生物合成途徑及代謝調(diào)控

生產(chǎn)L-異亮氨酸的菌株主要是谷氨酸棒桿菌（Cor-ynebacterium glutamicum）和大腸桿菌（Escherichia coli）。谷氨酸棒桿菌具有無內(nèi)毒素、代謝同工酶少，有利于解除反饋抑制或轉(zhuǎn)錄衰減以及關(guān)鍵代謝酶抗反饋抑制能力強(qiáng)等特點(diǎn)，因此大多數(shù)研究者傾向于研究谷氨酸棒桿菌及其亞種，如黃色短桿菌（Brevibacterium flavum）和乳糖發(fā)酵短桿菌（Brevibacterium lactofermentum）[7]等。谷氨酸棒桿菌中關(guān)于L-異亮氨酸在的生物合成路徑及其代謝調(diào)控機(jī)制（見圖1）。谷氨酸棒桿菌以葡萄糖作為原料，在一系列酶催化反應(yīng)之后，通過糖酵解途徑（embden-meyerhof pathway，EMP）、磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，HMP）和三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）等途徑生成草酰乙酸。草酰乙酸在谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamate oxaloacetate aminotransferase，GOT）的作用下接受來自谷氨酸的氨基生成L-天冬氨酸，L-天冬氨酸再經(jīng)過10步酶催化反應(yīng)生成L-異亮氨酸。

圖1 谷氨酸棒桿菌中L-異亮氨酸的生物合成途徑及代謝調(diào)控機(jī)制Fig.1 Biosynthetic pathway and metabolic regulation mechanism of L-isoleucine in Corynebacterium glutamicum

1.2 L-異亮氨酸的生物合成途徑中的關(guān)鍵酶

在L-異亮氨酸的生物合成路徑中，關(guān)鍵酶的活性會影響主代謝流的碳通量的大小，進(jìn)而影響最終產(chǎn)物的合成，因此解除或減弱關(guān)鍵酶的反饋調(diào)節(jié)或強(qiáng)化其酶活活性能增大碳通量，L-異亮氨酸的積累也將增加。在谷氨酸棒桿菌中，影響L-異亮氨酸合成路徑中主代謝流碳通量大小的關(guān)鍵酶有天冬氨酸激酶（aspartate kinase，AK）、高絲氨酸脫氫酶（homoserine dehydrogenase，HD）、高絲氨酸激酶（homoserine kinase，HK）、蘇氨酸脫氫酶（threonine dehydrogenase，TD）和乙酰羥酸合酶（acetohydroxy acid synthase，AHAS）等，其酶活活性受到反饋調(diào)節(jié)[8]。

1.2.1 天冬氨酸激酶

AK的編碼基因?yàn)長ysC，其組成是兩個(gè)α亞基和兩個(gè)β亞基組成的異四聚體，能將天冬氨酸催化為天冬氨酸磷酸，其酶活活性受到賴氨酸以及蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制。以臨界致死濃度的S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸作為篩選壓力來獲得具有目標(biāo)抗性能力的L-異亮氨酸高產(chǎn)菌株，能在基因水平上解除或減弱賴氨酸和蘇氨酸對AK的協(xié)同反饋抑制[6]。也可以通過選育賴氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，若賴氨酸無法生成，碳流將更多的流向前體物蘇氨酸，增加終產(chǎn)物L(fēng)-異亮氨酸的積累。

1.2.2 高絲氨酸脫氫酶

高絲氨酸脫氫酶（HD）由基因hom編碼，能利用還原型輔酶二作為還原力將天冬氨酸-β-半醛脫羧催化為L-高絲氨酸[7]，其酶活活性受蘇氨酸的反饋抑制以及蛋氨酸的反饋?zhàn)瓒?。用臨界致死濃度的α-氨基-β-羥基戊酸、蘇氨酸氧肟酸鹽等結(jié)構(gòu)類似物篩選優(yōu)勢抗性突變株能在基因水平上解除或減弱HD受到的反饋抑制[6]。也可以選育蛋氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，菌體內(nèi)蛋氨酸無法形成，則主代謝流的碳流會更加通暢，終產(chǎn)物L(fēng)-異亮氨酸的生物合成量也將增加。

1.2.3 高絲氨酸激酶

高絲氨酸激酶（HK）由基因thrB編碼，能將L-高絲氨酸催化成為高絲氨酰磷酸，其酶活活性受蘇氨酸的反饋抑制。經(jīng)酶學(xué)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，HK受到的反饋抑制屬于競爭性反饋抑制，其抑制程度隨著底物L(fēng)-高絲氨酸濃度的提高而降低。因此，解除該反饋抑制不能采用改變酶的蛋白結(jié)構(gòu)的方法，需提高其底物L(fēng)-高絲氨酸的濃度來緩解HK受到的反饋抑制[9]。

1.2.4 蘇氨酸脫水酶

蘇氨酸脫水酶（TD）由基因ilvA編碼，是由4個(gè)完全一樣的亞基組成的四聚體結(jié)構(gòu)，能將L-蘇氨酸催化為α-酮基丁酸，是L-異亮氨酸生物合成途經(jīng)中的第一個(gè)限速酶，其酶活活性受到L-異亮氨酸的反饋抑制。研究人員常用臨界致死濃度的α-氨基丁酸、L-異亮氨酸氧肟酸鹽、鄰甲基-L-蘇氨酸及D-蘇氨酸等結(jié)構(gòu)類似物作為篩選壓力獲得優(yōu)勢突變株，其獲得的抗性突變株能在基因水平上解除或減弱TD受到的反饋抑制[10]。

1.2.5 乙酰羥酸合酶

乙酰羥酸合酶（AHAS）由基因ilvBN編碼，是L-異亮氨酸生物合成途經(jīng)中的第二個(gè)限速酶，也是三個(gè)支鏈氨基酸合成過程中的第一個(gè)公共酶，其酶活活性主要受到來自L-纈氨酸的反饋抑制和三個(gè)支鏈氨基酸的反饋?zhàn)瓒?。AHAS是由大小兩個(gè)亞基組成的，大亞基由基因ilvB編碼，小亞基由基因ilvN編碼，分別具備催化和調(diào)節(jié)功能。AHAS能夠催化丙酮酸和來源于丙酮酸的活性乙醛生成α-乙酰乳酸，也能夠催化α-酮基丁酸和活性乙醛生成α-乙酰羥基丁酸；此外，突變小亞基上的三個(gè)連續(xù)氨基酸能解除三個(gè)支鏈氨基酸對AHAS的反饋抑制[11]，如HOU X H等[12]利用基因工程技術(shù)將AHAS小亞基上的3個(gè)連續(xù)的氨基酸Gly-Ile-Ile定點(diǎn)突變?yōu)锳sp-Asp-Phe，使得AHAS受到的反饋抑制被完全解除。此外，以臨界致死濃度的α-氨基丁酸、2-噻唑丙氨酸等結(jié)構(gòu)類似物作為篩選壓力獲取優(yōu)勢抗性突變株，也能在基因水平上解除或減弱AHAS受到的反饋調(diào)節(jié)。

2 L-異亮氨酸菌種選育現(xiàn)狀

2.1 傳統(tǒng)誘變育種

傳統(tǒng)誘變育種方法主要采用各種誘變劑對出發(fā)菌株進(jìn)行處理，以期望獲得目標(biāo)性狀的突變株，常用的誘變劑有硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）、紫外線（ultraviolet，UV）以及近幾年較流行的常溫常壓等離子體（atmospheric and temperature plasma，ARTP）等。傳統(tǒng)誘變育種技術(shù)能在短時(shí)間形成大量的突變體，對實(shí)驗(yàn)技術(shù)、裝備、環(huán)境沒有過高要求且選育的高產(chǎn)菌株遺傳性狀較為穩(wěn)定，在育種領(lǐng)域有著舉足輕重的地位。但傳統(tǒng)方法的效率較低、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，主要是因?yàn)闆]有高效的篩選方法能快速篩選出優(yōu)勢菌株。隨著研究者對微生物中氨基酸合成的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制有了全面清晰的認(rèn)識，開始利用氨基酸的結(jié)構(gòu)類似物添加到篩選培養(yǎng)基中，能定向篩選反饋調(diào)節(jié)得到解除或弱化的突變株，獲取目標(biāo)遺傳性能穩(wěn)定的高產(chǎn)L-異亮氨酸突變菌株。如SHIIO I等[13]以黃色短桿菌為出發(fā)菌株，利用亞硝基胍進(jìn)行逐級誘變，選育出具有抗α-氨基-β-羥基戊酸、鄰甲基-L-蘇氨酸等雙重抗性突變株，在發(fā)酵66 h之后，L-異亮氨酸的產(chǎn)量達(dá)到14.5 g/L。YOSHINAGA F等[14]同樣以黃色短桿菌為出發(fā)菌株，利用S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸、α-氨基-β-羥基戊酸、異硫氨酸等結(jié)構(gòu)類似物為篩選壓力，選育出具有多重抗性的優(yōu)勢突變株，通過補(bǔ)料流加醋酸銨與醋酸混合液來補(bǔ)充碳氮源，在發(fā)酵96 h后，使得L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到37.4 g/L。李進(jìn)等[15]利用DES和60Co對棲糖蜜棒桿菌進(jìn)行誘變處理，選育出具有抗磺胺胍、L-亮氨酸甲酯、α-氨基-β-羥基戊酸、乙硫氨酸等多重抗性以及能在琥珀酸為唯一碳源的篩選平板上快速生長的優(yōu)勢突變菌株，利用該優(yōu)勢突變株發(fā)酵72 h后，其產(chǎn)酸量達(dá)到15 g/L。謝飛等[16]利用低能氮離子束對谷氨酸棒桿菌進(jìn)行多次誘變，選育出異亮氨酸氧肟酸抗性突變株，在50 L發(fā)酵罐上發(fā)酵培養(yǎng)51 h，使得產(chǎn)酸量達(dá)到32 g/L。王壯壯等[17]利用DES和ARTP對L-異亮氨酸生產(chǎn)菌黃色短桿菌I-12進(jìn)行逐級誘變，選育出能抗2-噻唑丙氨酸、磺胺胍以及在琥珀酸為唯一碳源的篩選平板上能快速生長的優(yōu)勢突變菌株，在含有130 g/L葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h后，其產(chǎn)酸量達(dá)到26.2 g/L。

傳統(tǒng)誘變育種的方法簡單、選育的菌株性狀穩(wěn)定，難點(diǎn)在于如何高效的篩選出優(yōu)勢菌株。目前，研究者常采用微孔板實(shí)現(xiàn)高通量篩選，獲得優(yōu)勢菌株，如孔帥等[18]采用ARTP誘變處理谷氨酸棒桿菌，利用磺胺胍抗性標(biāo)記結(jié)合多孔板篩選的方式，能快速的篩選出優(yōu)勢菌株，在搖瓶中發(fā)酵48 h，產(chǎn)量達(dá)到18 g/L，較出發(fā)菌株提高了62.03%。隨著應(yīng)用微液滴培養(yǎng)微生物技術(shù)的發(fā)展，微液滴培養(yǎng)結(jié)合特殊的檢測技術(shù)如熒光檢測，進(jìn)行高通量培養(yǎng)及篩選，能在海量的突變菌株里面快速找到目標(biāo)菌株。如呂彤等[19]通過ARTP誘變處理，在液滴微流控技術(shù)的基礎(chǔ)上建立高通量篩選體系，將熒光蛋白融合入木聚糖酶便于熒光檢測，經(jīng)過篩選，在短時(shí)間內(nèi)獲得了木聚糖酶表達(dá)和分泌能力都得到提高的巴斯德畢赤酵母突變株，使得木聚糖酶活達(dá)到149.17 U/mg，較出發(fā)菌株提高了300%，分泌外源蛋白的能力相比出發(fā)菌株提高了160%。應(yīng)用液滴微流控技術(shù)結(jié)合特異性的檢測方法能夠做到高效、低成本篩選出目標(biāo)菌株。隨著王森等[20]成功的將近紅外光譜分析技術(shù)應(yīng)用于監(jiān)測L-異亮氨酸的發(fā)酵過程，在此后采用高通量篩選L-異亮氨酸高產(chǎn)突變株，利用微液滴培養(yǎng)結(jié)合近紅外檢測技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)高效篩選目標(biāo)菌株。

2.2 代謝工程育種

目前，L-異亮氨酸的工業(yè)生產(chǎn)菌株主要是由傳統(tǒng)誘變育種的方法所得，因其遺傳背景不夠清晰，產(chǎn)酸量和糖酸轉(zhuǎn)化率很難再進(jìn)一步得到提高。利用代謝工程技術(shù)構(gòu)建基因工程菌可以有效解決產(chǎn)酸量低和糖酸轉(zhuǎn)化率低的問題。代謝工程育種技術(shù)主要是利用基因工程技術(shù)有目的改造宿主細(xì)胞的基因組，以期望獲取目標(biāo)產(chǎn)物得到提高的菌株的技術(shù)[21]。目前利用代謝工程技術(shù)對L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株進(jìn)行改造主要通過高效表達(dá)L-異亮氨酸合成路徑中涉及到的關(guān)鍵酶的編碼基因來提高其產(chǎn)量以及優(yōu)化細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)來增強(qiáng)L-異亮氨酸向胞外的分泌能力。

高效表達(dá)L-異亮氨酸的合成路徑中涉及到的關(guān)鍵酶的控制基因，特別是高效表達(dá)抗反饋抑制的突變體基因，能有效地提高L-異亮氨酸的產(chǎn)量。如GUILLOUET S等[22]將帶有HD、HT與TD編碼基因的質(zhì)粒PAPE20轉(zhuǎn)化到蘇氨酸高產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum）ATCC21799中并進(jìn)行過表達(dá)，在4 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，使得L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到40 g/L。MORBACH S等[23]以賴氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum）MH20-22B為出發(fā)菌株，將AK和HD的編碼基因整合到谷氨酸棒桿菌MH20-22B的染色體上，并過表達(dá)TD基因，在搖瓶中產(chǎn)酸量達(dá)到6.6 g/L，進(jìn)一步通過發(fā)酵罐補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)使得產(chǎn)酸量達(dá)到18.1 g/L。YIN L H等[24]將具有抗反饋抑能力的TD和AHAS的編碼基因轉(zhuǎn)入L-異亮氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum）JHI3-156中并進(jìn)行過表達(dá)，在3 L發(fā)酵罐中發(fā)酵72 h，產(chǎn)酸量達(dá)30.7 g/L，較對照組提高了26%。MA W J等[25]為了提高還原型輔酶二的水平，將能強(qiáng)化HMP途徑代謝流的反應(yīng)酶6-磷酸葡萄糖酸轉(zhuǎn)移酶、磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶和果糖二磷酸酯酶的編碼基因在穿梭質(zhì)粒上進(jìn)行三酶過表達(dá)，將三酶共表達(dá)重組菌株在3 L發(fā)酵罐上發(fā)酵96 h后，L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到29 g/L，相比對照組提高了21%。

隨著L-異亮氨酸的濃度在胞內(nèi)不斷累積，其由胞內(nèi)向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)的能力不能平衡胞內(nèi)外L-異亮氨酸的濃度時(shí)，高濃度的胞內(nèi)L-異亮氨酸積累會抑制合成路徑中關(guān)鍵酶的酶活活性，影響L-異亮氨酸在胞外的累積，甚至?xí)种萍?xì)胞的生長。因此，優(yōu)化L-異亮氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有助于L-異亮氨酸產(chǎn)量的提升。XIE X等[26]將谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum）YILW的輸入蛋白基因BrnQ和輸出蛋白基因BrnFE進(jìn)行過量表達(dá)，來促進(jìn)L-異亮氨酸向胞外的分泌，使得L-異亮氨酸的產(chǎn)量達(dá)到29.0 g/L，相比出發(fā)菌株提高了11.9%。YIN L等[27]在谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum）JHI3-156中串聯(lián)表達(dá)了全局調(diào)控因子（Lrp）和雙組份分泌系統(tǒng)的編碼基因（BrnFE），在重組菌發(fā)酵72 h后，L-異亮氨酸的產(chǎn)量達(dá)到26.8 g/L，相比發(fā)菌株提高了62.4%。李忠財(cái)?shù)萚28]在谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum）LD320中過量表達(dá)突變型BrnFE1基因，重組菌在搖瓶中的產(chǎn)酸量為4.44 g/L，相比對照組提高21%。此外，為了進(jìn)一步增加細(xì)胞膜的通透性，對發(fā)酵過程中的添加的吐溫80的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，在7 L發(fā)酵罐中發(fā)酵65 h后，其產(chǎn)酸量達(dá)到25.45 g/L，較出發(fā)菌株提高了37%。

3 L-異亮氨酸的發(fā)酵過程控制

L-異亮氨酸產(chǎn)量的提升不單需要生產(chǎn)菌自身具備有強(qiáng)大的產(chǎn)酸能力，其發(fā)酵過程的控制也同樣重要。在分析了生產(chǎn)菌生理代謝特性的基礎(chǔ)上，對發(fā)酵過程進(jìn)行合理控制，有利于L-異亮氨酸產(chǎn)量的提高。在L-異亮氨酸發(fā)酵過程中，外源因素的影響主要有發(fā)酵培養(yǎng)基成分、代謝調(diào)節(jié)因子、溫度、pH值、溶氧、細(xì)胞膜通透性的控制以及發(fā)酵控制策略等。

3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基

生產(chǎn)菌的生長、繁殖以及L-異亮氨酸的生物合成所需的營養(yǎng)物質(zhì)均來自于發(fā)膠培養(yǎng)基。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及含量的配比能很大程度的影響到生產(chǎn)菌的生長以及產(chǎn)物的合成和積累。適宜的培養(yǎng)基成分和配比能使生產(chǎn)菌的生長發(fā)育和產(chǎn)物生物合成之間達(dá)到資源最佳利用分配，從而令資源更多的用于產(chǎn)物的合成，提高發(fā)酵的效率。

3.1.1 碳源、氮源

碳源主要為細(xì)胞提供自身的構(gòu)成組分以及合成L-異亮氨酸的碳架和能量。在L-異亮氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)中，一般以葡萄糖作為碳源。氮源的主要作用是為細(xì)胞體內(nèi)含氮化合物的合成提供氮元素（如合成氨基酸、蛋白質(zhì)以及核酸等）。氮源分為無機(jī)氮源和有機(jī)氮源。無機(jī)氮源的作用效果快，能被細(xì)胞迅速分解利用，一般用來滿足微生物在生長前期的氮源需求。有機(jī)氮源中含有豐富的氨基酸、維生素和生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)，被細(xì)胞水解后才會發(fā)揮作用，水解過程緩慢，細(xì)胞對蛋白的利用速度也比較慢，主要有玉米漿、蛋白胨以及各種有機(jī)粉餅等[29]。玉米漿相對其他有機(jī)氮源比較廉價(jià)且營養(yǎng)成分較為豐富，被廣泛應(yīng)用于氨基酸的發(fā)酵工業(yè)中[30]。

3.1.2 無機(jī)鹽

無機(jī)鹽對細(xì)胞的組成、胞內(nèi)各種酶的激活或抑制以及調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的理化性質(zhì)都有著重要意義（如磷酸鹽、鈣鹽等）。磷酸鹽控制著細(xì)菌體內(nèi)脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）和蛋白質(zhì)的合成以及糖代謝、細(xì)胞呼吸，還能以游離的磷酸基團(tuán)形式參與腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）與二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）之間相互轉(zhuǎn)化的反應(yīng)，進(jìn)而影響胞內(nèi)ATP的水平[31]；鈣離子通過增強(qiáng)丙酮酸羧化酶的活性來促進(jìn)丙酮酸羧化[32]，有利于草酰乙酸的生成，增加L-異亮氨酸合成路徑的碳通量。

3.1.3 維生素

生物素又稱維生素H、維生素B7和輔酶R，在谷氨酸棒狀桿菌體內(nèi)的多個(gè)生長代謝反應(yīng)中都起著重要作用，如丙酮酸的脫羧反應(yīng)，合成吡啶、核苷酸、核酸，形成嘌呤核嘧啶的堿基以及合成脂肪酸、蛋白質(zhì)等[33]。在L-異亮氨酸的生物合成中，生物素作為磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的輔基，通過促進(jìn)二氧化碳的固定能把碳流導(dǎo)向合成L-異亮氨酸的代謝途徑，使其主代謝流碳通量變大，從而增大L-異亮氨酸的合成量[34]。維生素B1又稱硫胺素，在菌體內(nèi)磷酸化成為焦磷酸硫胺素（thiamine pyrophosphate，TPP）參與到代謝中，TPP是丙酮酸脫氫酶系的輔助因子，能促進(jìn)丙酮酸脫氫生成乙酰輔酶A進(jìn)入TCA循環(huán)，有利于生成前體物草酰乙酸[35]。在培養(yǎng)基中添加合適濃度的硫胺素有利于L-異亮氨酸生產(chǎn)菌的生長以及產(chǎn)物的合成。通常有機(jī)氮源中含有大量的生物素和維生素B1，是培養(yǎng)基中生物素和維生素B1的重要來源，也可以單獨(dú)添加。

3.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

優(yōu)化最佳發(fā)酵培養(yǎng)基通常采用單因素法得到最佳碳氮源、無機(jī)鹽、維生素等，再利用正交試驗(yàn)法或響應(yīng)面法對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方。陳寧等[36]考察了不同的碳源、氮源對L-異亮氨酸產(chǎn)量的影響，得到最佳碳源為葡萄糖、最佳氮源為硫酸銨，并利用響應(yīng)面法分析得到發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方，使得L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到23.36 g/L，相比優(yōu)化前產(chǎn)量提高了22.52%。王壯壯等[17]以黃色短桿菌（B.flavum）TA-6為L-異亮氨酸生產(chǎn)菌，利用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，得到最佳顯著因素為葡萄糖、硫酸銨和磷酸二氫鉀，并分析回歸模型得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方，經(jīng)驗(yàn)證，L-異亮氨酸的產(chǎn)量達(dá)到27.8 g/L，相比優(yōu)化前產(chǎn)量提高了6.1%。

3.2 代謝調(diào)節(jié)因子

在L-異亮氨酸的發(fā)酵過程中，許多研究者通過在培養(yǎng)基中添加代謝調(diào)節(jié)因子來促進(jìn)L-異亮氨酸的積累，如檸檬酸鈉、膽堿或氯化膽堿、甜菜堿等。研究發(fā)現(xiàn)，在菌體發(fā)酵過程中添加適宜濃度的檸檬酸鈉能有效降低EMP途徑中關(guān)鍵酶磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的酶活活性，令參與EMP過程中相關(guān)酶的活性降低，同時(shí)也能增加HMP途徑的關(guān)鍵酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性[37]。如馬雷等[38]以黃色短桿菌為L-異亮氨酸生產(chǎn)菌，在培養(yǎng)基中添加2 g/L的檸檬酸鈉，使得的產(chǎn)酸量達(dá)到25.63 g/L，比對照組提高了7.87%。通過分析檸檬酸鈉添加前后的代謝流量，發(fā)現(xiàn)在L-異亮氨酸發(fā)酵過程中添加適宜濃度的檸檬酸鈉能降低EMP途徑通量，增加HMP途徑通量，生成更多的還原型輔酶二，使得L-異亮氨酸的產(chǎn)量得到提高。膽堿是一種有機(jī)堿，屬B族維生素，能促進(jìn)甲基合成、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透壓以及調(diào)節(jié)菌體脂肪代謝和蛋白質(zhì)合成。在L-異亮氨酸的發(fā)酵過程中，能有效促進(jìn)L-異亮氨酸甲基的合成、提高菌體內(nèi)酶活活力、促進(jìn)菌體的生長發(fā)育，從而提升L-異亮氨酸的產(chǎn)量。陳寧等[39]以黃色短桿菌為L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株，通過添加1 g/L的膽堿于發(fā)酵培養(yǎng)基中，使得L-異亮氨酸的產(chǎn)量達(dá)到了40.5 g/L，與未添加膽堿相比產(chǎn)酸量提高了22%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高至18.4%。甜菜堿含有3個(gè)活性甲基，能高效的提供甲基給微生物利用，對促進(jìn)氨基酸發(fā)酵中氨基酸的過量積累有明顯的效果。潘崇德[40]以乳糖發(fā)酵短桿菌為生產(chǎn)菌株，在菌體生長延滯期添加10 g/L的甜菜堿，使得L-異亮氨酸的產(chǎn)量達(dá)到24.79 g/L，相比對照組提高了11.2%。綜上，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適宜濃度的代謝調(diào)節(jié)因子能有效的提高L-異亮氨酸的產(chǎn)量。

3.3 溫度

菌體的生長和代謝產(chǎn)物的合成是在酶的催化作用下進(jìn)行的，溫度不僅是酶活力的最大影響因素，還能改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)以及細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用速度，進(jìn)而影響細(xì)胞的生長繁殖和目標(biāo)產(chǎn)物的合成，因此，在L-異亮氨酸的發(fā)酵過程中控制好溫度的變化非常重要。許正宏等[41]認(rèn)為，在L-異亮氨酸發(fā)酵過程中采用變溫控制的方法有利于終產(chǎn)物的積累，在發(fā)酵前期溫度控制在31 ℃，此時(shí)的溫度適合菌體的生長，使菌體能夠快速進(jìn)入產(chǎn)酸期，縮短菌體生長的時(shí)間。在發(fā)酵后期控制其溫度在28 ℃，此時(shí)菌體內(nèi)關(guān)于L-異亮氨酸合成的酶系活性較強(qiáng)，有利于L-異亮氨酸的生物合成。常高峰[42]以黃色短桿菌為L-異亮氨酸生產(chǎn)菌，采用變溫控制的模式，在發(fā)酵前56 h將溫度控制在31 ℃，后32 h溫度控制在28 ℃，在該模式下最終產(chǎn)酸量達(dá)到21.36 g/L，相比采用28 ℃恒溫發(fā)酵其產(chǎn)酸量提高了16.95%，較31 ℃恒溫發(fā)酵其產(chǎn)酸量提高了5.8%。

3.4 pH

pH能直接影響L-異亮氨酸合成路徑中相關(guān)酶的活性。當(dāng)pH處于合適范圍內(nèi)，細(xì)胞中相關(guān)酶的活性會增強(qiáng)，菌體的生長將會更加旺盛，代謝產(chǎn)物的合成也會增加；pH還能通過影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)和中間代謝產(chǎn)物的離解形式來影響細(xì)胞的正常代謝過程，進(jìn)而左右代謝終產(chǎn)物的生成[43]。在L-異亮氨酸發(fā)酵過程中，常采用流加氨水或尿素來控制pH，同時(shí)還能補(bǔ)充無機(jī)氮源。流加用的氨水濃度一般采用14%、25%、28%，利用氨水調(diào)節(jié)pH值的作用效果迅速，不容易把握，而通過流加尿素的方法因其每次的流加量比較少，其維持pH值的效果比較穩(wěn)定。有研究認(rèn)為菌體生長的不同階段維持不同的pH有利于L-異亮氨酸的積累，如常高峰[42]以黃色短桿菌為L-異亮氨酸生產(chǎn)菌，采用分階段控制pH的方式，在0～48 h將pH控制在6.9～7.1，到48 h后將pH維持在7.15，發(fā)酵80 h后維持pH為7.25，使得L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到21.73 g/L，較對照組提高了6.5%。

3.5 溶氧

L-異亮氨酸屬于天冬氨酸族氨基酸，在發(fā)酵過程中對氧氣的需求處于谷氨酸（一類發(fā)酵，氧氣需求量大）和亮氨酸（三類發(fā)酵，氧氣需求量?。┲g[44]，究其原因，發(fā)現(xiàn)合成L-異亮氨酸的一部分碳架來源于丙酮酸，丙酮酸到L-異亮氨酸的合成要經(jīng)過三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）和生成羥乙基焦磷酸硫胺素（thiamine pyrophosphate，He-TPP）兩個(gè)途徑，TCA對氧氣的需求較高，He-TPP途徑對氧氣的需求較低，因此，在發(fā)酵過程中控制好氧氣的供給是提高L-異亮氨酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度的關(guān)鍵。張俊麗等[45]以乳糖發(fā)酵短桿菌為L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株，在基于溶氧反饋控制模式下，將溶氧維持20%、30%、35%和40%，考察不同溶氧對L-異亮氨酸產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)在溶氧氣濃度維持20%時(shí)產(chǎn)酸量最高、生產(chǎn)強(qiáng)度最大。PENG Z J等[46]以乳糖發(fā)酵短桿菌為生產(chǎn)菌株，通過改變攪拌轉(zhuǎn)速控制的兩階段控氧模式，即0～10 h攪拌轉(zhuǎn)速為700 r/min，10～56 h攪拌轉(zhuǎn)速為600 r/min，使得產(chǎn)酸量達(dá)到23.3 g/L，較之前攪拌轉(zhuǎn)速優(yōu)化結(jié)果最好的600 r/min的產(chǎn)量提高了11.6%。

3.6 細(xì)胞膜通透性的控制

在L-異亮氨酸的發(fā)酵過程中，產(chǎn)物從胞內(nèi)分泌到胞外的過程是積累L-異亮氨酸的關(guān)鍵。L-異亮氨酸若能及時(shí)的從胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，就能令胞內(nèi)的L-異亮氨酸不能達(dá)到形成反饋調(diào)節(jié)的濃度，胞內(nèi)的L-異亮氨酸就能不斷優(yōu)先合成，不斷的分泌到細(xì)胞外，從而過量的積累L-異亮氨酸。L-異亮氨酸由胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞外不僅可以通過強(qiáng)化轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的能力來實(shí)現(xiàn)，也可以通過控制細(xì)胞膜的通透性來增強(qiáng)其由胞內(nèi)分泌到胞外的能力。細(xì)胞膜的通透性與磷脂和細(xì)胞壁的合成量有關(guān)，要想改變細(xì)胞膜通透性需從這兩個(gè)方面入手。

控制磷脂的合成常采用在培養(yǎng)基中添加適宜濃度的生物素以及在發(fā)酵過程中添加表面活性劑的方法。生物素是脂肪酸生物合成中關(guān)鍵酶乙酰輔酶A羧化酶的輔酶，通過影響脂肪酸的合成間接影響磷脂的合成。如熊海波等[47]以谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum）YILM 1504為L-異亮氨酸生產(chǎn)菌，通過限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素的濃度，從對數(shù)后期開始繁殖的菌體細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，使得L-異亮氨酸的產(chǎn)量達(dá)到42.5 g/L，相比利用高濃度的生物素發(fā)酵，其產(chǎn)酸量提高了93.18%。表面活性劑是生物素的拮抗物，在不飽和脂肪酸的合成中起到抑制作用，進(jìn)而影響磷脂的合成。如龍輝[48]以谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum）YILM為L-異亮氨酸生產(chǎn)菌，在菌體培養(yǎng)至18 h，即對數(shù)末期，添加0.2%的表面活性劑吐溫80，使得L-異亮氨酸產(chǎn)酸量達(dá)到26.43 g/L，相比對照組提高了10.63%。減少細(xì)胞壁的合成是通過在發(fā)酵的對數(shù)生長期早期，將青霉素等抗生素添加其中，使其抑制糖肽轉(zhuǎn)肽酶的活性來影響細(xì)胞壁糖肽的生成，進(jìn)而影響細(xì)胞膜的通透性。如陳行通[49]在L-谷氨酸的發(fā)酵過程中，在每毫升的發(fā)酵液中添加6個(gè)單位的青霉素，使得其平均產(chǎn)酸量達(dá)到64 g/L，相比未添加青霉素，其產(chǎn)酸量提高了18%。雖然添加抗生素法還未在L-異亮氨酸的生產(chǎn)中進(jìn)行實(shí)踐，但其可行性很高，可以嘗試。

3.7 發(fā)酵策略

L-異亮氨酸的產(chǎn)量與菌體量是具有相關(guān)性的，要想過量的積累L-異亮氨酸，需兼具發(fā)酵前期生產(chǎn)菌株的生長和產(chǎn)酸期的發(fā)酵調(diào)控。就L-異亮氨酸的生產(chǎn)而言，菌體的生長和L-異亮氨酸的生成對營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣、溫度以及pH等外源因素的需求是不同的，因此，要基于生產(chǎn)菌自身的特性來制定合適的發(fā)酵策略，才能L-異亮氨酸得到高產(chǎn)。研究人員通常采用雙階段控氧[46]、控溫[42]和控制pH[42]的模式使得菌體能處于最適生長和產(chǎn)酸條件，達(dá)到提高產(chǎn)酸量的目的；或在菌體到達(dá)產(chǎn)酸期時(shí)流加葡萄糖的方式，延長發(fā)酵周期來提高產(chǎn)酸量。因此，良好的發(fā)酵控制策略能有效的提高L-異亮氨酸的產(chǎn)量。如張成林等[50]以谷氨酸棒桿菌為生產(chǎn)菌，采用在產(chǎn)酸期指數(shù)流加玉米漿、磷酸鹽結(jié)合雙階段控制溶氧的發(fā)酵策略生產(chǎn)L-異亮氨酸，使得產(chǎn)酸量達(dá)到了31.32 g/L，較對照組提高了20.97%。

4 展望

優(yōu)良菌種的選育依然是高產(chǎn)L-異亮氨酸的關(guān)鍵，隨著高通量篩選技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合傳統(tǒng)誘變技術(shù)，有助于我們找到未知性狀的高產(chǎn)L-異亮氨酸突變株，建立新的代謝網(wǎng)絡(luò)。利用基因工程技術(shù)反向分析造成未知性狀突變株高產(chǎn)L-異亮氨酸的原因，進(jìn)而通過理性設(shè)計(jì)，在分子水平改造遺傳物質(zhì)，有助于得到糖酸轉(zhuǎn)化率進(jìn)一步提高的優(yōu)勢菌種。在發(fā)酵過程中，良好的監(jiān)測設(shè)備和傳感器有助于對發(fā)酵過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，檢測產(chǎn)物、副產(chǎn)物的生成情況，以便及時(shí)調(diào)整發(fā)酵控制過程，增加終產(chǎn)物L(fēng)-異亮氨酸的產(chǎn)量，減少有機(jī)酸、其他氨基酸的生成。目前，高通量的培養(yǎng)及篩選技術(shù)還不成熟，使得未知性狀的高產(chǎn)L-異亮氨酸突變株的尋找成為難點(diǎn)，隨著新型篩選設(shè)備、發(fā)酵設(shè)備的研發(fā)，將有助打破瓶頸，使L-異亮氨酸的生產(chǎn)邁上一步臺階。