食源性單核細胞增生型李斯特菌lmoF2365_0032基因克隆及序列分析

劉揚揚 馬勛 康立超 李紅歡 錢凌霄 江婉琳 阮婷玉

摘要：對食源性單核細胞增生李斯特菌LM5567的lmoF2365_0032基因進行克隆和序列分析，利用PCR方法對lmoF2365_0032基因進行擴增，將擴增產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，篩選陽性菌株進行測序比對分析。結(jié)果顯示，擴增獲得的lmoF2365_0032基因序列長度為811 bp，克隆得到lmoF2365_0032基因的陽性轉(zhuǎn)化子;生物信息學(xué)分析表明，lmoF 2365_0032蛋白屬于跨膜蛋白，無信號肽序列;二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲和延伸鏈結(jié)構(gòu)占比較大，分別是37.86%和36.89%;序列比對結(jié)果表明，LM5567菌株lmoF2365_0032基因的核苷酸序列與02-6680菌株（4b，奶酪，加拿大）、10-0811菌株（1/2b，螃蟹，加拿大）的相似性均為99.7%;與10-0809菌株（4b，糞便，加拿大）、81-055菌株（4b，腦脊髓液，加拿大）、02-1103菌株、02-1792菌株（4b，奶酪，加拿大）、81-0861菌株（4b，卷心菜，加拿大）的相似性均為99.8%;LM5567 lmoF 2365_0032基因編碼的氨基酸序列與上述菌株相似性均為94.7%。試驗成功克隆了lmoF 2365_0032基因，可為進一步探究lmoF2365_0032基因功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：食源性單核細胞增多李斯特菌;lmoF2365_0032基因;PCR;生物信息學(xué)分析

中圖分類號：S852.61

文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）16-0074-05

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocy-togenes，LM）是重要的食源性人獸共患李斯特菌病的胞內(nèi)寄生菌，與大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌并稱為世界四大食源性致病菌[1-2]。LM可突破宿主的腸道屏障、血腦屏障和血胎屏障，臨床上引起人和多種動物的腦炎、腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)及發(fā)熱性胃腸炎等[3]。李斯特菌病具有較高的死亡率，免疫功能不全者、孕婦、新生兒及胎兒都是李斯特菌病的易感群體，該病在動物中主要見于牛、羊、駱駝等反芻動物[4-5]。因此，它對公共安全和畜牧業(yè)發(fā)展危害極大。

LM基因組中存在多個毒力因子基因簇，這些基因簇編碼的蛋白在感染機體過程中發(fā)揮著重要作用。arc基因由4部分組成，分別是arcA、arcB、arcC和arcD，它們分別編碼精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)（arginine deiminase system，ADS）中的精氨酸脫亞氨酶（ADI）、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲基酶（OTC）、氨甲酸激酶（CK）和精氨酸鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運體[6]。arc基因編碼的蛋白在LM調(diào)節(jié)酸平衡中發(fā)揮重要作用，2016年Maury等對104株不同來源的代表性LM菌株進行全基因組序列分析，挖掘出15個高毒力分離株具備而參考菌株不具備的假定毒力因子基因/基因簇，其中包括精氨酸鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運體基因，但是與以往研究結(jié)果不同的是，編碼精氨酸鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運體的基因除了arcD外，還有3個未知功能的基因，其中就包括lmoF2365_0032基因[7]。為此，對筆者所在實驗室保存的LM進行了檢測，發(fā)現(xiàn)54株食源性單核細胞增生李斯特菌中只有19株可以檢測到lmoF 2365_0032基因。arc基因編碼的未知功能的蛋白是否與精氨酸代謝、抗酸應(yīng)激以及毒力有關(guān)，目前尚不清楚。

本試驗克隆分析編碼精氨酸/鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運體的lmoF2365_0032基因，并對其進行生物信息學(xué)分析，旨在為進一步探究食源性單核細胞增生李斯特菌精氨酸鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運體基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 單核細胞增生李斯特菌LM5567菌株分離自新疆農(nóng)墾科學(xué)院;大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 PCR Mix、ddH2O、DL 2 000 DNA Marker，均購自廣州東盛生物科技有限公司;腦心浸液培養(yǎng)基（BHI），購自青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司;LB培養(yǎng)基，購自青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司;PCR儀（Bio-Rad MyCycler thermal）;電泳系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD-2000），購自美國Bio-Rad公司。

1.1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)文獻[4]中提供的Gene （Locus tag），運用Primer 5.0軟件自行設(shè)計編碼LM5567菌株精氨酸鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白的lmoF2365_0032基因的特異性引物，引物序列為5′-TTTGGACCGACTTGATTG-3′（F）、5′-ACCCACAAATGCGATAGA-3′（R），預(yù)期擴增片段長度為811 bp，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)和基因組DNA的提取 將LM5567菌株從-80 ℃保存條件下取出，接種于BHI平板上，37 ℃ 培養(yǎng)16～18 h，挑取單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)16～18 h，采用 1.5 mL 試管收集菌體，參考細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取LM5567菌株的全基因組DNA，于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR檢測 PCR擴增體系：模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×PCR Mix 10 μL，加ddH2O至體積20 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性40 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1 min，72 ℃再延伸10 min，共30個循環(huán);4 ℃保存60 min。

1.2.3 PCR擴增產(chǎn)物的檢測 PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測：瓊脂糖凝膠加溴化乙錠（EB）染色，將 10 μL PCR擴增產(chǎn)物及DL 2 000 marker上樣后進行電泳，電壓為150 V，電流為 50 mA，25 min后在凝膠成像儀下觀察電泳結(jié)果。

1.2.4 目的基因克隆及測序 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，純化回收目的條帶，將回收產(chǎn)物與pMD19-T載體過夜連接，采用冷熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，涂布于含Ampr（100 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng) 12～16 h。篩選出陽性克隆菌，將鑒定的陽性克隆菌送北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 利用ProtParam軟件（http：//web.expasy.org/ protparam/）分析基因序列的基本理化性質(zhì)，利用SignalP 4.1 Server軟件（http：//www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/）預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽;利用TMHMM軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/）在線分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu);利用SOPMA軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi- bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL軟件（http：//swissmodel.expasy.org/）分別預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 lmoF2365_0032基因PCR擴增和克隆測序

利用特異性引物擴增lmoF2365_0032基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在811 bp處有單一清晰條帶，與lmoF2365_0032基因擴增產(chǎn)物預(yù)期大小一致（圖1）。經(jīng)克隆轉(zhuǎn)化后，將驗證為陽性菌的質(zhì)粒提取物送至北京六合華大基因科技有限公司測序，經(jīng)測序進一步驗證，成功獲得序列長度為811 bp的lmoF2365_0032基因陽性轉(zhuǎn)化子。

2.2 lmoF2365_0032編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

利用ExPASY在線軟件中編碼ProtParam工具分析LM5567 lmoF2365_0032基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，得出該蛋白理論等電點為8.51，分子量為 22 973.62，原子組成是C1 050H1 685N253O314S3，脂肪系數(shù)是101.75，總疏水性平均數(shù)是-0.124，負電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）22個，正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）24個，不穩(wěn)定系數(shù)是23.31（<40為穩(wěn)定蛋白），屬于穩(wěn)定蛋白。

2.3 lmoF2365_0032編碼蛋白信號肽和跨膜區(qū)分析

利用SignalP 4.1 Server軟件（http：//www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/）預(yù)測lmoF2365_0032蛋白質(zhì)的信號肽，結(jié)果（圖2）表明，lmoF2365_0032蛋白無信號肽，屬于非分泌蛋白。利用TMHMM軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/）分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖3）顯示，lmoF2365_0032為跨膜蛋白，跨膜區(qū)位于7～29氨基酸處。

2.4 lmoF2365_0032基因核苷酸序列同源性比對

將測序得到的結(jié)果進行序列拼接，得到LM5567菌株的lmoF2365_0032基因的核苷酸序列，將其與GenBank上公布的6株不同來源的lmoF2365_0032基因的核苷酸序列進行同源性比對，結(jié)果（圖4）顯示，LM5567菌株的lmoF2365_0032基因的核苷酸序列與02-6680菌株（4b，奶酪，加拿大）、10-0811菌株（1/2b，螃蟹，加拿大）相似性均為99.7%;與10-0809菌株（4b，糞便，加拿大）、81-055株（4b，腦脊髓液，加拿大）、02-1103菌株、02-1792菌株（4b，奶酪，加拿大）、81-0861菌株（4b，卷心菜，加拿大）的相似性為99.8%。

2.5 lmoF2365_0032基因序列編碼氨基酸同源性比對

利用DNSstar軟件推導(dǎo)出的LM5567菌株lmoF2365_0032基因編碼的氨基酸序列與GenBank上公布的6株不同來源的lmoF2365_0032基因編碼的氨基酸序列進行同源性比對，結(jié)果（圖5）顯示，LM5567菌株lmoF 2365_0032基因編碼的氨基酸序列與02-6680菌株（4b，奶酪，加拿大）、10-0811菌株（1/2b，螃蟹，加拿大）、10-0809菌株（4b，糞便，加拿大）、81-055菌株（4b，腦脊髓液，加拿大）、02-1103菌株、02-1792菌株（4b，奶酪，加拿大）、81-0861菌株（4b，卷心菜，加拿大）的相似性均為94.7%。

2.6 lmoF2365_0032蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過SOPMA軟件對LM5567菌株lmoF2365_0032蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)，lmoF2365_0032蛋白的二級結(jié)構(gòu)包含15.53%的α-螺旋（含32個氨基酸），37.86%的無規(guī)則卷曲（含

78個氨基酸），36.89%的延伸鏈結(jié)構(gòu)（含76個氨基酸）和9.71%的β-轉(zhuǎn)角（含20個氨基酸）（圖6）。通過SWISS-MODEL分析平臺預(yù)測該蛋白的三級結(jié)構(gòu)（圖7），進一步驗證了二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。

3 討論

單核細胞增生李斯特菌廣泛存于自然界、食品加工各環(huán)節(jié)，能夠耐受高鹽、高滲、高溫、酸性和堿性環(huán)境。其中，在酸性環(huán)境中的存活尤為關(guān)鍵，LM經(jīng)污染的飼草料和食品等進入人和動物機體后，首先遭遇的就是胃腸道的低pH值環(huán)境，被巨噬細胞吞噬后，吞噬體內(nèi)也有一個酸化過程，過酸環(huán)境不利于該細菌的存活，因此單核細胞增生李斯特菌必須具備有效維持pH值平衡的機制，以保證其在酸性環(huán)境中存活[8]。arc基因編碼的精氨酸脫亞胺基酶系統(tǒng)（ADS）中的蛋白在LM調(diào)節(jié)酸平衡中發(fā)揮重要作用[9]。lmoF2365_0032基因是編碼精氨酸鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白的基因之一，因此推測其有助于細菌在酸性條件下存活。

ADS存在于革蘭陽性菌和革蘭陰性菌中。ADS作用的發(fā)揮需要一個轉(zhuǎn)運蛋白和3個酶，首先由arcD編碼的精氨酸鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白從細胞外攝取精氨酸進入細胞內(nèi)，接著由arcA編碼的精氨酸脫亞氨酶（ADI）將精氨酸分解為鳥氨酸和氨，鳥氨酸在arcB編碼的鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲?；傅淖饔孟律渗B苷和氨甲酰磷酸鹽，然后由arcC編碼的氨甲酸激酶將氨甲酰磷酸鹽的磷酸基團轉(zhuǎn)移給二磷酸腺苷（ADP）產(chǎn)生能量腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）[10]。由此可見，一方面細菌可通過ADS攝取胞外的精氨酸產(chǎn)生ATP，促進細菌生長繁殖，另一方面當細菌處于酸性環(huán)境時，ADS產(chǎn)生的氨可與細胞質(zhì)中的氫離子結(jié)合為銨離子，從而提高細胞質(zhì)中的pH值，在一定程度上減輕酸應(yīng)激的傷害。

ADS除了在抗酸應(yīng)激中發(fā)揮重要作用外，在許多細菌的致病性中也具有重要作用。Evans等的沙門菌生長動力學(xué)試驗表明，arcA參與鞭毛的生物合成、趨化因子的基因表達調(diào)控[11]。Ma等在禽大腸桿菌（APEC）雛鴨模型中發(fā)現(xiàn)，APEC野毒株致死率高于arcA缺失株;與野毒株相比，arcA缺失株腦組織的載菌量大幅度下降，說明arcA基因的缺失可顯著降低APEC在雛鴨模型中的毒力[12]。Thao等通過血清殺傷試驗表明，arcA是嗜血桿菌抗血清和逃避補體的必要條件[13]。Gupta等發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌arcD的缺失增強了A549細胞和巨噬細胞的吞噬能力，且免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，該突變體還表現(xiàn)出莢膜受損，表明arcD不僅可能在抗吞噬中發(fā)揮作用，而且可能參與莢膜的形成[14]。陳健舜等構(gòu)建了李斯特菌10403的arcA、arcB、arcD缺失株，發(fā)現(xiàn)缺失株對Hela細胞的黏附和侵襲沒有影響，但是會降低小鼠的脾內(nèi)載菌數(shù)，使半數(shù)致死劑量（LD50）高于親本株，說明arcA、arcB和arcD與細菌毒力相關(guān)[15]。但食源性單核細胞增生李斯特菌lmoF2365_0032蛋白的功能未見相關(guān)報道。

本研究采用PCR方法從食源性單核細胞增生李斯特菌LM5567菌株中克隆了lmoF2365_0032基因，經(jīng)測序、拼接、分析比對得到，lmoF2365_0032基因的全長序列為811 bp。同源性比對分析顯示，LM5567菌株lmoF2365_0032基因的核苷酸序列與4b血清型菌株相似性較高，為99.8%，其次與1/2b血清型菌株相似性為99.7%，其編碼的氨基酸序列相似性為94.7%。LM5567菌株lmoF2365_0032蛋白的理化性質(zhì)分析顯示，該蛋白是一種偏堿性（等電點理論值為8.51）、穩(wěn)定（不穩(wěn)定指數(shù)為23.31<40.00，為穩(wěn)定性蛋白）、親水性蛋白質(zhì)。lmoF2365_0032蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示，該蛋白為跨膜蛋白，無信號肽區(qū)域，屬于非分泌蛋白;lmoF2365_0032蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，lmoF2365_0032蛋白的二級結(jié)構(gòu)包含15.53%的α-螺旋（含32個氨基酸），37.86%的無規(guī)則卷曲（含78個氨基酸），36.89%的延伸鏈結(jié)構(gòu)（含76個氨基酸）和9.71%的β-轉(zhuǎn)角（含20個氨基酸），其中以無規(guī)則卷曲和延伸鏈結(jié)構(gòu)為主;lmoF2365_0032蛋白具有高度親水性，由此推斷該蛋白與抗酸應(yīng)激有關(guān)。

本研究首次克隆了lmoF2365_0032基因，并利用生物學(xué)軟件對其結(jié)構(gòu)和功能進行預(yù)測，為今后研究該蛋白與LM5567菌株致病作用的關(guān)系提供了理論基礎(chǔ)。

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