秋水仙素對(duì)菊苣多倍體的誘導(dǎo)

趙建華 任國輝 鄭金雙

摘要：利用不同質(zhì)量濃度秋水仙素溶液對(duì)菊苣生長點(diǎn)進(jìn)行不同次數(shù)的誘變處理。通過觀察氣孔特征、測(cè)定DNA相對(duì)含量進(jìn)行誘變植株篩選鑒定，確定其倍性水平。結(jié)果表明，0.2%秋水仙素處理4次，菊苣誘導(dǎo)率最高，為8.16%，獲得8株菊苣同源四倍體植株，與二倍體對(duì)照相比，變異植株葉片增厚，葉色加深，葉片褶皺，下表皮氣孔變大，保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量增加，葉綠素含量增加，單位面積氣孔數(shù)目減少。本試驗(yàn)共獲得23株變異植株，其中22株同源四倍體，1株混倍體，構(gòu)建了菊苣多倍體誘導(dǎo)技術(shù)體系，獲得了菊苣多倍體新種質(zhì)，豐富了菊苣遺傳基礎(chǔ)，為良種選育提供了材料。

關(guān)鍵詞：菊苣;秋水仙素;誘導(dǎo);同源四倍體

中圖分類號(hào)：S567.23+9.035.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）16-0177-06

菊苣（Cichorium intybus L.）為菊科菊苣屬多年生草本植物，營養(yǎng)價(jià)值高，抗逆性強(qiáng)。以干燥地上部分及根入藥，味微苦、咸，具有清肝利膽、健胃消食、利尿消腫等功效[1]。菊苣葉片柔嫩多汁，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，研究表明，其葉叢期含粗蛋白22.87%，初花期含粗蛋白14.73%、粗脂肪2.1%、粗纖維30.6%，被稱為綠色健康之王[2]。目前，國內(nèi)關(guān)于菊苣的研究多集中于栽培技術(shù)[3-4]、活性成分測(cè)定及提取物的藥理作用[5-6]等方面，而對(duì)于菊苣遺傳育種方面的研究較少，張玉等利用60CO-r輻照菊苣種子發(fā)現(xiàn)，高劑量輻照對(duì)菊苣誘變效果明顯[7]，但誘變是正向還是逆向則需進(jìn)一步在農(nóng)藝性狀方面作深入研究。

多倍體植物大多表現(xiàn)為營養(yǎng)器官的“巨大性”，具有生長健壯、抗逆性增強(qiáng)、果實(shí)增大以及營養(yǎng)物質(zhì)含量提高等優(yōu)點(diǎn)，因此多倍體誘變育種已成為植物育種的重要方式，目前已在大田作物、蔬菜作物、觀賞植物、藥用植物育種方面得到廣泛應(yīng)用。隗志松等研究發(fā)現(xiàn)，多倍體水稻植株高大粗壯，穗大粒大，稻米質(zhì)優(yōu)，抗逆性強(qiáng)[8]。茆吉健利用秋水仙素誘變處理獲得四倍體蘿卜，產(chǎn)量較二倍體增加26.92%，并且根內(nèi)可溶性蛋白和可溶性糖等營養(yǎng)成分較二倍體植株顯著增加[9]。宋蓮等利用秋水仙素對(duì)墨蘭×大花蕙蘭的F1進(jìn)行誘變處理，獲得的多倍體植株觀賞價(jià)值高和抗逆性強(qiáng)[10]。王鳳寶等采用秋水仙素浸泡枸杞干種子，獲得了對(duì)癭螨免疫，高抗白粉病和根腐病，營養(yǎng)品質(zhì)和藥用成分（甜菜堿、枸杞多糖、黃酮類）顯著高于二倍體對(duì)照的多倍體新種質(zhì)[11]。

本試驗(yàn)采用不同質(zhì)量濃度的秋水仙素溶液對(duì)子葉期菊苣進(jìn)行不同次數(shù)的誘變處理，以期構(gòu)建菊苣多倍體誘導(dǎo)技術(shù)新體系，豐富菊苣種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菊苣（Cichorium intybus L.）種子，購于承德興春和農(nóng)業(yè)集團(tuán)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，2因素（不同秋水仙素濃度）3水平（不同處理次數(shù)）處理。

第1次誘變處理于2017年10月初進(jìn)行。將菊苣種子直播于50孔育苗穴盤中，置于棚中育苗，待菊苣2張子葉完全展開后，將棉球置于兩子葉中間的生長點(diǎn)處，利用不同質(zhì)量濃度秋水仙素（0.05%、0.10%、0.20%）分別于06：00—07：00和17：00—18：00處理3、5、7次。以蒸餾水處理為對(duì)照，每個(gè)處理50株，2次重復(fù)，待所有處理結(jié)束后，摘去棉球，繼續(xù)育苗。

第2次誘變處理于2018年3月中旬，第3次于10月初在智能日光溫室中進(jìn)行試驗(yàn)。處理方法同第1次處理，利用0.1%和0.2%秋水仙素溶液分別處理不同次數(shù)（4、6、8次），每個(gè)處理50株，3次重復(fù)。

1.3 多倍體植株的篩選與鑒定

1.3.1 氣孔鑒定 當(dāng)植株有完全展開的3張葉時(shí)，取二倍體和誘變植株完全展開的葉片，用鑷子撕取下表皮，置于滴有1滴蒸餾水的載玻片上，蓋片，趕出氣泡，吸去多余水，于Olympus BX53光學(xué)顯微鏡下觀察，20×鏡下選取10個(gè)視野，觀察氣孔大小、單位面積氣孔數(shù)目并記錄，篩選氣孔變異的植株為候選植株。

氣孔變異植株比例=氣孔鑒定變異株數(shù)/處理株數(shù)×100%。

1.3.2 DNA相對(duì)含量鑒定 利用流式細(xì)胞儀鑒定氣孔以獲得候選植株進(jìn)行NDA相對(duì)含量鑒定，剪取二倍體和誘變植株完全展開的幼嫩葉片，放入裝有500 μL裂解液的預(yù)冷培養(yǎng)皿中，刀片快速切碎，用260～560目的尼龍網(wǎng)過濾到離心管中，放置于冰中 5 min，加入100 μL PI染色液，于冰上避光染色 12 min，染色后移至上樣管中，利用BD LSR FortessaTM流式細(xì)胞儀檢測(cè)，確定其倍性水平，并對(duì)獲得的變異植株編號(hào)，T表示同源四倍體（T-1至 T-22），H表示混倍體（H-1）。

根據(jù)秋水仙素處理后成活株數(shù)計(jì)算致死率，依據(jù)上述鑒定方法獲得的變異株數(shù)計(jì)算誘導(dǎo)率。

致死率=死亡株數(shù)/處理幼苗總數(shù)×100%;

誘導(dǎo)率=變異株數(shù)/處理幼苗總數(shù)×100%

1.4 二倍體與變異植株的比較

1.4.1 葉片大小及厚度的測(cè)量 在植株有5張完全展開葉時(shí)，取二倍體與變異植株的完全展開葉，用直尺測(cè)量葉長和葉寬，再利用打孔器取中葉脈兩側(cè)的葉片，用游標(biāo)卡尺測(cè)量10張小葉片的厚度。

1.4.2 氣孔大小的比較 取二倍體和變異植株完全展開的葉片，利用氣孔鑒定的制片方法，在顯微鏡下觀察，40×鏡下選取5個(gè)視野，測(cè)量氣孔的長和寬，記錄氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)目。

1.4.3 葉綠素含量測(cè)定 稱取0.2 g成熟葉片放入研缽中，加入95%乙醇研成勻漿，移至10 mL容量瓶中定容，3 000 r/min離心5 min，取上清液，加95%乙醇稀釋，利用分光光度計(jì)于662、644 nm下比色，記錄吸光度D值并計(jì)算葉綠素含量。

葉綠素含量（mg/L）=5.13×D662 nm+20.44×D644 nm;葉綠素相對(duì)含量（mg/g）=葉綠素濃度（mg/L）×葉綠素溶液體積（mL）/葉片質(zhì)量（g）×1 000。

2.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel表格和DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 秋水仙素誘導(dǎo)條件篩選

由表1可知，在第1次誘變中，植株變異率最高為31.00%（0.20%秋水仙素處理7次），最低為13.00%（0.05%秋水仙素處理3次）。由于棚中高溫低濕的條件不利于幼苗生長，導(dǎo)致幼苗死亡率極高，隨著秋水仙素濃度的增加，致死率逐漸升高，0.20%秋水仙素處理7次致死率最高，為100%，0.05%秋水仙素處理3次致死率最低，為87.00%。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，0.05%秋水仙素處理生長點(diǎn)后植株形態(tài)變異數(shù)量最少;不同質(zhì)量濃度處理3次時(shí)，植株形態(tài)變異數(shù)量均少于其他處理次數(shù)。因此，秋水仙素濃度為0.05%，處理次數(shù)為3次時(shí)，均不適合作為秋水仙素誘導(dǎo)菊苣多倍體的處理?xiàng)l件。

與第1次誘變處理相比發(fā)現(xiàn)，第2次誘變處理的植株形態(tài)變異的株數(shù)較多，變異率增加。形態(tài)鑒定結(jié)果表明，0.20%秋水仙素處理8次，變異率最高，為49.67%，0.10%秋水仙素處理4次，變異率最低，為35.33%。0.20%秋水仙素處理6次、8次致死率最高，均為31.67%;0.10%秋水仙素處理4次致死率最低，為13.67%。DNA相對(duì)含量鑒定共獲得16株變異植株，誘導(dǎo)率最高為5.33%（0.20%秋水仙素處理4次），誘導(dǎo)率最低為1.67%（0.10%秋水仙素處理6次、0.20%秋水仙素處理8次）。移栽至智能日光溫室后，高溫低濕的條件導(dǎo)致病蟲害發(fā)生嚴(yán)重，變異植株死亡率極高。

3.2 秋水仙素對(duì)菊苣誘變效果的影響

由表2可知，不同質(zhì)量濃度的秋水仙素和不同次數(shù)處理之間相比較，隨著濃度和處理次數(shù)的增加，誘導(dǎo)率和致死率均呈增加趨勢(shì)。氣孔鑒定的結(jié)果表明，0.2%秋水仙素處理4次和6次變異率較高，分別為8.00%和6.67%，與其他處理相比差異顯著。0.1%秋水仙素處理6次致死率最低，為1.00%;0.2%秋水仙素處理8次致死率最高，為10.26%。DNA相對(duì)含量鑒定結(jié)果表明，0.2%秋水仙素處理4次和6次誘導(dǎo)率較高，分別為8.16%（8株）和7.14%（7株），與其他處理相比差異顯著;0.1%秋水仙素處理4次誘導(dǎo)率最低，為0.99%（1株）。

利用流式細(xì)胞儀對(duì)不同倍性的菊苣進(jìn)行鑒定（圖1），橫軸為熒光強(qiáng)度值，縱坐標(biāo)為細(xì)胞核數(shù)量，不同倍性菊苣的熒光強(qiáng)度峰值不同。二倍體熒光強(qiáng)度值為50時(shí)，細(xì)胞核數(shù)量達(dá)到最大值;四倍體熒光強(qiáng)度值為100時(shí)，細(xì)胞核數(shù)量達(dá)到最大值;混倍體在熒光強(qiáng)度值為50和100時(shí)，均出現(xiàn)峰值。

3.3 二倍體與多倍體菊苣的比較

3.3.1 葉片特征、氣孔特征及葉綠素含量比較 變異植株的葉色加深，葉片褶皺（圖2-A）;四倍體氣孔增大，單位面積氣孔數(shù)目減少，混倍體氣孔大小不一（圖2-B、圖2-C、圖2-D）。由表3可知，變異植株的葉長和葉寬均顯著低于二倍體植株。所有四倍體植株的葉厚均大于二倍體植株，其中 T-1、T-2、T-5、T-6、T-7、T-13、T-19、T-20和H-1與對(duì)照相比差異不顯著。所有變異植株的葉綠素含量均顯著高于二倍體植株，不同變異植株間葉綠素含量差異較大，其中T-6、T-7、T-10、T-12、T-16和 H-1葉綠素含量較高。

3.3.2 菊苣氣孔大小、單位面積氣孔數(shù)目及葉綠體數(shù)目的比較 由表4可知，變異植株（除F5、H-1）的氣孔長度顯著大于二倍體植株，其中T-5與二倍體差異不顯著;變異植株氣孔寬度均小于二倍體植株，其中T-22與二倍體差異不顯著。變異植株葉片下表皮單位面積氣孔數(shù)目與二倍體相比減少19.78%～88.39%，與二倍體植株存在顯著差異。四倍體植株葉片下表皮保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)目顯著的多于二倍體植株，增加了12.05%～32.53%，但混倍體植株與二倍體植株差異不顯著。

變異植株之間單位面積氣孔數(shù)目差異不顯著，其中T-10、T-14、T-17、T-18、T-20、T-21和H-1的單位面積氣孔數(shù)目;T-2和T-3單位面積氣孔數(shù)目較多。

4 結(jié)論與討論

秋水仙素是人工誘導(dǎo)植物多倍體常用的藥劑，在細(xì)胞有絲分裂期間通過抑制紡錘體的形成從而實(shí)現(xiàn)染色體的數(shù)目加倍[12-13]，但高濃度的秋水仙素可以致使材料的生長受到抑制或死亡。殷婷婷利用不同濃度秋水仙素和通過不同處理時(shí)間以誘導(dǎo)油菜種子，發(fā)現(xiàn)0.4%秋水仙素處理48 h時(shí)死亡率最高為63%[14]。彭綠春等利用不同濃度秋水仙素和不同時(shí)間浸泡腋花杜鵑無菌苗，發(fā)現(xiàn)秋水仙素濃度為0.25%處理72 h死亡率最高為60%[15]。孫嘉曼等采用不同濃度秋水仙素對(duì)野生蕉愈傷組織進(jìn)行不同時(shí)間誘變處理，以0.2%濃度處理15 d時(shí)致死率最高，為43.62%[16]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)秋水仙素濃度越高，處理次數(shù)越多，幼苗致死率越高，其中0.2%秋水仙素處理8次時(shí)，致死率最高，為10.26%。

篩選最佳的秋水仙素濃度和處理時(shí)間，是獲得多倍體植物的關(guān)鍵因素?？拙S一等采用秋水仙素處理一串紅幼苗莖尖，發(fā)現(xiàn)0.1%秋水仙素處理2 d時(shí)誘變率最高，為13.3%[17]。吳照云等利用秋水仙素處理胭脂蘿卜幼苗生長點(diǎn)，表明以2 g/L秋水仙素誘變率最大，為33.3%[18]。鄧云等采用秋水仙素處理二倍體不結(jié)球白菜，表明以0.1 mol/L秋水仙素處理6次效果最好，誘導(dǎo)率達(dá)17.5%[19]。本研究以不同質(zhì)量濃度秋水仙素處理不同次數(shù)來誘導(dǎo)菊苣幼苗生長點(diǎn)，結(jié)果表明，0.2%秋水仙素處理4次菊苣誘變效果最好，誘導(dǎo)率為8.16%。

同源四倍體植株葉片厚度、氣孔大小、葉綠素含量、保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)均高于二倍體植株，而氣孔密度低于二倍體植株[20]。漆慧娟比較不同倍性的甜葉菊發(fā)現(xiàn)，四倍體植株氣孔密度比二倍體減少49.16%，保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)較二倍體增多78.49%，氣孔長和寬比二倍體分別增加72.25%和69.25%，葉綠素含量也顯著高于二倍體[21]。鐘程等比較不同倍性水平貴州野生淡黃花百合，發(fā)現(xiàn)四倍體植株氣孔比二倍體明顯增大，單位面積氣孔數(shù)目減少，且氣孔長寬及單位面積氣孔數(shù)均達(dá)到極顯著水平[22]。吳順等比較不同倍性水平的紫花丹參，發(fā)現(xiàn)多倍體葉綠素含量比二倍體提高近75%[23]。本研究中，菊苣變異植株葉片下表皮單位面積氣孔數(shù)較二倍體減少11.61%～55.22%，葉綠素含量比二倍體提高近23.46%，四倍體保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)較二倍體增加84.56%，葉片厚度及氣孔大小均與二倍體存在顯著差異。

本試驗(yàn)得到的變異植株，其葉長和葉寬顯著低于二倍體，其原因可能是秋水仙素的毒害作用，使菊苣F1植株生長緩慢，葉片褶皺，葉面積減小，若收獲四倍體植株的種子后繼續(xù)種植，其葉面積可能增大。

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