溫度誘導(dǎo)鱖三倍體的比較研究

魏 晉，宋 文，王守榮，陳元元，曾可為

(1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，武漢 430065；2.江漢大學(xué)，武漢 430056)

鱖(Sinipercachuatsi)隸屬于鱸形目(Perciformes)鱸亞目(Percoidei)真鱸科(Percichthyidae)鱖屬(Siniperca)，在中國(guó)、俄羅斯、日本、韓國(guó)、朝鮮以及越南等國(guó)均有分布，在我國(guó)的中東部平原區(qū)分布最為廣泛。鱖與其他魚類相似，在性腺發(fā)育階段及產(chǎn)卵季節(jié)會(huì)消耗更多的能量，存在生長(zhǎng)減緩、抗逆能力下降及肉質(zhì)變差等現(xiàn)象。采用現(xiàn)代生物學(xué)手段，開(kāi)發(fā)鱖的三倍體誘導(dǎo)技術(shù)，可以有效提升鱖的生長(zhǎng)速度和抗逆能力，降低其餌料系數(shù)，對(duì)縮短鱖的養(yǎng)殖周期，提升產(chǎn)量和肉質(zhì)，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，具有重要意義和實(shí)際價(jià)值[1]。

人工誘導(dǎo)三倍體魚形成已先后在40多種海水和淡水魚類中成功，其中三倍體興國(guó)紅鯉、湘云鯽、湘云鯉、異育銀鯽和三倍體虹鱒等品種已進(jìn)入規(guī)?；a(chǎn)階段，帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益[2,3]。本研究參考了泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[4]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[5,6]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[7]、烏鱧(Channaargus)[8]、細(xì)鱗鮭(Brachymystaxlenok)[9]及鱖(S.chuatsi)[10]等淡水魚類的三倍體誘導(dǎo)方法，采用冷休克和熱休克法進(jìn)行了鱖三倍體的誘導(dǎo)研究，篩選到了最佳的誘導(dǎo)條件，對(duì)冷、熱休克法誘導(dǎo)的效果進(jìn)行了綜合比較，并對(duì)三倍體和二倍體鱖魚苗的生長(zhǎng)性狀及存活率進(jìn)行了研究，以期為進(jìn)一步開(kāi)展鱖三倍體苗種的規(guī)?；a(chǎn)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 親本來(lái)源及受精卵的獲取

本試驗(yàn)所采用的鱖親本采集自武漢市佳恒水產(chǎn)有限公司養(yǎng)殖基地。在鱖的繁殖季節(jié)，挑選表型正常、無(wú)傷病、身體健壯并且已達(dá)性成熟的2齡雌魚和雄魚各30尾進(jìn)行人工繁殖，雌魚體重750～950 g，雄魚體重650～800 g。

采用人工催產(chǎn)的方法獲得鱖受精卵，產(chǎn)前培育、藥物催產(chǎn)及孵化管理等具體步驟參照李志成等[11]和劉希良等[12]的方法。

1.2 溫度休克處理最佳誘導(dǎo)條件的篩選

本研究中，在魚苗發(fā)育不同階段，統(tǒng)計(jì)各處理組和對(duì)照組的受精率、存活率、畸形率和三倍化率。受精率(FR)：胚胎發(fā)育原腸胚期，存活胚胎數(shù)目占總卵數(shù)目的比例。存活率：孵化后5 d，存活個(gè)體數(shù)目占受精卵數(shù)目的比例；相對(duì)存活率(SR)=處理組存活率/對(duì)照組存活率×100%?；温剩悍趸? d，畸形個(gè)體數(shù)目占存活個(gè)體數(shù)目的比例；相對(duì)畸形率(MR)=處理組畸形率/對(duì)照組畸形率×100%。三倍化率(TR)：孵化后8 d從各處理組隨機(jī)挑選50尾魚苗檢測(cè)其倍性，其中三倍體魚苗所占比例。數(shù)據(jù)處理軟件為SPSS 13.0和Microsoft Office Excel 2003。

1.2.1 冷休克處理最佳誘導(dǎo)條件的篩選

冷休克試驗(yàn)過(guò)程參照宋立民等[5]的方法，采用單因子試驗(yàn)獲得最適的冷休克誘導(dǎo)條件。三個(gè)單因素分別為：處理起始時(shí)間(BT)、處理溫度(Temp)和處理持續(xù)時(shí)間(DT)。試驗(yàn)設(shè)置如表1，各組經(jīng)冷休克處理后，受精卵轉(zhuǎn)移至26 ℃水體中繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)置對(duì)照組：受精卵始終置于26 ℃水溫條件下培養(yǎng)。每個(gè)處理組和對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)的受精卵數(shù)量約2 000粒。

表1 冷休克單因素處理試驗(yàn)設(shè)置

1.2.2 熱休克處理最佳誘導(dǎo)條件的篩選

魚類三倍體的熱休克誘導(dǎo)試驗(yàn)一般于亞致死溫度附近實(shí)施，參考Xu等[10]的研究結(jié)果進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)水溫高于40 ℃后，魚苗存活率為0%，因此，本研究將熱休克處理溫度范圍設(shè)置為32～38 ℃。其他單因素試驗(yàn)條件設(shè)置如表2，各組經(jīng)熱休克處理后，受精卵轉(zhuǎn)移至26 ℃水體中繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)置對(duì)照組：受精卵始終置于26 ℃水溫條件下培養(yǎng)。每個(gè)處理組和對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)的受精卵數(shù)量約為2 000粒。

表2 熱休克單因素處理試驗(yàn)設(shè)置

1.3 倍性檢測(cè)

孵化后8 d的鱖魚苗體型較小，無(wú)法進(jìn)行尾柄采血，因此從每組中隨機(jī)挑選50尾魚苗，制備單細(xì)胞懸液進(jìn)行倍性檢測(cè)。將每尾待檢鱖魚苗放入2 mL EP管中，蒸餾水清洗2次后，加入0.4 mL PBS(pH 7.4)溶液，利用組織破碎儀將魚苗碾碎，經(jīng)300目篩絹過(guò)濾后加入PBS(pH 7.4)溶液制備成細(xì)胞濃度約為103個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液。1月齡以后的幼魚，通過(guò)尾部靜脈取血，利用PBS(pH 7.4)溶液制備成濃度約為103個(gè)/mL的血細(xì)胞懸液進(jìn)行倍性檢測(cè)。

制備好的細(xì)胞懸液采用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色 1 min，用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter,CytoFlex,USA)進(jìn)行 DNA 含量分析。采用正常二倍體鱖魚苗作為對(duì)照。本研究中二倍體鱖細(xì)胞DNA相對(duì)含量為(204.2±4.3)，三倍體鱖細(xì)胞的DNA相對(duì)含量為(301.1±6.1)，約為二倍體的1.47倍(圖1)，可判斷誘導(dǎo)出的鱖魚苗為三倍體。

圖1 二倍體(a)和三倍體鱖(b)細(xì)胞 DNA 相對(duì)含量直方圖

1.4 冷、熱休克誘導(dǎo)效果比較及鱖三倍體魚苗生長(zhǎng)性能檢測(cè)

為排除親本遺傳差異對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，在確定冷、熱休克法的最優(yōu)誘導(dǎo)條件后，利用3對(duì)鱖親本分別構(gòu)建3個(gè)全同胞家系，對(duì)兩種方法的誘導(dǎo)效果進(jìn)行比較。每個(gè)家系隨機(jī)選取約2 000顆受精卵，采用優(yōu)化后的冷、熱休克誘導(dǎo)條件分別各處理1 000顆以獲得三倍體魚苗；剩余受精卵在正常條件下培育，以獲得二倍體魚苗作為對(duì)照組。

所有魚苗均在同等適宜條件下培育，充足投飼，分別在孵化后10、20、40、60、100和150 d，從溫度休克處理組和正常對(duì)照組中隨機(jī)抽取50尾幼魚進(jìn)行倍性鑒定，并測(cè)量其體長(zhǎng)和體重。剩余魚苗繼續(xù)培養(yǎng)至180 d(幼魚期)，統(tǒng)計(jì)三個(gè)家系中，采用冷、熱休克法所產(chǎn)生后代的存活率及TR。三倍體和二倍體鱖在不同發(fā)育階段生長(zhǎng)差異分析采用t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析及作圖均利用SPSS 13.0軟件完成。統(tǒng)計(jì)值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，P<0.05表示具有顯著差異，P<0.01表示具有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷休克最佳誘導(dǎo)條件的確定

在設(shè)定條件(Temp=2 ℃,DT=20 min)下進(jìn)行冷休克處理最佳起始時(shí)間的篩選，結(jié)果表明受精卵在受精后2、3和4 min進(jìn)行冷休克處理都能誘導(dǎo)產(chǎn)生三倍體鱖魚苗，其中受精后3 min進(jìn)行冷休克處理的SR和TR均達(dá)到峰值(表1，圖2A)，因此采用冷休克法誘導(dǎo)鱖三倍體的最佳起始時(shí)間為受精后3 min。在設(shè)定條件(BT=3 min，DT=20 min)下進(jìn)行冷休克處理最適溫度的篩選，結(jié)果表明在-2、0和2 ℃下，均可以誘導(dǎo)產(chǎn)生三倍體鱖魚苗，其中在-2 ℃下處理獲得后代的TR雖然最高，但FR和SR相對(duì)較低；而在0 ℃條件下處理獲得的后代，其FR、SR和TR均相對(duì)較高(表1，圖2B)，因此綜合考慮，采用冷休克法誘導(dǎo)鱖三倍體的最適處理溫度為0 ℃。在設(shè)定條件(BT=3 min，Temp=0 ℃)下進(jìn)行冷休克處理持續(xù)時(shí)間的篩選，結(jié)果表明冷休克處理10、20、30和40 min都能誘導(dǎo)產(chǎn)生三倍體鱖魚苗，其中處理30 min和40 min時(shí)TR相對(duì)更高，分別可達(dá)到61.2 %和61.1 %，但是冷休克處理40 min的FR和SR急劇下降，而MR則達(dá)到峰值(表1，圖2C)，因此綜合考慮，采用冷休克法誘導(dǎo)鱖三倍體的最適處理持續(xù)時(shí)間為30 min。

圖2 不同冷休克誘導(dǎo)條件下FR、SR、MR及TR的變化

2.2 熱休克最佳誘導(dǎo)條件的確定

在設(shè)定條件(Temp=36 ℃，DT=2 min)下進(jìn)行熱休克處理最佳起始時(shí)間的篩選，結(jié)果表明受精卵在受精后6、7和8 min進(jìn)行誘導(dǎo)可產(chǎn)生三倍體鱖魚苗，并且FR、SR和MR無(wú)顯著差異(P>0.05)，其中受精后7 min進(jìn)行熱休克處理的TR達(dá)到峰值，平均可達(dá)到26.6%(表2，圖3A)，因此采用熱休克法誘導(dǎo)鱖三倍體的最佳起始時(shí)間為受精后7 min。在設(shè)定條件(BT=7 min，DT=2 min)下進(jìn)行熱休克處理最適溫度的篩選，結(jié)果表明在34、36和38 ℃下誘導(dǎo)均能產(chǎn)生三倍體鱖魚苗，并且FR、SR和MR無(wú)顯著性差異，其中38 ℃下誘導(dǎo)的TR達(dá)到峰值，平均可達(dá)到30.0%(表2，圖3B)，因此綜合考慮，采用熱休克法誘導(dǎo)鱖三倍體的最適處理溫度為38 ℃。在設(shè)定條件(BT=7 min，Temp=38 ℃)下進(jìn)行熱休克處理持續(xù)時(shí)間的篩選，結(jié)果表明熱休克處理1 min、2 min和3 min均能誘導(dǎo)產(chǎn)生三倍體，其中處理3 min后TR達(dá)到峰值，盡管FR和SR略低于2 min時(shí)，但并無(wú)顯著性差異(表2，圖3C)，因此綜合考慮，采用熱休克法誘導(dǎo)鱖三倍體的最適處理持續(xù)時(shí)間為3 min。

圖3 不同熱休克誘導(dǎo)條件下FR、SR、MR及TR的變化

2.3 優(yōu)化條件下冷、熱休克方法的比較

由于親本的遺傳差異也會(huì)對(duì)溫度休克的效果造成影響[10]，因此本研究在獲得兩種方法的優(yōu)化條件后，又構(gòu)建了三個(gè)全同胞家系來(lái)比較冷、熱休克法誘導(dǎo)三倍體鱖的實(shí)際效果。結(jié)果表明，采用冷休克法誘導(dǎo)(BT=3 min，Temp=0 ℃，DT=20 min)，幼魚期(180 dph)平均存活率約為40.9%，其中平均TR約為55.40%；采用熱休克法誘導(dǎo)(BT=7 min，Temp=38 ℃，DT=3 min)，三個(gè)家系均在孵化后25～30 d開(kāi)始出現(xiàn)大量發(fā)育畸形的情況，最終1號(hào)和2號(hào)家系的TR盡管分別可達(dá)到26.97% 和22.81%，但幼魚期存活率均未超過(guò)10%，而3號(hào)家系幼魚期存活率僅為1.6%，其中無(wú)三倍體幼魚(表3)。該結(jié)果表明冷休克誘導(dǎo)更適用于鱖三倍體魚苗的規(guī)?；a(chǎn)。

表3 冷、熱休克方法誘導(dǎo)效果比較

2.5 二倍體和三倍體鱖魚苗的生長(zhǎng)性能比較

飼養(yǎng)過(guò)程中觀察到，二倍體和三倍體魚苗在卵黃囊吸收完全后均出現(xiàn)死亡高峰，而三倍體群體在體長(zhǎng)約為20 mm時(shí)又出現(xiàn)一個(gè)明顯的死亡高峰，其中多數(shù)死亡個(gè)體為畸形，在飼養(yǎng)過(guò)程中未出現(xiàn)明顯的發(fā)病現(xiàn)象。對(duì)不同發(fā)育階段的二倍體和三倍體鱖的體長(zhǎng)和體重進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果表明孵化后10、20和40 d的二倍體與三倍體鱖魚苗的體長(zhǎng)和體重均無(wú)顯著差異，60、100和150 d的三倍體鱖魚苗體長(zhǎng)顯著高于二倍體，體重極顯著高于二倍體。生長(zhǎng)速率方面，在孵化后40 d內(nèi)，二倍體和三倍體鱖的體長(zhǎng)和體重平均增長(zhǎng)率均無(wú)顯著差異；孵化后40～150 d，二倍體的體長(zhǎng)和體重平均增長(zhǎng)率分別為0.102 cm/d和3.414 g/d，三倍體的體長(zhǎng)和體重平均增長(zhǎng)率分別為0.159 cm/d和5.037 g/d，均顯著高于二倍體；其中在孵化后40～60 d階段，二倍體和三倍體的生長(zhǎng)速率均達(dá)到最高(表4，圖4)。綜上所述，鱖三倍體魚苗的生長(zhǎng)性能優(yōu)于二倍體，但也存在畸形率較高的問(wèn)題。

表4 二倍體和三倍體鱖在不同發(fā)育階段體長(zhǎng)和體重比較

圖4 二倍體和三倍體鱖生長(zhǎng)性能比較

3 討論

3.1 冷、熱休克誘導(dǎo)效果的比較

人工誘導(dǎo)魚類三倍體的主要方法包括冷休克法[13]、熱休克法[14]以及靜水壓法[15]。由于不同魚類的遺傳背景、生物學(xué)特性以及對(duì)溫度或壓力的敏感性有差異，因此這些方法不一定適用于所有的魚類，并且不同方法的誘導(dǎo)效率通常也有區(qū)別。靜水壓法的誘導(dǎo)率通常高于溫度休克法。例如在人工誘導(dǎo)大黃魚(Pseudosciaenacrocea)三倍體時(shí)發(fā)現(xiàn)，靜水壓法的誘導(dǎo)率要明顯優(yōu)于冷休克法[16]。不過(guò)由于靜水壓休克設(shè)備要求較高，限制了批量化生產(chǎn)的效率，因此目前的研究更多采用溫度休克法誘導(dǎo)魚類三倍體。選擇冷休克法還是熱休克法需要根據(jù)不同物種自然生活環(huán)境的水溫來(lái)判斷，并通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)確定[17]。因?yàn)椴煌~類受精卵對(duì)溫度的敏感性不同，從而造成了耐受溫度的差異，通常溫水性魚類采用冷休克法誘導(dǎo)，而冷水性魚類常采用熱休克法誘導(dǎo)，冷、熱刺激的溫度均不能超過(guò)該物種的自然致死溫度[18]。

Xu等[10]采用熱休克法誘導(dǎo)鱖三倍體時(shí)發(fā)現(xiàn)，在受精后8 min將受精卵置于41 ℃下熱休克處理2 min，可獲得40%的三倍體檢出率。本研究的結(jié)果與之有所區(qū)別，當(dāng)孵化水溫高于40 ℃后，發(fā)現(xiàn)鱖受精卵及魚苗幾乎無(wú)法存活，這一結(jié)果與何利君[19]的結(jié)論較為一致。而在優(yōu)化后的熱休克處理?xiàng)l件下，盡管仔魚期(孵化后8 d)的三倍體檢出率可達(dá)到38.0%，但在孵化后25～30 d開(kāi)始出現(xiàn)大量發(fā)育畸形的情況，最終三倍體幼魚的存活率不足3%，推測(cè)可能是鱖的胚胎發(fā)育對(duì)高溫較為敏感導(dǎo)致的[19]。此外，在優(yōu)化后的冷休克處理?xiàng)l件下，仔魚期(孵化后8 d)和幼魚期的三倍體檢出率分別為61.2% 和56.0%，表明相比于熱休克誘導(dǎo)，冷休克誘導(dǎo)更適用于鱖三倍體的規(guī)模化生產(chǎn)。不過(guò)本研究在飼養(yǎng)冷休克誘導(dǎo)的三倍體鱖時(shí)也發(fā)現(xiàn)，魚苗在體長(zhǎng)約為20 mm時(shí)出現(xiàn)了一個(gè)明顯的死亡高峰，其中多數(shù)死亡個(gè)體為畸形，這可能是由于冷休克處理的時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)胚胎造成了一定損害所導(dǎo)致的[18]。宋立民等在采用冷、熱休克兩種方法誘導(dǎo)黃顙魚三倍體時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象[5]。

3.2 影響溫度休克誘導(dǎo)效果的因素

結(jié)合國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)多種魚類進(jìn)行溫度休克誘導(dǎo)的研究結(jié)果，適宜的休克起始時(shí)間、休克溫度和持續(xù)時(shí)間是保證三倍體誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵因素和重要前提。而在不同魚類中或者在同一物種中利用不同的溫度休克方法時(shí)，這三個(gè)關(guān)鍵因素的重要性主次順序也有所不同。尤鋒[20]在采用冷、熱休克法對(duì)黑鯛(Sparusmicrocephalus)進(jìn)行三倍體人工誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩種方法的三倍體率受三個(gè)因素影響程度的順序均依次為：持續(xù)時(shí)間>起始時(shí)間>處理溫度。而利用冷休克法誘導(dǎo)紅鰭東方鲀(Takifugurubripe)三倍體[21]和利用熱休克法誘導(dǎo)虹鱒(Oncorhynchusmykiss)三倍體[22]時(shí)，溫度休克持續(xù)時(shí)間也是影響三倍體率的最重要因素。宋立民等[5]利用冷休克法對(duì)黃顙魚進(jìn)行三倍體人工誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，休克起始時(shí)間是TR和孵化率的重要影響因子，處理溫度則是畸形率的重要影響因子；而利用熱休克法誘導(dǎo)三倍體時(shí)，處理溫度是三倍體率、畸形率和SR的重要影響因子，次之為起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間。產(chǎn)生這種差異的原因目前尚不明確，而除了上述三個(gè)重要因子外，不同物種當(dāng)中影響多倍體誘導(dǎo)效果的其他因素也不盡相同，親本的遺傳差異，受精卵的質(zhì)量和生物性狀，以及休克處理時(shí)的具體環(huán)境條件等都是值得考慮的因素[5,9]。目前在關(guān)于鱖魚三倍體誘導(dǎo)的研究中，尚無(wú)對(duì)多因素影響的討論[10]，未來(lái)將對(duì)此進(jìn)行更為深入的研究。

3.3 二倍體和三倍體鱖魚苗的生長(zhǎng)性能比較

人工誘導(dǎo)魚類三倍體的主要目的，是希望通過(guò)阻礙其性腺發(fā)育，提高生長(zhǎng)速度和抗逆性能，提升肉質(zhì)和產(chǎn)量，此外由于三倍體的不育性，也能有效防止其對(duì)原始生態(tài)系統(tǒng)的破壞[1]。然而關(guān)于三倍體魚類生長(zhǎng)性能的研究，不同品種的魚類其結(jié)果也有差異。例如，楊興棋和陳敏容利用二倍體白鯽(Carassiusauratus)與四倍體白鯽交配獲得了異源三倍體白鯽，相比正常二倍體，其體型更大，生長(zhǎng)更快[23]。而在歐洲黑鱸(Dicentrarchuslabrax)[24]和烏鱧(C.argus)[8]中發(fā)現(xiàn)，三倍體與二倍體的生長(zhǎng)速度無(wú)顯著差異。大菱鲆(Scophthalmusmaximus)三倍體在性成熟前，與二倍體的生長(zhǎng)無(wú)顯著差異，但達(dá)到初次性成熟后，三倍體生長(zhǎng)顯著快于二倍體[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，孵化后10～40 d的三倍體與二倍體鱖的生長(zhǎng)速度無(wú)顯著差異，孵化后60～150 d的三倍體生長(zhǎng)速度顯著快于二倍體，隨著二倍體鱖性腺的發(fā)育，兩者的生長(zhǎng)性能變化仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

綜上所述，受精后3 min將受精卵置于0 ℃下冷休克處理20 min，然后轉(zhuǎn)移至26 ℃水體中繼續(xù)培養(yǎng)，此方法獲得魚苗的受精率為52.5%，相對(duì)存活率為56.6%，相對(duì)畸形率為13.6%，三倍化率為61.2%；最優(yōu)的熱休克誘導(dǎo)條件為：受精后7 min將受精卵置于38 ℃下熱休克處理3 min，然后轉(zhuǎn)移至26 ℃水體中繼續(xù)培養(yǎng)，此方法獲得魚苗的受精率為30.4%，相對(duì)存活率為33.4%，相對(duì)畸形率為14.5%，三倍化率為38.0%。通過(guò)比較冷、熱休克法誘導(dǎo)的魚苗在幼魚期的存活率和三倍化率，證明了冷休克誘導(dǎo)更適用于鱖三倍體魚苗的規(guī)?；a(chǎn)。通過(guò)比較二倍體和三倍體鱖在不同生長(zhǎng)階段的生長(zhǎng)速率，證明了三倍體鱖魚苗具有更為優(yōu)良的生長(zhǎng)性能。后續(xù)需要對(duì)冷休克法誘導(dǎo)鱖三倍體的條件進(jìn)一步優(yōu)化，提高誘導(dǎo)率，降低畸形率，以期達(dá)到滿足規(guī)?；a(chǎn)的要求。