Hela細(xì)胞裸鼠模型中腎臟VEGF的表達(dá)

郭麗娜，馮法銘，韓禹婷，張紹廣，王家敏，喬自林，楊 琨*

（1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)簡稱VEGF，是具有高度特異性的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的因子，有增強(qiáng)血管通透性、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移增殖、增加細(xì)胞外基質(zhì)變形和血管形成等作用。VEGF家族成員以結(jié)合抗體的方式來激活血管生成信號通路，調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移增殖、分化的相關(guān)生理正常和生理異常微環(huán)境。有三個主要促進(jìn)血管生成的過程即血管發(fā)生、血管生成、動脈生成。VEGF對腫瘤血管結(jié)構(gòu)的生成、維持和改建具有重要意義，為腫瘤細(xì)胞在生長微環(huán)境中增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移提供有利條件[1]。與腫瘤的生長轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系。

科學(xué)研究表明，造成惡性腫瘤患者死亡的主要原因是腫瘤轉(zhuǎn)移。一項(xiàng)研究表明，大約90%的癌癥死亡是由轉(zhuǎn)移形成引起的[2]。惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過程包括從惡性腫瘤原發(fā)部位脫離侵入周圍的基質(zhì)，進(jìn)入淋巴管、體腔或血管，黏附在內(nèi)皮細(xì)胞壁并遷徙到其他部位繼續(xù)生長，導(dǎo)致血管增生并形成與原發(fā)部位同樣類型的腫瘤。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中新血管的形成是腫瘤生長轉(zhuǎn)移和傳播的一種基本活動。

腎臟組織中，血管內(nèi)皮生長因子主要由腎小管上皮細(xì)胞和腎小球足細(xì)胞產(chǎn)生，在抗間質(zhì)纖維化，保證腎小管周圍毛細(xì)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)定，以及腎小球?yàn)V過膜結(jié)構(gòu)完整等方面起到了非常重要的調(diào)控作用[3]。血行轉(zhuǎn)移在腫瘤轉(zhuǎn)移中占重要地位，腎臟作為泌尿器官，以腎小球毛細(xì)血管球過濾血液的形式生成尿液，此時血液中腫瘤特異性生長因子通過腎小球過濾作用可能留在腎臟中，進(jìn)而形成轉(zhuǎn)移灶。

本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化染色方法定位分析血管內(nèi)皮生長因子在腎臟中的表達(dá)來反應(yīng)腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，研究VEGF在Hela細(xì)胞注射裸鼠腎臟中的表達(dá)分布情況，為進(jìn)一步揭示VEGF蛋白在裸鼠成瘤過程中的調(diào)節(jié)機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)動物用到免疫功能缺陷裸鼠：10只，4周齡雌性（BALB/c裸鼠，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司）。

1.2 試劑與儀器

購于國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺的Hela細(xì)胞懸液；購于北京索萊寶科技有限公司的免疫組織化學(xué)檢測試劑盒（SP-0023）和DBA濃縮型顯色試劑盒，試驗(yàn)所用一抗（兔VEGF多克隆抗體）及二抗（山羊抗兔）均購自北京博奧森技術(shù)有限公司。主要儀器有病理組織切片機(jī)、溫箱、組織攤烤片機(jī)、顯微鏡照相系統(tǒng)等。

1.3 免疫功能缺陷裸鼠異種移植Hela細(xì)胞動物模型的建立

Hela細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)150代，建立并儲存于低溫保存介質(zhì)中。通過皮下注射免疫缺陷裸鼠（BALB/c裸鼠）建立10只動物模型。裸鼠初始體重為16～19 g，接種數(shù)10只，皮下接種200 ml Hela細(xì)胞懸液，相當(dāng)于1.0×107/ml活細(xì)胞，飼養(yǎng)時間60 d。

1.4 組織采集與固定

10只試驗(yàn)裸鼠均成瘤，瘤體直徑超過1cm或者滿60 d即處死，并迅速進(jìn)行病理解剖，收取瘤體，腎臟等組織器官樣本，及時放于4%多聚甲醛中固定12 h后更換固定液存放。

1.5 HE染色

組織固定好后，修割成1 cm3的小塊，進(jìn)行包埋。使用病理組織切片機(jī)對包埋好后的石蠟塊進(jìn)行切片，粗切厚度為20μm，細(xì)切厚度為5μm。將切好的組織于組織攤烤片機(jī)中展片，展片后用60℃烤片，烤至組織周圍石蠟融化即可進(jìn)行染色，包括脫蠟、染色、脫水透明一系列步驟，最后使用中性樹脂進(jìn)行封片。

1.6 免疫組化SP染色

石蠟切片（5 μm）烤片后脫蠟至水，蒸餾水和PBS（磷酸緩沖鹽溶液）分別浸泡5 min；經(jīng)抗原修復(fù)（檸檬酸鹽緩沖液-微波熱修復(fù)法）、阻斷、封閉后滴加一抗工作液孵育（37℃濕盒中）；隨后二抗（B液）、三抗（C液）反應(yīng)后，滴加DAB顯色液，在顯微鏡下觀察至顯色明顯立刻沖水停止反應(yīng)；接著用蘇木精復(fù)染、鹽酸酒精分化、自來水沖洗反藍(lán)、脫水、透明、封片即可。其中，阻斷用液、封閉用液、二抗和三抗工作液來自免疫組化SP試劑盒；一抗來自兔GnRH多克隆抗體（工作濃度1：400）。

2 結(jié)果

2.1 Hela細(xì)胞接種裸鼠腎臟組織學(xué)觀察

由圖1A所示，在HE染色100倍的視野下腫瘤裸鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)完整，為腎臟被膜和實(shí)質(zhì)的皮質(zhì)部分。毛細(xì)血管充血。圖1B所示為HE染色200倍，可見視野中腎小體內(nèi)含有大量血細(xì)胞，靜脈管中充盈著大量血液，腎小管管腔狹窄，呈淀粉樣變性且出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。于腎間質(zhì)中發(fā)現(xiàn)少量地從骨髓發(fā)育而來的B淋巴細(xì)胞，可能與腫瘤的生長、移植有關(guān)。

圖1 A和B為Hela細(xì)胞接種裸鼠腎臟組織HE染色圖片

2.2 Hela細(xì)胞接種裸鼠腎臟VEGF蛋白表達(dá)

由圖2C所示，免疫組化染色中所加兔VEGF多克隆抗體與腫瘤裸鼠腎臟中VEGF抗原結(jié)合呈棕黃色陽性反應(yīng)，在腎臟皮質(zhì)中VEGF蛋白主要于腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)，腎小體中弱表達(dá)。圖D同部位200倍視野下可見腎小管管腔變窄，出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。

圖2 C和D為Hela細(xì)胞接種裸鼠腎臟組織VEGF蛋白免疫組化染色

3 討論

本研究得出，HE染色下腫瘤裸鼠腎臟出現(xiàn)毛細(xì)血管充血，腎小管管腔狹窄、自溶及淀粉樣變性，病理變化可能與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移有關(guān)。免疫組化染色中，VEGF在Hela細(xì)胞腫瘤裸鼠模型腎臟的腎小管上皮細(xì)胞和腎小體中毛細(xì)血管球中均呈陽性表達(dá)，但在腎小管上皮細(xì)胞中呈強(qiáng)表達(dá)，腎小體毛細(xì)血管球次之。這是因?yàn)閂EGF是腎臟血管形成的主要調(diào)節(jié)因子，并在腎小管上皮細(xì)胞和腎小球足細(xì)胞中廣泛表達(dá)[4]，但足細(xì)胞數(shù)量少于腎小管上皮細(xì)胞數(shù)量，因此視覺上腎小管上皮細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)量強(qiáng)于腎小囊毛細(xì)血管球的血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)量。

研究表明，在動物生理異?；蛘顟B(tài)下，血管通透性增加主要依賴于VEGF通過旁分泌方式來促進(jìn)，將刺激因素對內(nèi)皮細(xì)胞的刺激作用擴(kuò)大，血漿蛋白的外滲得到促進(jìn)，新生血管的臨時基質(zhì)在此時形成，為新血管生成創(chuàng)造條件。在腫瘤中，VEGF及其受體高度表達(dá)。通過引起一系列信號傳導(dǎo)來刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，多種腫瘤血管新生的起始和延續(xù)中均有VEGF參與，以促進(jìn)新血管和腫瘤的生長，與腫瘤新生血管的形成數(shù)目息息相關(guān)[5]。

VEGF家族的機(jī)制復(fù)雜，在體內(nèi)的作用多種多樣，VEGF生物學(xué)功能活性包括：一是增加血管通透性：VEGF在引起血管通透性增加的物質(zhì)中是作用最強(qiáng)烈的，血管通透性的增加為腫瘤細(xì)胞的生長以及新血管生成所需營養(yǎng)物質(zhì)和血管支持物創(chuàng)造了有利的條件；二是刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、重建和增殖；三是抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡；四是促進(jìn)形成血管外臨時基質(zhì)。因其在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移過程中具有重要意義可以作為早期腫瘤檢測指標(biāo)之一。目前用于治療腫瘤的靶向藥物包含VEGF信號通路抑制劑，如可溶性VEGF-C、VEGFR-3和VEGF-3的中和抗體[1]。雖然VEGF信號通路抑制劑治療腫瘤取得良好效果，但VEGF的上游基因是否調(diào)節(jié)和控制VEGF的表達(dá)，以及腫瘤淋巴管、血管生成是否有VEGF對其下游基因表達(dá)影響的原因仍不完全清楚，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。