甘露聚糖酶和纖維素酶對(duì)玉米-小麥-豆粕型日糧的體外消化評(píng)價(jià)

毛 培,劉蘆鵬,王占彬,馬文鋒*

(1.蘭州大學(xué) 草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2.河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023)

目前，以植物原料為基礎(chǔ)的畜禽日糧中，存在較高含量的非淀粉多糖，如甘露聚糖和纖維素等[1]。這一類多糖經(jīng)動(dòng)物采食后可以與食糜中的水分子結(jié)合，增加胃腸內(nèi)容物的黏度，抑制機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用效率[1-2]。由于單胃動(dòng)物不能分泌非淀粉多糖酶，因此在畜禽生產(chǎn)中主要通過(guò)外源酶的方式進(jìn)行添加。研究表明，在日糧中添加一些非淀粉多糖酶，如甘露聚糖酶和纖維素酶等，可以破壞植物原料的細(xì)胞壁、釋放其包裹的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、提高日糧養(yǎng)分與胃腸消化酶的接觸面積、專一性的將部分多糖分解為小分子物質(zhì)，改善腸道消化環(huán)境，促進(jìn)對(duì)日糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[3-5]。

在評(píng)價(jià)外源酶的作用效果時(shí)，可采用動(dòng)物試驗(yàn)法和體外酶解方法[6-7]。在通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)法進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，可以直觀地檢測(cè)添加酶制劑對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的影響。然而，動(dòng)物試驗(yàn)法周期較長(zhǎng)，也需保證相當(dāng)數(shù)量的動(dòng)物群體才能完成，因此難以評(píng)價(jià)多種酶制劑的作用效果[8]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，體外酶解方法可以合理地模擬動(dòng)物消化環(huán)境，同時(shí)具備試驗(yàn)周期短、重復(fù)性高等諸多優(yōu)點(diǎn)，可以很好地反映添加酶制劑對(duì)日糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響[8]。因此，本試驗(yàn)主要采用體外酶解法，分別以干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)酶解率、還原糖生成量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究了甘露聚糖酶和纖維素酶對(duì)玉米-小麥-豆粕型日糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)酶解效率的影響。

1 材料與方法

1.1 酶制劑

試驗(yàn)所用甘露聚糖酶和纖維素酶均為單酶，購(gòu)自河南仰韶生化工程有限公司。酶活性分別為甘露聚糖酶50 000 U/g、纖維素酶10 000 U/g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及日糧組成

本試驗(yàn)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，每個(gè)酶分別設(shè)置5個(gè)濃度梯度，每個(gè)梯度分別設(shè)置6個(gè)重復(fù)，其中甘露聚糖酶的添加濃度分別為5、15、25、35、45 U/g，纖維素酶的添加濃度分別為1、3、5、7、9 U/g。

試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)見表1。粉碎小麥、豆粕、玉米和麩皮各200 g，過(guò)60目篩網(wǎng)后，用四分法分別獲得四種原料各50 g、20 g、20 g和10 g，混勻后置于包裝袋內(nèi)密封，備用。當(dāng)取樣時(shí)，采用十萬(wàn)分之一天平稱取試驗(yàn)日糧樣品。

1.3 體外酶解操作過(guò)程

準(zhǔn)確稱取1 g左右的飼料樣品(精確至0.0001g)，置于透析袋后編號(hào)，置于150 mL三角瓶中，加入20 mL HCl-NaCl緩沖液(0.1 mol/L，pH2.0)和0.1 g的胃蛋白酶(Sigma，P7000)，用封口膜封緊瓶口。在厭氧條件下，將三角瓶置于39℃恒溫?fù)u床內(nèi)振蕩6 h，震蕩頻率為70 r/min。

表1 試驗(yàn)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)成分Table 1 Ingredient composition of the experimental diets

模擬小腸酶解過(guò)程：體外消化6 h后，暫停搖床，取出三角瓶打開封口膜，向三角瓶中準(zhǔn)確加入20 mL磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)和2.5 mL胰蛋白復(fù)合酶溶液，在溶液pH 7.0、厭氧環(huán)境下，封好三角瓶的瓶口，置于39℃恒溫?fù)u床中震蕩24 h，震蕩頻率為70 r/min。

還原糖生成量測(cè)定：24 h后取出三角瓶中透析袋，室溫靜置20 min，吸取1 mL上清液于試管中，加入DNS檢測(cè)液2 mL，于水浴鍋中煮沸5 min，取出，冷卻至室溫，加入9 mL蒸餾水，混勻。移液槍移取混合液于比色皿中，在540 nm光波處測(cè)定各溶液的吸光度值，通過(guò)還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算上清液中的還原糖含量。

還原糖生成量(mg/g)=(C×VT)/(m×VS) ×1000

式中：C：標(biāo)準(zhǔn)曲線所查糖量(mg)；VT：提取液的體積(mL)；m：樣品的質(zhì)量(g)；VS：測(cè)定時(shí)的溶液體積(mL)。

干物質(zhì)和粗蛋白酶解效率的測(cè)定：使用絕干稱重的濾紙對(duì)三角瓶中的酶解殘?jiān)婵粘闉V，將抽濾后的殘?jiān)蜑V紙置于105 ℃烘箱中烘干至恒重，使用半自動(dòng)定氮儀測(cè)定粗蛋白含量。干物質(zhì)和粗蛋白酶解率的計(jì)算公式如下：

干物質(zhì)酶解率(%)=(M0-M1)/M0×100

粗蛋白質(zhì)酶解率(%)=(M0×CP0-M1×CP1)/(M0×CP0)×100

式中：M0：飼料樣品干物質(zhì)重量(g)；M1：未酶解殘?jiān)晌镔|(zhì)重量(g)；CP0：飼料樣品粗蛋白含量(%)；CP1：未酶解殘?jiān)值鞍缀?%)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以重復(fù)為單位，采用SAS(2001)中GLM模型進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過(guò)線性(Linear)和二次(Quadratic)效應(yīng)評(píng)估不同濃度甘露聚糖酶和纖維素酶對(duì)日糧還原糖生成量、干物質(zhì)和粗蛋白酶解效率的影響，處理間顯著性判定水平為P<0.05，數(shù)據(jù)平均值以LSMEANS表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加甘露聚糖酶對(duì)日糧還原糖生成量、干物質(zhì)和粗蛋白酶解效率的影響

由表2可知，試驗(yàn)日糧添加甘露聚糖酶時(shí)，可以顯著提高試驗(yàn)日糧的還原糖生成量(線性和二次，P<0.05)。當(dāng)甘露聚糖酶添加量分別為25、35 U/g時(shí)，還原糖生成量顯著高于對(duì)照組和5 U/g劑量添加組(P<0.05)。

表2 添加甘露聚糖酶對(duì)日糧還原糖生成量、干物質(zhì)和粗蛋白酶解率的影響Table 2 The effects of mannanase on the reducing sugar production, enzymolysis efficiency of dry matter and crude protein in the diet

由表3可知，隨著甘露聚糖酶添加比例的提高，還原糖生成量與甘露聚糖酶含量存在線性和二次方程關(guān)系。本試驗(yàn)中關(guān)于甘露聚糖酶的最佳添加量由線性方程推導(dǎo)得出，以還原糖為評(píng)價(jià)指標(biāo)：該方程為Y=45.07-0.860(20.69-x)，推導(dǎo)得出甘露聚糖酶的最適添加量為20.7 U/g。

表3 甘露聚糖酶添加水平與還原糖生成量的關(guān)系Table 3 The correlation between the additional level of mannanase with reducing sugar production

2.2 添加纖維素酶對(duì)日糧還原糖生成量、干物質(zhì)和粗蛋白酶解效率的影響

由表4可知，添加纖維素酶對(duì)干物質(zhì)和粗蛋白酶解率無(wú)顯著影響，但能顯著提高日糧的還原糖生成量(線性和二次，P<0.05)。當(dāng)纖維素酶的添加量為5、7、9 U/g時(shí)，還原糖生成量顯著高于其余各組(P<0.05)。

由表5可知，隨著日糧中纖維素酶添加比例的提高，還原糖生成量與纖維素酶含量存在線性和二次方程關(guān)系。本試驗(yàn)中關(guān)于纖維素酶的最佳添加量由線性方程推導(dǎo)得出，以還原糖為評(píng)價(jià)指標(biāo)：該方程為Y=51.85-2.625(6.297-x)，推導(dǎo)得出纖維素酶的最適添加量為6.3 U/g。

表4 添加纖維素酶對(duì)日糧還原糖生成量、干物質(zhì)和粗蛋白酶解效率的影響Table 4 The effects of cellulase on the reducing sugar production, enzymolysis efficiency of dry matter and crude protein in the diet

表5 纖維素酶添加水平與還原糖生成量的關(guān)系Table 5 The correlation between the additional level of cellulase with reducing sugar production

3 討 論

酶制劑是從動(dòng)物、微生物或植物中提取的具有生物催化活性的一類蛋白質(zhì)，分子量較高，具有高效性和專一性的特點(diǎn)，其在適宜的溫度、pH等環(huán)境條件下具備較高活力，可按實(shí)際生產(chǎn)需要進(jìn)行合理使用[9]。日糧的植物原料結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，其所含的多糖類物質(zhì)難以被動(dòng)物消化吸收，因此在飼料中通常添加多種非淀粉多糖酶，才能更好的發(fā)揮酶制劑的水解作用[10]。然而，非淀粉多糖酶的種類較多，不同種類酶的來(lái)源、作用位點(diǎn)和專一性底物也存在差異[11]。

目前，甘露聚糖酶和纖維素酶均已應(yīng)用于不同領(lǐng)域，如醫(yī)藥、紡織、食品和飼料行業(yè)等[12-14]。在豆粕型日糧中甘露聚糖含量較高，添加甘露聚糖酶可以專一性的提高甘露聚糖的利用效率，消除其對(duì)動(dòng)物消化道帶來(lái)的抗?fàn)I養(yǎng)作用[14]。研究表明，在蛋雞或仔豬日糧中添加適宜劑量的甘露聚糖酶，可以提高蛋雞的產(chǎn)蛋量和平均蛋重[15]，或可以提高仔豬的平均日增重，同時(shí)降低仔豬腹瀉率[14]。纖維素酶的來(lái)源較為廣泛，其中微生物源的纖維素酶生產(chǎn)成本較低，應(yīng)用領(lǐng)域更為廣泛[12-13]。在日糧中添加纖維素酶，可以在一定程度上刺激動(dòng)物機(jī)體內(nèi)源酶的分泌，打破細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使消化酶與飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充分接觸，進(jìn)而改善飼料的養(yǎng)分利用率，同時(shí)也可改變纖維多糖的物理結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變纖維源的系水力，降低腸道內(nèi)食糜的黏度，降低腸道負(fù)擔(dān)，從而提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能[13]。

本試驗(yàn)中，當(dāng)甘露聚糖酶和纖維素酶的添加濃度分別由5 U/g提高至45 U/g或由1 U/g提高至9 U/g時(shí)，可以顯著提高日糧還原糖的生成量，然而對(duì)粗蛋白質(zhì)和干物質(zhì)酶解率無(wú)明顯影響，相關(guān)原因尚不清楚，有待于進(jìn)一步的研究。這也說(shuō)明在評(píng)價(jià)甘露聚糖酶和纖維素酶的體外作用效果時(shí)，還原糖生成量指標(biāo)更為敏感，與酶的添加劑量存在效應(yīng)關(guān)系。也在一定程度上表明，在日糧中添加甘露聚糖酶和纖維素酶時(shí)，其發(fā)揮作用的主要機(jī)制是將大分子糖苷鍵分解為小分子糖，進(jìn)而提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率[16-17]。

4 結(jié) 論

甘露聚糖酶和纖維素酶的添加濃度分別由5 U/g提高至45 U/g和由1 U/g提高至9 U/g時(shí)，顯著提高了日糧的還原糖生成量(線性和二次，P<0.05)。以還原糖生成量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，甘露聚糖酶和纖維素酶添加的最適添加濃度分別為20.7 U/g和6.3 U/g。