河北地區(qū)蛋雞源大腸桿菌分子分群、耐藥性及生物被膜檢測(cè)與分析

張召興，李佩國(guó)，張海龍，李蘊(yùn)玉，張香齋，賈青輝，張建文

(1.河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島066600；2.河北旅游職業(yè)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)系，河北 承德 067000)

雞大腸桿菌病是由不同血清型的致病性大腸桿菌所引起的一種局部或全身感染的急性或慢性傳染病。主要表現(xiàn)為急性敗血癥、肝周炎、心包炎、氣囊炎、卵黃腹膜炎等臨床癥狀。該病可以通過呼吸道、消化道、卵等多種途徑傳播，可以感染不同日齡的雞，其發(fā)病率和死亡率均較高，是臨床中常見的細(xì)菌性傳染病之一[1-2]。臨床中雞大腸桿菌常與支原體等病原混合感染，繼發(fā)其他疾病，對(duì)蛋雞養(yǎng)殖的危害很大[3]。雞大腸桿菌擁有多種致病性血清型，不同血清型的菌株無交叉免疫保護(hù)性，目前沒有有效的疫苗對(duì)該病進(jìn)行預(yù)防[4]?？股卦谂R床中的不合理使用，導(dǎo)致大腸桿菌的耐藥性及多重耐藥性十分嚴(yán)重，因此合理使用抗生素，減少其耐藥性產(chǎn)生十分有必要[5]。細(xì)菌生物被膜(biofilm，BF)由附著細(xì)菌細(xì)胞和包裹細(xì)菌的水合性胞外聚合物物質(zhì)組成，BF是組成結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落的主要物質(zhì)，在成熟的外界條件下細(xì)菌均能夠形成BF，BF形成被認(rèn)為是細(xì)菌適應(yīng)惡劣環(huán)境而形成的一種自我保護(hù)模式，BF形成能力與細(xì)菌毒力、耐藥性具有一定相關(guān)性[6-7]。國(guó)內(nèi)關(guān)于蛋雞源大腸桿菌耐藥性與BF形成能力相關(guān)性的報(bào)道相對(duì)較少。因此，本試驗(yàn)以河北地區(qū)臨床分離的120株蛋雞源大腸桿菌分離株為研究對(duì)象，對(duì)其系統(tǒng)進(jìn)化分群、耐藥性及生物被膜形成能力進(jìn)行檢測(cè)，分析其相關(guān)性,為臨床中合理用藥及防控該病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株試驗(yàn)用120株大腸桿菌為2018-2019年在河北省秦皇島、唐山、承德、邢臺(tái)等地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)不同的疑似患大腸桿菌的蛋雞體內(nèi)中分離得到的臨床分離株；大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC25922由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑與儀器大腸桿菌顯色培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；96孔細(xì)菌培養(yǎng)板購自石家莊豐悅生物科技有限公司；2×Taq Marker Mix購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DL2000 DNA Marker購自北京中科瑞泰生物公司；臨床中常用藥物藥敏紙片購自杭州天和微生物制劑有限公司；結(jié)晶紫分析純AR 指示劑由本實(shí)驗(yàn)室提供；高速小型離心機(jī)、梯度PCR儀均購自德國(guó)Eppendorf公司；凝膠成像系統(tǒng)由美國(guó)伯樂公司生產(chǎn)。

1.3 細(xì)菌的復(fù)蘇與擴(kuò)大培養(yǎng)取出-80℃保存的臨床分離的120株蛋雞源大腸桿菌的菌種，室溫解凍，接種劃線于大腸桿菌顯色培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)12～18 h，挑取大腸桿菌顯色培養(yǎng)基生長(zhǎng)的單個(gè)菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中37℃振蕩培養(yǎng)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.4 細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化分群PCR鑒定參考文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化分群引物chuA、yiaA和TspE4.C2(表1)，由上海生工生物工程有限公司合成，用水煮法提取分離菌株的基因組DNA用三重PCR法對(duì)分離菌株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分群鑒定。根據(jù)大腸桿菌分離菌株的chuA、yiaA和TspE4.C2基因攜帶情況，參照文獻(xiàn)[8]中系統(tǒng)進(jìn)化分群鑒定示圖，判定其分離菌株系統(tǒng)進(jìn)化群情況(圖1)。

表1 大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化分群引物序列

1.5 細(xì)菌的耐藥性檢測(cè)用K-B 藥敏紙片法對(duì)分離到的120株大腸桿菌分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并以大腸桿菌 ATCC25922 作為質(zhì)控菌株，參照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的藥敏試驗(yàn)操作方法和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果判斷[9]。

1.6 細(xì)菌的BF形成能力檢測(cè)參考文獻(xiàn)[10]，采用結(jié)晶紫微孔板法對(duì)河北地區(qū)臨床分離到的120株蛋雞源大腸桿菌分離株進(jìn)行BF形成能力測(cè)定。判定標(biāo)準(zhǔn):以陰性對(duì)照孔D值的2倍作為判斷能否形成BF的臨界點(diǎn)Dc，當(dāng)D≤Dc 時(shí)，表示BF形成 能力為零；當(dāng)Dc

1.7 數(shù)據(jù)相關(guān)性分析采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0，分析河北地區(qū)分離的120株大腸桿菌耐藥性與BF形成能力表型之間的相關(guān)性，計(jì)算其符合率。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化分群結(jié)果河北地區(qū)臨床分離到的120株蛋雞源大腸桿菌分離株能擴(kuò)增出chuA、yiaA和TspE4.C2目的基因的條帶(圖1)。經(jīng)結(jié)果判定分析，分離的120株大腸桿菌中，A群9株，占分離菌株的7.5%；B1群24株，占分離菌株的20%；B2群64株，占分離菌株的53.3%；D群23株，占分離菌株的27.5%；A+B1 群33株，占分離菌株的27.5%；B2+D 群，87株，占分離菌株的72.5%(表2)。

2.2 細(xì)菌的耐藥性檢測(cè)由表2可知，河北地區(qū)分離的120株大腸桿菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林、頭孢曲松、多西環(huán)素、林可霉素、磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星、環(huán)丙沙星8種藥物耐藥率為45.8%～93.3%；對(duì)頭孢噻呋、慶大霉素、鏈霉素、大觀霉素、氟苯尼考、替米考星6種藥物耐藥率為15.0%～43.3%； B2+D群的大腸桿菌分離株對(duì)氨芐西林、阿莫西林、頭孢曲松、頭孢噻呋、大觀霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考、替米考星、林可霉素、磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星、環(huán)丙沙星的耐藥率均高于A+B1群大腸桿的耐藥率，A+B1群大腸桿分離株對(duì)慶大霉素、鏈霉素的耐藥率高于B2+D群大腸桿菌分離株的耐藥率。

圖1 大腸桿菌部分分離菌株系統(tǒng)進(jìn)化分群PCR鑒定結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker; 1～14.分離菌株;15.空白對(duì)照

表2 大腸桿菌分離株耐藥性及系統(tǒng)進(jìn)化分群相關(guān)性分析結(jié)果 %

2.3 BF形成能力檢測(cè)結(jié)果由表3可知，河北地區(qū)分離的120株大腸桿菌中111株能形成BF，占分離菌株的92.5%(111/120)。其中，強(qiáng)形成膜能力菌株有58株、中形成膜能力菌株有29株、弱形成膜能力菌株有24株、不形成BF菌株的有9株，分別占分離菌株的48.3%，24.3%，20.0%和7.5%；BF形成能力強(qiáng)的多屬于B2群和D群大腸桿菌分離株，分別占各群的50.0%和82.6%，BF形成能力中的多屬于B2群和D群大腸桿菌分離株，分別占各群的26.6%和26.1%，BF形成能力弱的多屬于A1群和B1群大腸桿菌分離株，分別占各群的44.4%和45.8%。

表3 大腸桿菌分離株BF形成能力及系統(tǒng)進(jìn)化分群相關(guān)性分析結(jié)果 %

2.4 BF形成能力與耐藥性相關(guān)性分析由表4可知，BF形成能力與耐藥性相關(guān)性分析結(jié)果顯示，分離的120株大腸桿菌BF形成能力與阿莫西林、頭孢曲松、頭孢噻呋、鏈霉素、大觀霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考、林可霉素、磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星10種抗生素的耐藥性符合率為91.5%～96.1%，分離的120株大腸桿菌BF形成能力與環(huán)丙沙星、慶大霉素、替米考星、氨芐西林4種生素的耐藥性符合率為73.7%～89.3%。

3 討論

大腸桿菌病在雞養(yǎng)殖中常見且多發(fā)，可以引起急性敗血癥、氣囊炎、肝周炎、心包炎、腸炎、卵黃腹膜炎等一系列的病癥，能引起不同日齡的雞發(fā)病，尤其對(duì)雛雞和產(chǎn)蛋雞危害較嚴(yán)重，給養(yǎng)雞業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。本試驗(yàn)從2018-2019年秦皇島、唐山、承德、邢臺(tái)等河北地區(qū)不同雞養(yǎng)殖場(chǎng)中，采集急性死亡、腹瀉的雛雞、卵黃腹膜炎產(chǎn)蛋雞等疑似患大腸桿菌病病料組織，進(jìn)行大腸桿菌分離鑒定。對(duì)分離的大腸桿菌人工感染1日齡的雛雞驗(yàn)證其致病性，分離得到120株大腸桿菌臨床分離株。因此，對(duì)秦皇島、唐山、承德、邢臺(tái)等河北地區(qū)分離的蛋雞源大腸桿菌進(jìn)行分子分群、耐藥性及生物被膜形成能力等主要生物學(xué)特性鑒定，并分析其相關(guān)性。

雞大腸桿菌分離菌株可以依據(jù)種系發(fā)育群、生物表型、抗原特性等屬性進(jìn)行區(qū)分其分子分群、血清型、生物膜等生物學(xué)特性[2-4]。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明，大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化分群可分為A、B1、B2和D共4個(gè)群，其中B2和D群被認(rèn)為是主要的致病群，腸外致病性大腸桿菌多屬于B2群和D群，A群和B1群多屬于腸內(nèi)和共生型大腸桿菌[7,11-12]。JOSE等[11]報(bào)道，人尿路感染感染的大腸桿菌51%屬于B2群，20%屬于D群，均高于A群和B1群。WANG等[12]報(bào)道，腸外大腸桿菌感染的病例中以B2群流行為主，B2群的大腸桿菌的毒力高于其他群的分離菌株。本試驗(yàn)結(jié)果表明，分離到的120株大腸桿菌中A群9株(7.5%)、B1群24株(20%)、B2群64株(53.3%)、D群23株(27.5%)，以B2+D 群流行為主，與ZHU等[13]報(bào)道的禽致病性大腸桿菌B2群為主基本一致，因而說明了B2+D群大腸桿菌對(duì)蛋雞具有潛在的危害。

大腸桿菌具有易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，其耐藥性的產(chǎn)生不僅與抗菌藥物使用有關(guān)，還與耐藥機(jī)制有關(guān)，其耐藥性可以通過質(zhì)粒在不同菌株之間傳播，引起多重耐藥菌株不斷的產(chǎn)生[3-5]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，120株大腸桿菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林、頭孢曲松等8種藥物的耐藥率為45.8%～93.3%，與其他藥物的耐藥率為15.0%～43.3%，說明分離到的蛋雞源大腸桿菌耐藥性很嚴(yán)重。賈青輝等[14]報(bào)道，2013-2016年河北地區(qū)分離到的104株蛋雞源大腸桿菌對(duì)20種抗菌藥物呈現(xiàn)出多重耐藥性，其中耐11～14種抗生素最多。于靜晨等[2]報(bào)道，江蘇、安徽等地分離到的53株禽致病性大腸桿菌對(duì)環(huán)丙沙星、氨芐西林、多西環(huán)素的耐藥率較高。余蕊等[15]報(bào)道，江蘇省揚(yáng)州地區(qū)的禽源大腸桿菌對(duì)臨床上常用的抗生素耐藥性都較高。這些試驗(yàn)結(jié)果表明，雞源大腸桿菌耐藥性現(xiàn)象很普遍，由于不同地區(qū)大腸菌株的臨床用藥及遺傳特性的差異，導(dǎo)致其耐藥性及耐藥種類有所差異。本試驗(yàn)結(jié)果表明，B2+D群大腸桿菌分離株對(duì)氨芐西林、阿莫西林、頭孢曲松等12種藥物的耐藥率均高于A+B1群，且耐藥性與系統(tǒng)進(jìn)化分群存在一定相關(guān)性。與李金朋等[7]報(bào)道具有一定的差異性，這可能與其感染的宿主(豬)及地區(qū)有關(guān)。

BF的形成可增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)外界抗菌藥物的抵抗能力，大腸桿菌BF的形成能力與其耐藥性具有一定相關(guān)性[16]。李金朋等[7]報(bào)道，BF形成能增加大腸桿菌的耐藥性。夏琦琦等[10]報(bào)道，水貂腸道致病性大腸桿菌BF形成能力與耐藥性之間具有相關(guān)性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，120株大腸桿菌BF形成能力與14種抗生素耐藥性的符合率在73.7%以上，說明大腸桿菌的BF形成能力與其產(chǎn)生的耐藥性有關(guān)，但BF形成能力增強(qiáng)細(xì)菌耐藥性的機(jī)理尚未明確，有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)對(duì)河北地區(qū)的蛋雞大腸桿菌分子分群、耐藥性及BF形成能力進(jìn)行研究分析，為了解河北地區(qū)蛋雞大腸桿菌的主要生物學(xué)特性及防控提供試驗(yàn)依據(jù)。