全胚冷凍周期胚胎復(fù)蘇后空泡對(duì)妊娠結(jié)局的影響

朱家紅，武麗紅，熊順，高洋，黃國寧

(人類胚胎工程重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市遺傳與生殖研究所，重慶市婦幼保健院，重慶 400013)

凍融胚胎移植(FET)是輔助生殖技術(shù)(ART)中冷凍保存胚胎、解凍復(fù)蘇后再移植回子宮的一種技術(shù)。FET周期相對(duì)于控制性卵巢刺激(COS)鮮胚移植周期，子宮內(nèi)膜發(fā)育和內(nèi)膜準(zhǔn)備控制得更精細(xì)，可形成更好的內(nèi)膜容受性[1]，改善種植結(jié)局。目前大部分患者由于囊胚培養(yǎng)的不確定性，仍選擇全部卵裂期胚胎冷凍或凍存部分卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎，剩余胚胎則繼續(xù)進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。隨著全胚冷凍周期率越來越高，F(xiàn)ET后的妊娠結(jié)局也備受關(guān)注。胞質(zhì)空泡形成是胚胎體外培養(yǎng)過程中胞質(zhì)異常的常見現(xiàn)象，可見于植入前胚胎發(fā)育的各個(gè)階段以及冷凍解凍后的胚胎。本單位之前文獻(xiàn)報(bào)道COS周期鮮胚移植中有空泡現(xiàn)象的胚胎表現(xiàn)出與種植率和妊娠結(jié)局無顯著相關(guān)性的特點(diǎn)[2]，我們將空泡作為其中一個(gè)因素參與胚胎評(píng)分，COS周期中僅空泡較少的胚胎且空泡直徑<14 μm的胚胎用于移植或冷凍；研究發(fā)現(xiàn)冷凍有小空泡的胚胎解凍后通?？张蒹w積會(huì)變大、數(shù)量會(huì)增多，隔夜培養(yǎng)后本無空泡的胚胎也可能產(chǎn)生較多空泡甚至整個(gè)胚胎空泡化。因此，本研究對(duì)這類胚胎移植后的臨床結(jié)局進(jìn)行分析，將有助于判斷解凍復(fù)蘇胚胎的種植潛能以及是否需要再次解凍剩余胚胎移植。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2017年1月至2019年12月于重慶市遺傳與生殖研究所就診的行FET周期患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：首次助孕且均為COS全胚冷凍周期；第1次行FET；子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm；胚胎時(shí)期為第3天(D3)胚胎。排除標(biāo)準(zhǔn)：微刺激方案；解凍后有胚胎卵裂球壞死、發(fā)育停滯的周期；合并存在影響胚胎種植的因素，如子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥和宮腔積液。根據(jù)納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，由于FET移植2枚胚胎均有空泡的周期以及單胚胎移植且有空泡的周期樣本量太小不納入本次分析，因此本研究僅包括移植2枚D3胚胎且其中1枚有空泡的周期。

共納入3 528個(gè)周期，其中胚胎冷凍復(fù)蘇當(dāng)時(shí)和隔夜培養(yǎng)后均無空泡形成的周期2 615個(gè)，為無空泡組；解凍復(fù)蘇時(shí)即存在空泡的312個(gè)周期，為解凍時(shí)空泡組；復(fù)蘇時(shí)無空泡，隔夜培養(yǎng)后出現(xiàn)空泡的601個(gè)周期，為培養(yǎng)后空泡組。根據(jù)移植時(shí)空泡卵裂球胚胎占卵裂球胚胎總數(shù)的比例分為兩組，<30%組679個(gè)周期，≥30%組234個(gè)周期。

二、研究方法

根據(jù)患者情況選擇適合的控制性促排卵方案、授精方式，常規(guī)進(jìn)行胚胎培養(yǎng)。根據(jù)臨床評(píng)估對(duì)于不適合鮮胚移植的患者行可利用胚胎全胚冷凍。冷凍胚胎選擇標(biāo)準(zhǔn)：受精后第3天胚胎細(xì)胞數(shù)≥6，碎片<35%，卵裂球大小基本均勻。

1.胚胎冷凍和復(fù)蘇：胚胎冷凍解凍均使用Kitazato試劑盒(加藤公司，日本)，按照說明書進(jìn)行嚴(yán)格操作。冷凍操作時(shí)將胚胎放置于平衡液(equilibrium solution，ES)表面，室溫下放置9～15 min，當(dāng)胚胎恢復(fù)至最大程度時(shí)移入玻璃化冷凍液(vitrification solution，VS)中，反復(fù)吸放，1 min內(nèi)將胚胎以最小液滴裝載于冷凍載體上，液氮保存。胚胎解凍復(fù)蘇時(shí)將冷凍載體取出，將胚胎置于試劑盒1液中1 min，2液中3 min，3液和4液中各5 min，待胚胎形態(tài)恢復(fù)后于囊胚培養(yǎng)液vitrolife G1中隔夜培養(yǎng)至第2天移植。

2.人工周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案：患者于月經(jīng)周期的第 2～5天開始口服補(bǔ)佳樂(廣州拜耳醫(yī)藥)準(zhǔn)備內(nèi)膜，連續(xù)用藥14 d后B超監(jiān)測子宮內(nèi)膜厚度，內(nèi)膜厚度達(dá)標(biāo)后(≥7 mm)予黃體酮轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，3 d后移植卵裂期胚胎。

3. 觀察指標(biāo)：冷凍前優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/解凍胚胎數(shù)×100%；種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

4. 妊娠判斷：移植后14 d行血清HCG檢測，移植后24 d超聲檢查見孕囊、胚芽，移植后35 d超聲檢查心管搏動(dòng)者確定為臨床妊娠。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、空泡發(fā)生時(shí)間對(duì)臨床結(jié)局的影響

解凍時(shí)空泡組312個(gè)周期，培養(yǎng)后空泡組601個(gè)周期，無空泡組2 615個(gè)周期，3組之間年齡、體重指數(shù)(BMI)、不育原因、基礎(chǔ)性激素水平、子宮內(nèi)膜厚度及冷凍前優(yōu)質(zhì)胚胎率比較均無顯著性差異(P>0.05)。但解凍時(shí)空泡組種植率顯著低于無空泡組和培養(yǎng)后空泡組(P<0.05)；解凍時(shí)空泡組FET日空泡卵裂球胚胎比例顯著高于培養(yǎng)后空泡組(P<0.05)；3組之間臨床妊娠率和流產(chǎn)率比較均無顯著性差異(P>0.05)。培養(yǎng)后空泡組與無空泡組相比各指標(biāo)比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 空泡發(fā)生時(shí)間對(duì)妊娠結(jié)局的影響[(-±s)，%]

二、FET時(shí)空泡卵裂球胚胎比例對(duì)妊娠結(jié)局的影響

<30%組679個(gè)周期，≥30%組234個(gè)周期，無空泡組2 615個(gè)周期。3組之間年齡、不育因素、基礎(chǔ)性激素水平、子宮內(nèi)膜厚度、冷凍前優(yōu)質(zhì)胚胎率及流產(chǎn)率比較均無顯著性差異(P>0.05)?！?0%組分別與其他兩組比較，種植率和臨床妊娠率均顯著降低(P<0.05)；<30%組與無空泡組比較各指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 FET時(shí)空泡卵裂球胚胎比例對(duì)妊娠結(jié)局的影響[(-±s)，%]

討 論

一、空泡形成的原因和機(jī)制

空泡形成是胚胎體外培養(yǎng)過程中胞質(zhì)異常的常見現(xiàn)象，但空泡形成的原因和機(jī)制目前尚無定論。主要原因有：胞質(zhì)發(fā)育不成熟[3]，患者自身年齡、基因表達(dá)異常以及體外培養(yǎng)環(huán)境影響[4]。有學(xué)者推測空泡是由卵泡膜不穩(wěn)定或閉鎖造成的異常內(nèi)吞作用所致，其內(nèi)充滿與卵周隙內(nèi)成分相同的液體[5]。

二、空泡發(fā)生時(shí)機(jī)對(duì)胚胎發(fā)育及臨床結(jié)局的影響

空泡對(duì)胚胎發(fā)育的影響存在爭議，且將空泡作為獨(dú)立因素分析其對(duì)胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局影響的研究更少。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞內(nèi)空泡可能會(huì)影響細(xì)胞骨架功能的發(fā)揮，從而顯著影響受精[6-7]和正常的細(xì)胞卵裂過程，甚至導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯[6，8]。有研究表明卵母細(xì)胞和卵裂期胚胎的胞質(zhì)空泡顯著影響囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚率[6，9-10]；認(rèn)為胞質(zhì)空泡可作為臨床預(yù)后不良的指標(biāo)[11]。但也有研究認(rèn)為卵母細(xì)胞和卵裂期自發(fā)空泡的形成并不降低早期胚胎的質(zhì)量及發(fā)育潛能[12]。即使卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有大量的空泡仍具有正常受精和發(fā)育為健康胎兒的能力[13]。

研究顯示胚胎致密化階段是空泡形成的高峰期，優(yōu)質(zhì)胚胎在受精后第4天出現(xiàn)空泡的陽性率為42.6%[14]，因此空泡形成可能是胚胎致密化后促進(jìn)融合形成囊胚的另一種方式[6，15]。且研究發(fā)現(xiàn)第5天大部分的空泡存在于滋養(yǎng)層細(xì)胞中，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中存在的空泡似乎存在自我修復(fù)機(jī)制[6，16]。有空泡的卵裂球可能不會(huì)參與胚胎致密化過程或少量的卵裂球參與并不會(huì)影響整個(gè)胚胎繼續(xù)發(fā)育的能力，但如果空泡化的卵裂球位于緊密連接細(xì)胞之間時(shí)可能會(huì)影響其它正常細(xì)胞之間的連接[14]。2016年Nottola等[17]通過透射電子顯微鏡研究發(fā)現(xiàn)所有冷凍的卵母細(xì)胞復(fù)蘇過程中均出現(xiàn)胞質(zhì)空泡形成的現(xiàn)象，且在解凍復(fù)溫中期空泡直徑達(dá)到最大，而新鮮的正常成熟卵母細(xì)胞則不會(huì)出現(xiàn)類似情況，由此推測凍融過程中發(fā)生胞質(zhì)空泡化可以認(rèn)為是結(jié)構(gòu)損傷的表現(xiàn)形式以及卵母細(xì)胞對(duì)冷凍損傷的應(yīng)激反應(yīng)。本研究對(duì)空泡出現(xiàn)的時(shí)機(jī)進(jìn)行分析，結(jié)果表明解凍時(shí)空泡組FET日空泡卵裂球胚胎比例顯著高于培養(yǎng)后空泡組，且FET后對(duì)胚胎種植的影響較大，提示胚胎冷凍復(fù)蘇過程中由于冰晶的形成導(dǎo)致細(xì)胞器損傷，空泡的形成可能是損傷的細(xì)胞器的聚集。研究結(jié)果還顯示培養(yǎng)后空泡組的種植率、臨床妊娠率及流產(chǎn)率與無空泡組比較無顯著性差異，提示隔夜培養(yǎng)后空泡出現(xiàn)未明顯影響胚胎種植潛能，說明此階段產(chǎn)生的少量空泡可能是胚胎融合的一種方式，或者已形成的空泡在囊胚形成的過程中被吸收或者被排出胚胎外。

三、空泡多少對(duì)胚胎發(fā)育及臨床結(jié)局的影響

大部分胞質(zhì)空泡的研究未區(qū)分空泡的大小和數(shù)量以及是否合并其它的胞質(zhì)異常，僅少量文獻(xiàn)對(duì)空泡的大小和數(shù)量有報(bào)道。Ebner等[6]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)空泡直徑≥14 μm會(huì)顯著影響卵母細(xì)胞的受精能力。Zhang等[14]通過時(shí)差顯微鏡觀察空泡胚胎的發(fā)育潛能，發(fā)現(xiàn)胚胎中含空泡的卵裂球越多胚胎的發(fā)育能力越差。本研究通過計(jì)算有空泡卵裂球占胚胎卵裂球總數(shù)的比例探討空泡卵裂球的多少對(duì)胚胎種植的影響，結(jié)果表明FET日空泡卵裂球胚胎比例≥30%時(shí)移植后種植率顯著下降，但流產(chǎn)率尚無顯著性差異。

目前全胚冷凍患者在無特殊情況下均選擇移植兩枚卵裂期胚胎以提高妊娠率，胚胎冷凍解凍過程對(duì)胚胎的損傷無法避免，解凍時(shí)胚胎中存在的空泡經(jīng)隔夜培養(yǎng)后空泡卵裂球胚胎比例會(huì)顯著增多，且當(dāng)空泡卵裂球胚胎比例≥30%時(shí)會(huì)顯著影響胚胎的種植潛能，因此移植前可以參考空泡卵裂球胚胎比例和出現(xiàn)時(shí)機(jī)考慮是否需要解凍剩余胚胎移植。