草海桐鏈格孢葉斑病菌生物學(xué)特性及殺菌劑的室內(nèi)篩選

王義 胡美姣 李敏 高兆銀 洪小雨 張紹剛 趙超

摘? 要：西沙群島草海桐鏈格孢葉斑病發(fā)生普遍，前期筆者鑒定了該病的病原菌為長(zhǎng)柄鏈格孢菌（Alternaria longipes）。為進(jìn)一步明確該病原菌的生物學(xué)特性及其對(duì)殺菌劑的敏感性，采用生長(zhǎng)速率法對(duì)長(zhǎng)柄鏈格孢菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究，并測(cè)定了苯醚甲環(huán)唑等13種殺菌劑對(duì)該病原菌的室內(nèi)毒力。結(jié)果表明：該菌菌落最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（PDA），其次是馬鈴薯蔗糖固體培養(yǎng)基（PSA）;適宜生長(zhǎng)溫度范圍為25～30 ℃，最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃;適宜生長(zhǎng)pH為5.0～7.0，最適pH為6.0;最佳碳源為蔗糖，而果糖不利于菌落生長(zhǎng);最佳氮源為甘氨酸，而尿素不利于菌落生長(zhǎng);光照時(shí)間對(duì)菌落生長(zhǎng)無顯著影響。室內(nèi)毒力測(cè)定表明，苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑的抑菌效果最好，EC50值為0.15 ?g/mL，其次是氟硅唑乳油、己唑醇懸浮劑和戊菌唑乳油，其EC50值分別為0.37、0.44和0.51 ?g/mL，嘧菌酯懸浮劑和多菌靈可濕性粉劑的抑菌效果最差，EC50值均大于3000 ?g/mL。

關(guān)鍵詞：草海桐;長(zhǎng)柄鏈格孢;生物學(xué)特性;殺菌劑;毒力測(cè)定

中圖分類號(hào)：S763.7? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Alternaria leaf blight of Scaevola taccada is a common and serious disease in Xisha Island. The pathogen of the disease was identified as Alternaria longipes. To further clarify the biological characteristics of the pathogen and its sensitivity to fungicides. Therefore， in this study， the biological characteristics of A. longipes were preliminarily studied by the mycelium growth rate method， and the toxicological test of 13 fungicides such as difenoconazole to this pathogen was determined. The optimum growth medium was potato dextrose agar medium （PDA）， followed by potato sugar agar medium （PSA）. The suitable growth temperature was 25 to 30 ℃， and the optimum growth temperature was 28 ℃. The suitable pH value was 5.0 to 7.0， and the optimum pH value was 6.0. The optimal carbon source was sucrose， while fructose was not conducive to colony growth. The optimal nitrogen source was glycine， while urea was not conducive to colony growth. Light time had no significant effect on colony growth. Laboratory toxicity test showed that the best inhibition effect was found in difenoconazole water-dispersible granular with EC50 value of 0.15 ?g/mL， followed by flusilazole emulsion， hexazolium suspension agent and penconazole emulsion， with EC50 values of 0.37， 0.44 and 0.51 ?g/mL， respectively， while azoxystrobin suspension agent and carbendazol wettable powder had the worst inhibitory effect， with an EC50 value of more than 3000 ?g/mL.

Keywords： Scaevola taccada; Alternaria longipes; biological characteristics; fungicide; toxicological test

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.018

草海桐（Scaevola taccada）又稱羊角樹、小草海桐、水草仔[1]，是草海桐科（Goodeniaceae）草海桐屬（Scaevola）多年生常綠亞灌木植物[2]，廣泛分布于熱帶、亞熱帶太平洋和印度洋沿岸[3-4]，是典型的濱海適生植物。我國主要分布于海南、臺(tái)灣、福建、廣東和廣西等南部沿海灘涂地區(qū)[5]。草海桐生長(zhǎng)迅速，具有極強(qiáng)的抗風(fēng)、耐鹽、耐旱性，具有較高的光合能力和水分利用效率，從而在熱帶島嶼上表現(xiàn)出良好的適應(yīng)能力[6-7]，常在各個(gè)島嶼形成單優(yōu)群落[8]。因此，草海桐被選作島嶼、島礁的主要海岸固沙防潮樹種[2]和原生綠化觀賞植物[9]。國外對(duì)草海桐屬植物病害的報(bào)道最早可追溯到1928年，在澳大利亞珀斯發(fā)現(xiàn)了由Puccinia dampierae引起的草海桐葉銹病[10]，此后陸續(xù)報(bào)道了草海桐屬植物上的病害，在澳大利亞穆拉和達(dá)爾文市分別發(fā)現(xiàn)Uromyces sp.和Mycosphaerella scaevolae引起的草海桐葉銹病和葉斑病[11-13]，在日本關(guān)島發(fā)現(xiàn)Capnodium sp.、Mycosphaerella sp.和M. scaevolae為害草海桐引起葉斑病[11-12]，在新喀里多尼亞發(fā)現(xiàn)Pseudocercospora scaevolae和Cercospora scaevolae引起草海桐葉斑病[13-15]，在美國佛羅里達(dá)和夏威夷分別發(fā)現(xiàn)黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）和Zasmidium scaevolicola引起草海桐葉片褪綠環(huán)狀病斑和葉斑癥狀[14-15]。然而，中國目前除臺(tái)灣在2009年報(bào)道了草海桐病毒病外[16]，尚無草海桐真菌病害的相關(guān)報(bào)道。

筆者于2018—2019年在西沙群島進(jìn)行植物病害調(diào)查時(shí)，發(fā)現(xiàn)一種草海桐葉斑病發(fā)生普遍，嚴(yán)重影響草海桐的生長(zhǎng)和觀賞價(jià)值。前期通過常規(guī)組織

分離法、致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法，確定草海桐葉斑病的病原為長(zhǎng)柄鏈格孢菌Alternariu longipes （Ellis & Everh.） EW. Mason[17-18]。屬半知菌類、絲孢綱、絲孢目、暗色孢科、鏈格孢屬[19]。該菌寄主范圍主要包括白術(shù)[20]、油棕[21]、馬鈴薯[22]、非洲菊[23]、紫花苜蓿[24]、菝葜[25]、落花生[26]和煙草[27-29]，其中長(zhǎng)柄鏈格孢菌（A. longipes）引起的煙草赤星病在世界各主要煙草種植區(qū)廣泛發(fā)生，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[28-30]。本研究擬在草海桐葉斑病病原菌鑒定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展該病原菌的生物學(xué)特性及防治藥劑篩選研究，以期為更好防治該病害和保護(hù)海岸生態(tài)環(huán)境提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試菌株? 長(zhǎng)柄鏈格孢菌（A. longipes），分離自西沙群島草海桐病葉，純化、保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2? 供試藥劑? 供試殺菌劑的名稱、生產(chǎn)廠家及所用濃度如表1所示。

1.1.3? 供試培養(yǎng)基? 馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）、查氏固體培養(yǎng)基（Czapek）、馬鈴薯牛肉膏培養(yǎng)基（PDBA）、馬鈴薯蔗糖固體培養(yǎng)基（PSA）、燕麥片培養(yǎng)基（OMA）、燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基（OA）、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA），配好培養(yǎng)基于121 ℃濕熱滅菌20 min[31]。

1.2? 方法

1.2.1? 培養(yǎng)基種類對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響? 將已活化病原菌用打孔器（Φ=5.0 mm）打孔，分別接種在PDA、Czapek、PDBA、PSA、OMA、OA和CMA 7種不同培養(yǎng)基平板中央。置于28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑并觀察菌落形態(tài)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2? 培養(yǎng)條件對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響? 溫度對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響：將病原菌接種于PDA平板中央，分別置于5、10、15、20、25、28、30、35、40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)[32]，每個(gè)處理3皿，重復(fù)3次，其余方法同1.2.1。

pH對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響：用已滅菌的1.0 mol/L HCl和1.0 mol/L NaOH將滅菌的PDA培養(yǎng)基pH分別調(diào)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0共10個(gè)梯度，倒入9.0 cm平板，冷卻，將直徑5.0 mm的菌餅，接種于不同pH的平板中央，28 ℃下黑暗培養(yǎng)，每個(gè)處理3皿，重復(fù)3次，其余方法同1.2.1。

碳源對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響：以Czapek固體培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以等質(zhì)量的可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖、果糖、葡萄糖和木糖替代蔗糖做成不同碳源固體培養(yǎng)基，以不加蔗糖的Czapek培養(yǎng)基作為無碳對(duì)照[33]，于28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，其余方法同1.2.1。

氮源對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響：以Czapek固體培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以等質(zhì)量氮素的硫酸銨、氯化銨、尿素、蛋白胨、酵母粉、丙氨酸、甘氨酸和賴氨酸替代硝酸鈉制成不同氮源的固體培養(yǎng)基，以不加硝酸鈉的Czapek培養(yǎng)基作為無氮對(duì)照。于28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，其余方法同1.2.1。

光照對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響：取菌餅接種于PDA平板中央，置于人工氣候箱（Climacell 222，單門），5根燈管（18 W/根），培養(yǎng)皿與燈管距離為10 cm，分別采用全光照（7 d）、12 h光照+12 h黑暗交替和全黑暗（7 d）條件下，于28 ℃恒溫培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次，其余方法同1.2.1。

1.2.3? 殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定? 研究13種殺菌劑對(duì)長(zhǎng)柄鏈格孢菌菌落生長(zhǎng)的影響，首先進(jìn)行藥劑濃度粗篩試驗(yàn)，采用含藥平板法進(jìn)行試驗(yàn)[34]，每個(gè)藥劑設(shè)置5個(gè)濃度梯度（1、10、50、100、200 ?g/mL），接菌餅于平板中央，于28 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d后測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率（如下式），每個(gè)處理重復(fù)3次。復(fù)篩試驗(yàn)依據(jù)初篩試驗(yàn)的菌落抑制率，設(shè)計(jì)了7個(gè)合適的復(fù)篩濃度（表1），以無菌水作為對(duì)照，方法同1.2.1，每個(gè)處理重復(fù)3次，計(jì)算抑制率。以復(fù)篩試驗(yàn)設(shè)定濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制幾率值為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，并由回歸方程計(jì)算半最大效應(yīng)濃度（EC50值）。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-0.5）×100%

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析，求出毒力回歸方程、EC50值和相關(guān)系數(shù)（r），用SPSS 17.0軟件進(jìn)行最小顯著差異法（LSD）檢驗(yàn)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同培養(yǎng)基對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

結(jié)果顯示，長(zhǎng)柄鏈格孢菌在7種培養(yǎng)基上均能較好生長(zhǎng)，培養(yǎng)7 d后菌落直徑都在6.00 cm以上;其中在PDA、PSA、Czapek和OMA上生長(zhǎng)較好，菌落直徑均在7.00 cm以上，在PDA上生長(zhǎng)最好，菌落直徑最大，氣生菌絲最茂盛，在第7天菌落直徑達(dá)到8.15 cm;在PDBA上生長(zhǎng)最差，菌落直徑最小，但氣生菌絲較茂盛，菌落直徑為6.08 cm;在OMA、OA、CMA培養(yǎng)基上菌落直徑較大，但菌絲生長(zhǎng)稀疏（表2）。

2.2? 不同溫度對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

結(jié)果表明，長(zhǎng)柄鏈格孢菌在5～35 ℃的溫度范圍內(nèi)都能生長(zhǎng)，適宜生長(zhǎng)溫度為25～30 ℃，28 ℃菌落生長(zhǎng)最好，溫度高于40 ℃菌落不生長(zhǎng)。且不同溫度下菌落大小和菌絲密度有較大差異。溫度為5 ℃時(shí)，菌落在第4天開始生長(zhǎng)，7 d后菌落直徑僅1.40 cm，菌落白色，菌絲稀疏;溫度高于40 ℃時(shí)菌落不生長(zhǎng)，表明該菌較耐低溫，耐高溫性較差;在28 ℃時(shí)菌落生長(zhǎng)最好，菌落直徑最大，在第7天菌落直徑達(dá)8.35 cm，菌落中間墨綠色，邊緣灰白色，菌絲生長(zhǎng)密集，表明該菌的最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃（表3）。

2.3? 不同pH對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)柄鏈格孢菌能適應(yīng)較寬的pH值范圍，在pH為3.0～12.0之間都能生長(zhǎng)，較適宜生長(zhǎng)的pH范圍為5.0～7.0，pH為6.0時(shí)生長(zhǎng)最好，培養(yǎng)7 d的菌落直徑達(dá)最大;酸性條件（pH 3.0～4.0）嚴(yán)重抑制生長(zhǎng)，菌落直徑較小，不利于該菌生長(zhǎng);堿性條件（pH 8.0～12.0）對(duì)菌落生長(zhǎng)影響不大，菌落直徑保持在6.20 cm左右。表明長(zhǎng)柄鏈格孢菌更適宜在中性和堿性條件下生長(zhǎng)，酸性條件不利于其生長(zhǎng)（表4）。

2.4? 不同碳源對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

長(zhǎng)柄鏈格孢菌在不同碳源上均能生長(zhǎng)，菌落生長(zhǎng)大小差異不顯著，該菌在含乳糖、淀粉、木糖和蔗糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)都較好，培養(yǎng)7 d的菌落直徑均達(dá)5.30 cm以上;在蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，氣生菌絲茂密，菌落直徑達(dá)5.66 cm;在含果糖和葡萄糖的培養(yǎng)基上菌落直徑較小，但氣生菌絲茂盛;在無糖培養(yǎng)基上菌落直徑（Φ= 5.25 cm）雖然較大，但是菌絲生長(zhǎng)稀疏。表明該菌能較好利用乳糖、木糖、蔗糖和淀粉作為碳源，在無碳條件下也能生長(zhǎng)，但長(zhǎng)勢(shì)差，菌絲非常稀疏（表5）。

2.5? 不同氮源對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，長(zhǎng)柄鏈格孢菌在含不同氮源的培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。在含有蛋白胨、硝酸鈉、丙氨酸和甘氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好，氣生菌絲旺盛，菌落直徑較大，培養(yǎng)7 d的菌落直徑為5.32～5.85 cm;在甘氨酸培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的最好，菌絲茂密，菌落直徑最大，達(dá)5.85 cm;該菌在無氮培養(yǎng)基上也能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)較差，氣生菌絲較少，菌落直徑為3.67 cm;在含尿素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最差，培養(yǎng)7 d的菌落直徑為2.08 cm，菌落呈棕褐色，氣生菌絲少。表明該菌能較好的利用甘氨酸、蛋白胨和硝酸鈉作為氮源，能在含尿素培養(yǎng)基和無氮條件下生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)較差，稀疏（表6）。

2.6? 不同光照對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

不同光照對(duì)長(zhǎng)柄鏈格孢菌菌落生長(zhǎng)無顯著影響，培養(yǎng)7 d的菌落直徑均在7.10 cm以上，光暗交替菌落直徑最大。不同光照條件下，菌落形態(tài)有所差異。全光照培養(yǎng)，菌落中央為灰白色，邊緣白色、整齊，氣生菌絲較厚;12 h光照+12 h黑暗培養(yǎng)，菌落中央灰褐色，邊緣白色、整齊，氣生菌絲較厚;全黑暗條件培養(yǎng)，菌落中央為墨綠色，邊緣白色，氣生菌絲最厚，密度最大（表7）。

2.7? 不同殺菌劑對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，13種殺菌劑中苯醚甲環(huán)唑的抑制效果最好，嘧菌酯和多菌靈抑制效果最差。其中 10% 苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑的抑制效果最好，EC50值為0.15 ?g/mL，其次是40%氟硅唑乳油、10%己唑醇懸浮劑和 10% 戊菌唑乳油，EC50值分別為0.37、0.44和0.51 ?g/mL，再次是12.5%烯唑醇可濕性粉劑、43%戊唑醇懸浮劑、25%丙環(huán)唑乳油、25%吡唑醚菌酯懸浮劑和 40% 腈菌唑懸浮劑，EC50值在1.0～3.0 ?g/mL之間，對(duì)長(zhǎng)柄鏈格孢菌菌落生長(zhǎng)抑制效果較差的是15%三唑酮可濕性粉劑和40%百菌清懸浮劑，EC50值分別為37.80、44.07 ?g/mL，而抑制效果最差的為25%嘧菌酯懸浮劑和50%多菌靈可濕性粉劑，EC50值分別為3928.25、358 096.44 ?g/mL（表8）。

3? 討論與結(jié)論

對(duì)西沙群島草海桐鏈格孢病菌的生物學(xué)特性研究表明，該菌的菌落適宜生長(zhǎng)溫度范圍為25～ 30 ℃，最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃;菌落在pH為3.0～12.0之間都能生長(zhǎng)，適宜生長(zhǎng)pH范圍為5.0～7.0，最適生長(zhǎng)pH為6.0。這與龍亞琴[35]、黎妍妍等[36]研究的煙草赤星病菌（長(zhǎng)柄鏈格孢菌）的最適溫度和pH基本一致。該病原菌在含有乳糖、淀粉、木糖和蔗糖的培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)都較好，在蔗糖上生長(zhǎng)最好;在含有蛋白胨、硝酸鈉、丙氨酸和甘氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好，在甘氨酸上生長(zhǎng)最好，與部分研究稍有差異。龍亞琴[35]研究認(rèn)為鏈格孢病菌在淀粉和酵母膏上生長(zhǎng)最好，黎妍妍等[36]研究認(rèn)為最適氮源為氯化銨。這些研究結(jié)果的差異可能是由于病原菌不同分離地點(diǎn)和寄主等原因引起的。光照時(shí)間對(duì)該菌菌落生長(zhǎng)無明顯影響。在PDA、Czapek、PDBA、PSA、OMA、OA和CMA 7種培養(yǎng)基上均能較好生長(zhǎng)，培養(yǎng)7 d菌落直徑均可達(dá)到6.0 cm以上，在PDA上生長(zhǎng)最好，菌落直徑最大，氣生菌絲最茂盛，菌落中間墨綠色，邊緣灰白色，整齊，背面中央褐色，邊緣白色。比較該病菌對(duì)溫度、pH、培養(yǎng)基質(zhì)及光照的敏感性時(shí)發(fā)現(xiàn)，該病菌對(duì)溫度最為敏感，低于20 ℃或高于30 ℃時(shí)病菌生長(zhǎng)將受到很大抑制，而西沙群島年均溫27 ℃的溫度條件非常有利于該病害的發(fā)生和傳播。

草海桐長(zhǎng)柄鏈格孢菌室內(nèi)毒力測(cè)定表明，供試的13種殺菌劑對(duì)菌落生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，隨著濃度的增加，抑制效果增強(qiáng)，但不同藥劑的抑制效果有所差異，其中10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑的抑制效果最好，EC50值為0.15 ?g/mL;其次是40%氟硅唑乳油、10%己唑醇懸浮劑和10%戊菌唑乳油，EC50值分別為0.37、0.44和0.51 ?g/mL;而15%三唑酮可濕性粉劑和40%百菌清懸浮劑對(duì)該菌的抑制效果較差，EC50值分別為37.80、44.07 ?g/mL;抑制效果最差的為25%嘧菌酯懸浮劑和50%多菌靈可濕性粉劑，EC50值分別為3 928.25、358 096.44 ?g/mL。本研究結(jié)果表明，對(duì)長(zhǎng)柄鏈格孢菌抑制效果最好的為苯醚甲環(huán)唑，其次是氟硅唑、己唑醇和戊菌唑。研究結(jié)果為今后防治長(zhǎng)柄鏈格孢菌提供了理論基礎(chǔ)。但是苯醚甲環(huán)唑、氟硅唑乳油、己唑醇懸浮劑和戊菌唑乳油均為三唑類殺菌劑，已有研究表明三唑類殺菌劑為有機(jī)雜環(huán)類化合物，在植物體內(nèi)抑制病菌的附著胞、吸器的正常發(fā)育和阻礙真菌麥角甾醇的生物合成，但作用位點(diǎn)相對(duì)單一，存在潛在的高水平抗性風(fēng)險(xiǎn)[37-39]。而且西沙群島地理位置特殊，大量使用化學(xué)殺菌劑對(duì)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境不利，因此，合理使用高效低毒或配合生物農(nóng)藥進(jìn)行防治是下一步研究的主要方向。

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