離子色譜法測(cè)定巖藻聚糖中L-巖藻糖

陳偉珠，方華，張怡評(píng)，晉文慧，陳曉瑩，洪專

（自然資源部第三海洋研究所，自然資源部海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心，福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建廈門 361005）

巖藻聚糖即巖藻聚糖硫酸酯，是Kylin 于1913年首次從掌狀海帶中提取的，是一類含有L-巖藻糖和硫酸基團(tuán)，并伴有其它單糖（如半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖）的水溶性雜多糖。L-巖藻糖和硫酸根是其主要組成成分，另外，還含有甘露糖、半乳糖、蛋白質(zhì)、木糖、糖醛酸等單糖組成成分。巖藻聚糖具有多種生物活性，包括抗腫瘤、抗凝血、抗病毒、抗炎、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等活性，是一種重要的生物活性物質(zhì)［1–3］。構(gòu)效關(guān)系研究結(jié)果表明，L-巖藻糖是影響巖藻聚糖生物活性的重要組成成分，是巖藻聚糖硫酸酯的重要指標(biāo)性成分。而且L-巖藻糖作為巖藻聚糖的特征單糖，常用于衡量巖藻聚糖的純度。因此，在巖藻聚糖的開發(fā)利用中，需要有準(zhǔn)確、可靠的L-巖藻糖含量測(cè)定方法用于巖藻聚糖的質(zhì)量控制。

L-巖藻糖屬于單糖，沒有紫外可見光吸收，一般采用氣相色譜法［4］、高效液相色譜法［5–7］測(cè)定。氣相色譜法需要將巖藻糖衍生化才能檢測(cè)，步驟繁瑣。高效液相色譜法主要分為兩種：直接測(cè)定法和柱前衍生法。無需衍生的高效液相色譜法是采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)［5–6］或示差折光檢測(cè)器(RID)［7］。示差折光檢測(cè)器對(duì)環(huán)境溫度的穩(wěn)定性要求較高，不適合采用梯度洗脫分析，且靈敏度低。ELSD 靈敏度稍高于RID，但靈敏度仍不理想，且基線噪音大。柱前衍生的高效液相色譜法是利用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、對(duì)氨基苯甲酸(p-AMBA)等衍生劑，通過反應(yīng)使L-巖藻糖分子上增加紫外吸收基團(tuán)，采用紫外檢測(cè)器檢測(cè)［8–12］。但柱前衍生法步驟繁瑣，空白干擾多。

脈沖離子色譜法是近年發(fā)展起來分析糖類物質(zhì)的方法之一［13–15］。使用該方法，樣品不需要衍生便可直接分離測(cè)定單糖，且靈敏度極高。筆者建立了離子色譜法測(cè)定L-巖藻糖的含量，該方法簡(jiǎn)單快速，靈敏度高，適合用于L-巖藻糖的定性、定量檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

離子色譜儀：ICS–4000 型，附帶脈沖安培檢測(cè)器和AgCl 參比電極，美國(guó)戴安公司；

L-巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品：上海美倫生物有限公司；

L-巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：20 mg／mL，精密稱取100 mgL-巖藻糖樣品，用水溶解并定容于5 mL 容量瓶中；

NaOH 溶液：250 mmol／L，美國(guó)賽默飛世爾公司；巖藻多糖樣品：實(shí)驗(yàn)室自制（于海帶中提?。粚?shí)驗(yàn)室用水為蒸餾水。

1.2 L-巖藻糖系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

精密移取不同體積的L-巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用蒸餾水稀釋并定容，配制成質(zhì)量濃度分別為0.11，0.56，2.24，5.60，11.20，22.40，44.80 μg／mL 的L-巖藻糖系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 巖藻多糖樣品溶液的制備

參考文獻(xiàn)［16］，準(zhǔn)確稱取巖藻聚糖樣品10 mg 于10 mL 試管中，加入0.60 mL 濃鹽酸，置于100℃中水解3 h，冷卻至室溫后過濾，再用蒸餾水洗滌濾渣，合并濾液及洗液，用水定容至10 mL。

1.4 色譜條件

保護(hù)柱：CarboPac PA10 柱(50 mm ×4 mm)，美國(guó)戴安公司；分析柱：CarboPac PA10 柱(250 mm×4 mm)，美國(guó)戴安公司；流動(dòng)相：H2O–250 mmol／L NaOH 溶 液（90∶10），流 量 為1.00 mL／min； 柱溫：30 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱

采用離子色譜法檢測(cè)糖類化合物常用糖類分離色譜柱。分別選擇CarboPac PA10 柱（250 mm ×4.0 mm）和CarboPac PA1 柱（250 mm×4.0 mm）作為色譜柱，在流量1.00 mL／min、柱溫30℃和淋洗液H2O–250 mmol／L NaOH 溶液（93∶10）條件下，對(duì)巖藻聚糖水解后各個(gè)組分的分離效果進(jìn)行考察。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)分別使用CarboPac PA10 柱和PA1 柱時(shí)，巖藻多糖水解后的組分均可實(shí)現(xiàn)基線分離（如圖1 所示），而采用PA10 柱時(shí)樣品運(yùn)行時(shí)間較短，故選擇PA10 柱。

圖1 巖藻聚糖水解后的離子色譜圖

2.1.2 淋洗液

在淋洗液流量為0.80 mL／min 和柱溫為30℃條件下，分別選擇H2O 與250 mmol／L NaOH 溶液的體積比為90∶10，95∶5，93∶7 進(jìn)行試驗(yàn)，考察淋洗液組成對(duì)巖藻聚糖水解產(chǎn)物的分離效果。結(jié)果表明3 種配比的淋洗液對(duì)水解后巖藻聚糖樣品均可實(shí)現(xiàn)基線分離，而使用淋洗液H2O–250 mmol／L NaOH 溶液（90∶10）時(shí)樣品運(yùn)行時(shí)間較短，因此選擇該配比的淋洗液。

2.1.3 淋洗液流量

確定淋洗液后，分別設(shè)定流量為0.60，0.80，1.00 mL／min 進(jìn)行試驗(yàn)，考察水解后巖藻聚糖樣品的分離效果。結(jié)果表明，淋洗液流量對(duì)樣品的分離效果基本無影響。當(dāng)淋洗液流量為1.00 mL／min 時(shí)運(yùn)行時(shí)間較短，因此選擇淋洗液流量為1.00 mL／min。

2.1.4 柱溫

分別選擇色譜柱柱溫為30，35，40℃進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明隨著柱溫的提高，運(yùn)行時(shí)間稍微縮短，但分離效果基本無差別。綜合考慮色譜柱的使用效率，最終選擇柱溫為30℃。

2.2 線性關(guān)系

按照1.3 色譜條件，分別測(cè)定L-巖藻糖系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每個(gè)濃度測(cè)定1 次，記錄L-巖藻糖色譜峰面積，以L-巖藻糖系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度X（μg／mL）為自變量、色譜峰面積Y為因變量進(jìn)行線性回歸，得線性方程：Y=1.324 2X+1.656 2，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.992 4，表明L-巖藻糖的質(zhì)量濃度在0.11～44.80 μg／mL 范圍與色譜峰面積線性關(guān)系良好。

2.3 檢出限和定量限

將低濃度L-巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)工作溶液逐級(jí)稀釋后測(cè)定，以信噪比（S／N）為3 對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限，信噪比為10 對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量下限，得本法檢出限為0.05 μg／mL，定量限為0.10 μg／mL。

2.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取巖藻聚糖（L-巖藻糖含量為0.20%）10.00 mg，共6 份，分別加入精密稱定的L-巖藻糖1.00 mg，按照1.2 項(xiàng)進(jìn)行處理，制備樣品溶液，按照1.3 色譜條件進(jìn)行樣品測(cè)定，加標(biāo)樣品色譜圖如圖2所示。利用試驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，試驗(yàn)數(shù)據(jù)列于表1。由表1 可知，樣品加標(biāo)平均回收率為91.79%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.77%，表明該方法的精密度、準(zhǔn)確度良好。

圖2 加標(biāo)樣品色譜圖

表1 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語

建立了巖藻聚糖中L-巖藻糖的離子色譜分析方法，該方法運(yùn)行時(shí)間短，靈敏度高，無需衍生，是測(cè)定巖藻聚糖中L-巖藻糖含量的有效方法。