干擾素對(duì)ET和PV的JAK2V617F基因突變負(fù)荷和IL-8的表達(dá)的影響

黃繼賢 潘成云 廖建軍 謝治軍 肖捷 肖健

【摘要】 目的 探討干擾素治療原發(fā)性血小板增多癥（ET）和真性紅細(xì)胞增多癥（PV）患者的效果及對(duì)JAK2V617F基因突變負(fù)荷和白細(xì)胞介素-8（IL-8）表達(dá)的影響。方法 30例JAK2V617F基因突變陽(yáng)性ET患者（19例）和PV患者（11例）， 采用干擾素α-2b治療。觀察治療6個(gè)月后的臨床指標(biāo)， 比較治療前后JAK2V617F基因突變負(fù)荷和IL-8的表達(dá)水平變化情況， 統(tǒng)計(jì)治療后血液學(xué)療效。結(jié)果 干擾素治療6個(gè)月后， ET+PV患者的血液學(xué)總緩解率達(dá)86.67%， 其中完全血液學(xué)緩解（CHR）和部分血液學(xué)緩解（PHR）分別為70.00%和16.67%。ET和PV患者的血液學(xué)總緩解率、CHR、PHR分別為100.00%和63.64%、78.95%和54.55%、21.05%和9.09%。ET+PV、ET、PV患者干擾素治療6個(gè)月后JAK2V617F基因突變負(fù)荷分別為（28.25±12.99）、（25.84±10.72）、（32.42±15.87）%， 均低于治療前的（44.50±23.90）、（34.48±15.02）、（67.00±19.26）%， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。ET+PV、ET、PV患者干擾素治療6個(gè)月后IL-8表達(dá)水平與治療前比較， 差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 干擾素治療ET和PV患者6個(gè)月， 能明顯降低JAK2V617F基因突變負(fù)荷， 使大部分患者達(dá)到血液學(xué)緩解， 但并未能明顯降低IL-8水平。

【關(guān)鍵詞】 干擾素;原發(fā)性血小板增多癥;真性紅細(xì)胞增多癥;JAK2V617F基因突變;白細(xì)胞介素-8

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.24.001

【Abstract】 Objective? ?To discuss the effect of interferon on essential thrombocythemia （ET）? and polycythemia vera （PV） as well as its effect on the JAK2V617F gene mutation load and expression of interleukin 8 （IL-8）. Methods? ?30 patients with JAK2V617F gene mutation positive ET （19 cases） and PV （11 cases） were treated with interferon α-2b. The clinical indicators of 6 months after treatment were observed. JAK2V617F gene mutation load and IL-8 expression level changes before and after treatment was compared， and the hematological efficacy was analyzed. Results? ?After 6 months of interferon treatment， the total hematological remission rate of ET + PV patients was 86.67%， in which complete hematological remission （CHR） and partial hematological remission （PHR） were 70.00% and 16.67% respectively. The total remission rate， CHR and PHR of ET and PV patients were 100.00% and 63.64%， 78.95% and 54.55%， 21.05% and 9.09% respectively. After 6 months of interferon treatment， JAK2V617F gene mutation load of ET+PV， ET and PV patients were （28.25±12.99）， （25.84±10.72） and （32.42 ± 15.87）% respectively， which was lower than that before treatment （44.50±23.90）， （34.48±15.02） and （67.00±19.26%）， and the difference was statistically significant （P<0.05）. After 6 months of interferon treatment， IL-8 level of ET+PV， ET and PV patients had no statistically significant difference compared with that before treatment （P>0.05）. Conclusion? ?6 months?of interferon treatment in ET and PV patients can significantly reduce the JAK2 V617F gene mutation load to hematologic response in most patients; however， it does not significantly reduce the level of IL-8.

【Key words】 Interferon; Essential thrombocythemia; Polycythemia vera; JAK2V617F gene mutation; Interleukin-8

Ph染色體陰性的骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative?neoplasms， MPN）也常被稱(chēng)為經(jīng)典型MPN， 以驅(qū)動(dòng)基因激活JAK/STAT通路導(dǎo)致骨髓細(xì)胞持續(xù)克隆增殖， 且伴有多種細(xì)胞因子異常為特征的一組異質(zhì)性造血干細(xì)胞疾病[1， 2]， 包括原發(fā)性ET、PV和原發(fā)性骨髓纖維化（PMF）。雖然羥基脲和干擾素作為治療MPN的常用藥物在臨床工作中已使用多年， 且迄今為止沒(méi)有令人信服的證據(jù)證明羥基脲致白血病作用[3]， 但是一項(xiàng)中位隨訪達(dá)16.3年的隨機(jī)研究顯示[4]， 羥基脲治療患者20年累計(jì)白血病發(fā)生率達(dá)22%。干擾素雖然需要反復(fù)皮下注射， 不如口服羥基脲方便使用， 但仍然有不少患者因其未致白血病效應(yīng)而選用。為探討MPN患者干擾素治療前后IL-8和驅(qū)動(dòng)基因負(fù)荷的變化情況， 本文總結(jié)和分析了近4年以來(lái)本院使用干擾素治療MPN的情況， 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2016年10月～2019年8月就診于本院接受干擾素治療的30例JAK2V617F基因突變陽(yáng)性的ET患者（19例）和PV患者（11例）。診斷均符合2016年WHO公布的MPN診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1. 2 方法 對(duì)所有患者進(jìn)行干擾素治療， 方法為：干擾素α-2b皮下注射， 每隔1日1次， 300 μg/次， 達(dá)到CHR后， 在維持治療過(guò)程中如能持續(xù)緩解， 則干擾素則減量為1～2次/周， 300 μg/次。ET患者早期治療均加用羥基脲0.5～1.0 g/d， 待達(dá)到CHR后逐漸減量和停用。而PV患者， 治療過(guò)程中使用血細(xì)胞分離機(jī)祛除紅細(xì)胞， 使紅細(xì)胞壓積（HCT）低于45%（男性）或42%（女性）。整個(gè)治療過(guò)程中， 所有ET和PV患者如果無(wú)阿司匹林禁忌證， 則同時(shí)口服阿司匹林腸溶片， 100 mg/d。治療6個(gè)月。

1. 3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)

1. 3. 1 觀察患者臨床特征 包括性別、年齡、白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板、脾大、JAK2V617F基因突變負(fù)荷。

1. 3. 2 檢測(cè)JAK2V617F基因突變負(fù)荷[6] 留取標(biāo)本檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)為初診時(shí)、干擾素治療后6個(gè)月。方法如下：留取外周血或骨髓標(biāo)本提取DNA后， 通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）采用TaqMan探針?lè)z測(cè)JAK2野生型基因和JAK2V617F基因突變的表達(dá)水平。JAK2V617F基因突變負(fù)荷的計(jì)算方法為：JAK2V617F基因突變負(fù)荷=JAK2V617F突變拷貝數(shù)/（JAK2V617F突變拷貝數(shù)+JAK2V617F野生型拷貝數(shù)）。

1. 3. 3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)IL-8 留取標(biāo)本檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)為初診時(shí)、干擾素治療后6個(gè)月。方法如下[7]：留取患者外周血血清標(biāo)本后， 酶標(biāo)板設(shè)置待測(cè)樣品孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和空白顯色孔， 先后加IL-8抗體、親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物、顯色液和終止液反應(yīng)， 酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光密度（OD）值， 與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)， 計(jì)算每孔IL-8的濃度。

1. 3. 4 比較干擾素治療后血液學(xué)療效 療效判定標(biāo)準(zhǔn)：①PV的療效判定標(biāo)準(zhǔn)[8]：CHR的定義為在無(wú)放血治療的情況下男性HCT<45%， 女性HCT<42%;不伴脾大， 白細(xì)胞（WBC）<10×109/L， 血小板（PLT）<400×109/L。PHR的定義為男性HCT<45%， 女性HCT<42%;伴脾大， 或 PLT>400×109/L， 或放血頻率減少50%以上。②ET的療效判定標(biāo)準(zhǔn)[9]：CHR的定義為在未合用羥基脲和阿那格雷治療的情況下， PLT≤400×109/L且無(wú)血栓和出血事件。PHR的定義為 PLT下降50%以上， 但仍>400×109/L， 且無(wú)血栓和出血事件。

1. 3. 5 觀察干擾素治療后不良事件發(fā)生情況。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn);不服從正態(tài)分布的計(jì)量資料以[M（P25， P75）]表示， 采用秩和檢驗(yàn);P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GraphPad Prism 7.0繪制柱狀圖。

2 結(jié)果

2. 1 30例患者臨床特征 30例JAK2V617F基因突變陽(yáng)性的ET和PV患者接受干擾素α-2b治療6個(gè)月以上， 男性12例， 女性18例。其中ET患者19例（男9例， 女10例）， PV患者11例（男3例， 女8例）。見(jiàn)表1。

2. 2 治療6個(gè)月后血液學(xué)療效比較 干擾素治療6個(gè)月后， ET+PV患者的血液學(xué)總緩解率為86.67%（26/30）， 其中70.00%（21/30）達(dá)CHR， 16.67%（5/30）達(dá)PHR。ET患者的血液學(xué)總緩解率為100.00%（19/19）， 其中78.95%（15/19）達(dá)CHR， 21.05%（4/19）達(dá)PHR;而PV患者的血液學(xué)總緩解率為63.64%（7/11）， 其中54.55%（6/11）達(dá)CHR， 9.09%（1/11）達(dá)PHR。見(jiàn)圖1。

2. 3 治療前后JAK2V617F基因突變負(fù)荷變化比較

ET+PV、ET、PV患者干擾素治療6個(gè)月后JAK2V617F基因突變負(fù)荷分別為（28.25±12.99）%、（25.84±10.72）%、（32.42±15.87）%， 均低于治療前的（44.50±23.90）%、（34.48±15.02）%、（67.00±19.26%）， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2. 4 治療前后IL-8的表達(dá)水平比較 ET+PV、ET、PV患者干擾素治療6個(gè)月后IL-8表達(dá)水平與治療前比較， 差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3。

2. 5 干擾素治療后不良事件發(fā)生情況 本研究接受干擾素治療的患者， 出現(xiàn)的不良事件均為1～2級(jí)， 無(wú)3～4級(jí)不良事件。首次使用干擾素后出現(xiàn)22例以畏寒、發(fā)熱、骨痛為主要臨床表現(xiàn)的流感樣癥狀， 均出現(xiàn)于治療早期;第2～4次后癥狀明顯減輕和消失。此外， 3例出現(xiàn)脫發(fā)， 1例出現(xiàn)食欲減退。

3 討論

驅(qū)動(dòng)基因突變和細(xì)胞因子異常與Ph染色體陰性MPN的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。表型驅(qū)動(dòng)基因突變致使細(xì)胞信號(hào)通路（JAK-STAT）的激活， 繼而導(dǎo)致骨髓造血干細(xì)胞的過(guò)度增殖， 是MPN發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵[10， 11]。此外， 有研究發(fā)現(xiàn)， MPN患者中IL-8、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）等眾多細(xì)胞因子表達(dá)水平較健康人群存在明顯差異[12]， 與發(fā)病機(jī)制有關(guān)， 且可能是潛在的治療靶點(diǎn)[13]。因此， 減少和消除驅(qū)動(dòng)基因突變負(fù)荷和異常細(xì)胞因子成為探討治療MPN的重要研究方向。

MPN的表型驅(qū)動(dòng)基因包括JAK2、CALR、MPL。JAK2基因突變中以JAK2V617F基因突變最常見(jiàn)。且JAK2V617F突變也是MPN中最常見(jiàn)的驅(qū)動(dòng)基因突變， 其在PV、ET和PMF中的檢出率分別為95%、50%～75%和40%～75%[11]。通過(guò)治療減少M(fèi)PN驅(qū)動(dòng)基因突變負(fù)荷， 是目前一種有效且可行的方法。MPN的驅(qū)動(dòng)基因與疾病的臨床表型和預(yù)后有關(guān)[14]。有研究認(rèn)為， 較重的JAK2V617F基因突變的腫瘤負(fù)荷可能與MPN進(jìn)展為MF有關(guān)[14， 15]。長(zhǎng)效干擾素可降低JAK2V617F和CALR基因突變的基因負(fù)荷[16， 17]， 并達(dá)到持續(xù)的CHR[3， 18]。

國(guó)內(nèi)外研究顯示， 長(zhǎng)效干擾素治療MPN的療效確切， 但結(jié)果差異較大。Masarova等[19]對(duì)40例ET（19例JAK2V617F基因突變陽(yáng)性）和43例PV（41例為JAK2V617F基因突變陽(yáng)性）患者使用長(zhǎng)效干擾素（PEG-IFN-α-2a）治療， 中位隨訪83個(gè)月， 血液學(xué)總緩解率為80%， 中位血液學(xué)緩解時(shí)間為66個(gè)月。該研究中有63%的患者在長(zhǎng)效干擾素治療后JAK2V617F基因突變負(fù)荷下降， 均表現(xiàn)為開(kāi)始治療后迅速下降， ET和PV患者分別在治療后1年和2年達(dá)到平臺(tái)期?；颊吣芊襁_(dá)到血液學(xué)緩解和達(dá)到緩解時(shí)間與年齡、性別、基線臨床特征、脾腫大、驅(qū)動(dòng)基因類(lèi)型及JAK2V617F基因突變負(fù)荷無(wú)關(guān)。Kiladjian等[8]對(duì)37例PV（29例JAK2V617F基因突變陽(yáng)性）患者使用長(zhǎng)效干擾素（PEG-IFN-α-2a）治療12個(gè)月后全部達(dá)到血液學(xué)緩解， 其中35例（94.6%）為CHR， 2例（5.4%）為PHR。龐纓等[20]對(duì)73例MPN患者（ET 46例， PV27例）使用干擾素α治療， 治療12個(gè)月后ET和PV患者的血液學(xué)總緩解率分別為65.1%和85.1%， CHR分別為25.9%和59.3%， PHR分別為39.1%和26.1%。該研究未進(jìn)行JAK2V617F基因突變負(fù)荷檢測(cè)， 但定性檢查發(fā)現(xiàn)， 干擾素α治療1～3年的患者， ET和患者JAK2V617F基因突變的轉(zhuǎn)陰率分別為41%和56%。本研究發(fā)現(xiàn)， ET+PV、ET和PV患者使用干擾素治療6個(gè)月后， 血液學(xué)總緩解率分別為86.67%、100%和63.64%， 其中CHR分別為70.00%、78.95%和54.55%， PHR分別為16.67%、21.05%和9.09%， 且發(fā)現(xiàn)ET和PV患者的JAK2V617F基因突變負(fù)荷較治療前明顯下降， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

能否減少和消除MPN患者的異常細(xì)胞因子， 一直是學(xué)界探討的話題之一。Tefferi等[21]對(duì)127例PMF患者的外周血檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)， IL-8、白介素介素-6（IL-6）、INF-α等19種細(xì)胞因子明顯高于正常人， 升高的IL-8與體質(zhì)癥狀和生存時(shí)間縮短相關(guān)， 并可預(yù)測(cè)無(wú)白血病進(jìn)展的生存率。Vaidya等[22]對(duì) 65例PV患者檢測(cè)外周血后發(fā)現(xiàn)IL-8、IL-6、IFN-γ等16種細(xì)胞因子較正常人異常升高。本文前期研究[7]對(duì)123例MPN患者（ET 63例、PV 28例、PMF 33例）檢測(cè)外周血后也發(fā)現(xiàn)IL-8明顯較正常人明顯升高。PMF的發(fā)病假說(shuō)[23]認(rèn)為， 大量異常因子存在的炎性環(huán)境， 促使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞并克隆增殖， 繼而導(dǎo)致MPN的發(fā)生和進(jìn)展。因此， 改善MPN患者在異常的炎性環(huán)境日益受到血液學(xué)界的重視。蘆可替尼能降低JAK2V617F基因突變負(fù)荷和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6等細(xì)胞因子的發(fā)現(xiàn)[24]， 使作者猜想干擾素是否能有類(lèi)似的作用。在本研究中， 雖然ET+PV患者經(jīng)干擾素治療6個(gè)月后， IL-8表達(dá)水平低于治療前， 但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 仍未能提示干擾素能明顯減低IL-8的表達(dá)。IL-8與干擾素治療時(shí)間相對(duì)較短， 還是IL-8與干擾素治療無(wú)相關(guān)性， 仍需進(jìn)一步研究探討。

綜上所述， 干擾素治療ET和PV患者6個(gè)月， 能明顯降低JAK2V617F基因突變負(fù)荷， 使大部分患者達(dá)到血液學(xué)緩解， 但并未能明顯降低IL-8水平。

參考文獻(xiàn)

[1] Odenike O. How I treat the blast phase of Philadelphia chromosome-negative myeloproliferative neoplasms. Blood， 2018， 132（22）：2339-2350.

[2] Lussana F， Rambaldi A. Inflammation and myeloproliferative neoplasms. J Autoimmun， 2017（85）：58-63.

[3] Kiladjian JJ. Long-term treatment with interferon alfa for myeloproliferative neoplasms. Lancet Haematol， 2017， 4（4）：e150-e151.

[4] Kiladjian J J， Chevret S， Dosquet C， et al. Treatment of polycythemia vera with hydroxyurea and pipobroman： final results of a? randomized trial initiated in 1980. Journal of Clinical Oncology， 2011， 29（29）：3907-3913.

[5] Arber DA， Orazi A， Hasserjian R， et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood， 2016， 127（20）：2391-2405.

[6] 孫聰聰. 骨髓增殖性腫瘤中JAK2V617F突變及Il-6、TNF-α、Il-32、Il-37的定量測(cè)定及相關(guān)性研究. 山東大學(xué)， 2015.

[7] 黃繼賢. MPNs分子遺傳學(xué)與免疫特征及蘆可替尼改善骨纖機(jī)制的探討. 南方醫(yī)科大學(xué)， 2019.

[8] Kiladjian JJ， Cassinat B， Chevret S， et al. Pegylated interferon-alfa-2a induces complete hematologic and molecular responses with low toxicity in polycythemia vera. Blood， 2008， 112（8）：3065-3072.

[9] Quintas-Cardama A， Kantarjian H， Manshouri T， et al. Pegylated interferon alfa-2a yields high rates of hematologic and molecular response in patients with advanced essential thrombocythemia and polycythemia vera. Journal of clinical oncology ： official journal of the American Society of Clinical Oncology， 2009， 27（32）：5418-5424.

[10] Marneth AE， Mullally A. The Molecular Genetics of Myeloproliferative Neoplasms. Cold Spring Harbor Perspectlves in? Medicine， 2020， 10（2）：34876.

[11] Ferreira CS， Polo B， Lacerda JF. Somatic Mutations in Philadelphia Chromosome-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Semin in Hematology， 2018， 55（4）：215-222.

[12] Mondet J， Hussein K， Mossuz P. Circulating Cytokine Levels as Markers of Inflammation in Philadelphia Negative? Myeloproliferative Neoplasms： Diagnostic and Prognostic Interest. Mediators of Inflammation， 2015（1）：1-10.

[13] Luque LFM， Blackmon AL， Ramanathan G， et al. Key Role of Inflammation in Myeloproliferative Neoplasms： Instigator of Disease? Initiation， Progression. and Symptoms. Curr Hematol Malig Rep， 2019， 14（3）：145-153.

[14] Grinfeld J， Nangalia J， Baxter EJ， et al. Classification and Personalized Prognosis in Myeloproliferative Neoplasms. New England Journal of Medicine， 2018， 379（15）：1416-1430.

[15] Passamonti F， Rumi E， Pietra D， et al. A prospective study of 338 patients with polycythemia vera： the impact of JAK2? （V617F） allele burden and leukocytosis on fibrotic or leukemic disease? transformation and vascular complications. Leukemia， 2010， 24（9）：1574-1579.

[16] Verger E， Cassinat B， Chauveau A， et al. Clinical and molecular response to interferon-α therapy in essential thrombocythemia? patients with CALR mutations. Blood， 2015， 126（24）：2585-2591.

[17] Tashi T， Swierczek S， Kim SJ， et al. Pegylated interferon Alfa-2a and hydroxyurea in polycythemia vera and essential? thrombocythemia： differential cellular and molecular responses. Leukemia： Official journal of the Leukemia Society of America， Leukemia Research Fund， U. K， 2018， 32（8）：1830-1833.

[18] Desterro J， Mclornan DP， Curto GN， et al. Essential thrombocythaemia treated with recombinant interferon： 'real world' United Kingdom referral centre experience. British Journal of Haematology， 2019， 186（4）：561-564.

[19] Masarova L， Patel KP， Newberry KJ， et al. Pegylated interferon alfa-2a in patients with essential thrombocythaemia or polycythaemia vera： a post-hoc， median 83 month follow-up of an open-label， phase 2 trial. Lancet Haematol， 2017， 4（4）：e165-e175.

[20] 龐纓， 蔡曉東， 劉凌， 等. 干擾素-α對(duì)骨髓增殖性腫瘤JAK2V617F基因表達(dá)的影響. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版）， 2011， 32（3）：316-320.

[21] Tefferi A， Vaidya R， Caramazza D， et al. Circulating interleukin （IL）-8， IL-2R， IL-12， and IL-15 levels are independently? prognostic in primary myelofibrosis： a comprehensive cytokine profiling study. Journal of Clinical Oncology， 2011， 29（10）：1356-1363.

[22] Vaidya R， Gangat N， Jimma T， et al. Plasma cytokines in polycythemia vera： phenotypic correlates， prognostic relevance， and comparison with myelofibrosis. American Journal of Hematology， 2012， 87（11）：1003-1005.

[23] Desterke C， Martinaud C， Ruzehaji N， et al. Inflammation as a Keystone of Bone Marrow Stroma Alterations in Primary? Myelofibrosis. Mediators of Inflammation， 2015（2）：1-6.

[24] Verstovsek S， Mesa RA， Gotlib J， et al. A double-blind， placebo-controlled trial of ruxolitinib for myelofibrosis. N Engl J Med， 2012， 366（9）：799-807.

[收稿日期：2020-05-22]